實(shí)用高效液相色譜法的建立糾錯版 第6章 中性樣品：反相與正相hplc

1、第6章 中性樣品：反相與正相HPLC6-1引言如1-4節(jié)中所論述，HPLC方法建立的最佳途徑由樣品的性質(zhì)決定。本書中所推薦的HPLC方法建立策略按一般樣品或特殊樣品進(jìn)行分類，見圖1-3。一般樣品又分為中性樣品和離子樣品，離子樣品包括含有一種或多種離子的或可電離的化合物（如酸、堿、有機(jī)鹽）。本章討論僅含有不可電離化合物的中性樣品。而離子化合物的HPLC方法建立將在第7章中討論；不過這里所討論的許多中性化合物的分離方法也同樣適用于離子樣品。對于同時含有中性和離子樣品的HPLC方法建立在第9章中討論。第一部分 反相色譜反相色譜（RPC）是分離大多數(shù)常規(guī)樣品的首選分離模式，該模式的普適性一般比其它液相

2、色譜模式更好，更方便，獲得令人滿意的最佳分離效果的可能性更大。RPC色譜柱柱效高、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好（見5-3節(jié)）。所采用溶劑的性質(zhì)決定了這種模式往往更易于檢測（尤其是UV檢測器），因此大多數(shù)色譜工作者采用RPC分離模式多于其它HPLC模式。盡管許多有機(jī)化合物在（水溶液）流動相中溶解度有限，但由于RPC的進(jìn)樣量很少（納克或微克）（見2-4節(jié)），實(shí)際上并不會影響其應(yīng)用。當(dāng)樣品在RPC流動相中溶解度太小時，正相色譜（NPC）則是較好的選擇。同樣，那些在水溶液中不穩(wěn)定的樣品也可用非水溶劑以NPC 模式進(jìn)行分離。有些樣品用RPC分離較困難，必須采用其它模式進(jìn)行分離。含下述化合物之一的樣品為特殊樣品（見圖1

3、-3）：強(qiáng)親水或強(qiáng)疏水化合物、非手性異構(gòu)體、手性異構(gòu)體（即對映體，見第12章）、生物大分子（見第11章）。無機(jī)離子或合成聚合物也很“特殊”，但本書中不作討論。強(qiáng)疏水樣品由于在RPC中被強(qiáng)保留，可能需采用非水條件（非水反相色譜或NARP，見6-5節(jié)），正相色譜（NPC）也可進(jìn)行這類分離（見本章第二部分）。強(qiáng)疏水的生物大分子則可采用疏水作用色譜（HIC）分離，將在第11章中討論。強(qiáng)親水樣品在RPC中往往保留不足，親水離子樣品的分離祥見第7章的討論。由于中性親水化合物在NPC柱上保留很強(qiáng)，用NPC分離很好（見6-6與6-7節(jié)）。某些親水化合物也可以采用親水作用色譜（HILIC）進(jìn)行分離（詳見6-6-

4、5節(jié)與第11章的討論）。非手性異構(gòu)體（包括立體異構(gòu)體、非對應(yīng)異構(gòu)體、位置異構(gòu)體等）可以采用某些RPC條件分離。但異構(gòu)體混合物通常采用NPC（見6-7節(jié)）或以環(huán)糊精鍵合固定相的RPC（見6-3-3節(jié)）進(jìn)行分離，手性對映體的分離須用特殊條件，詳見第12章的討論。6-2反相色譜的保留RPC的保留機(jī)理如圖6-1所示。RPC分離類似于從水中萃取不同化合物至有機(jī)溶劑（如辛醇），疏水（非極性）化合物更易于萃取至非極性的辛醇相中。色譜柱（一般用C8 或C18鍵合相修飾的硅膠擔(dān)體）的極性弱于（水-有機(jī)）流動相。樣品分子在極性流動相和非極性固定相間進(jìn)行分配，疏水強(qiáng)的（非極性）化合物保留較強(qiáng)。因此，對于一定組成的流

5、動相，樣品依其疏水性，保留值不同，所得色譜圖如圖6-1所示。親水（極性）組分保留較弱，先從柱上流出；疏水（非極性）組分后流出；中等極性組分居中流出?；衔锏腞PC保留值由其極性和實(shí)驗(yàn)條件（包括流動相、色譜柱和柱溫）決定。如表6-1所示，有數(shù)種方式可改變RPC中大多數(shù)組分的保留值。雖然仍不清楚反相保留的詳細(xì)機(jī)理，但保留值可以通過分配過程近似估算出。不考慮保留機(jī)理，人們對改變實(shí)驗(yàn)條件（流動相、色譜柱、柱溫）產(chǎn)生的影響已作了深入的研究，因此可以系統(tǒng)地研究RPC的方法建立（如本章和第9章所述）。圖6-1非離子樣品的反相分離過程示意圖黑點(diǎn)表示在極性流動相和非極性固定相間分配的樣品分子6-2-1流動相的影

6、響通過改變流動相組成或溶劑強(qiáng)度調(diào)整保留值（k值）較好。在RPC中，采用弱極性的強(qiáng)流動相相對溶質(zhì)保留值較小。溶劑的極性可由極性指數(shù)P表示（見附錄中表-2）。溶劑強(qiáng)度取決于所選用的有機(jī)溶劑和其在流動相中的濃度：%B，一般A代表水，B代表有機(jī)溶劑，%為體積百分比。方法建立的初始目的是使所有樣品化合物有適宜的保留值。如第2章所述，用等度條件分離樣品時，容許的保留值范圍為0.5<k<20，不過1<k<10一般更好。表6-1 RPC中改變保留值的方法減小保留增大保留提高柱極性（氰基、C4）降低柱極性（C8、C18）降低流動相極性（提高%B-增加有機(jī)溶劑）（減少極性有機(jī)溶劑）提高流動

7、相極性（降低%B-增加水）（增加極性有機(jī)溶劑）提高溫度降低溫度6-2-1-1 %B的選擇 方法建立的有效步驟是先以極強(qiáng)的流動相開始試驗(yàn)（如圖6-2中的100%A CN）。使用強(qiáng)流動相有可能使首次的運(yùn)行時間很短，強(qiáng)保留化合物可全部流出。（注意：若采用100%A CN，在3040 min后仍不出峰，應(yīng)考慮采用其它辦法；見第9章）。用100%A CN時，全部組分接近于t0流出（k<0.2），所以需減弱流動相。當(dāng)A CN濃度以20%的步長遞減到80%和60%時，分離效果如圖6-2，但兩次運(yùn)行首峰（t0=1.0 min，k<0.5）的保留結(jié)果都不能令人滿意。50%和40%A CN（都可達(dá)到0

8、.5<k<20）均有足夠的保留。若流動相非常弱（<30%A CN），則化合物D的保留值會太長（k>20，如圖6-3中D線所示）。注意用50%與40% A CN時，4種化合物均已達(dá)到分離，40% A CN的分離度略好一些（化合物B與C的Rs=2.0），其代價(jià)是運(yùn)行時間更長。很多樣品可以采用溶劑強(qiáng)度調(diào)整保留值的辦法充分分離。圖6-3用圖6-2的保留數(shù)據(jù)，以log k對%B作圖得到。K=0.5和k=20的橫虛線規(guī)定了保留值可接受時的最小和最大%B值：30%56%B（豎虛線）。RPC保留值與%B依賴關(guān)系的研究已很詳盡。log k與%B之間基本呈線性關(guān)系（見圖6-3）：log k

9、= log kW-S （6-1）其中kW是僅以水為流動相（0%B）的理論k值，S對特定組分為常數(shù)，是有機(jī)溶劑在流動相中的體積分?jǐn)?shù)=（%B/100）。大多數(shù)小分子量（<500Da）化合物的S4。式6-1和S4的結(jié)果說明每減少10%的B相，k值約增大23倍，如圖6-2所示。例如當(dāng)流動相由40%B減少到30%B，化合物D的k值則由9增至23（見圖6-3）。3倍規(guī)則（每降低10%B，k值增加大約3倍）對于快速估算所有樣品組分的保留值均可接受時的最佳%B值非常有用。圖6-2改變有機(jī)溶劑濃度對樣品RPC分離的影響條件：15×0.46 cm C18柱，流速：1.5ml/min（t0=1.0

10、min）。通過系統(tǒng)地降低%B值（如圖6-2）來研究樣品保留值，對選擇特定樣品的最佳流動相組成是一種非常簡便的辦法。用梯度洗脫則是另一種更快捷的方案（見8-2-2節(jié)）。6-2-1-2流動相強(qiáng)度 RPC中的流動相強(qiáng)度由%B和有機(jī)溶劑種類共同決定。這些影響見圖6-4中三種常用RPC溶劑：乙腈（A CN），甲醇（MeOH）與四氫呋喃（THF）的溶劑強(qiáng)度計(jì)算圖。圖中的豎線對應(yīng)位置為具相同流動相強(qiáng)度（k值）的%B值。例如：40% A CN的k值和運(yùn)行時間應(yīng)與50% MeOH和30% THF相似。標(biāo)度略不同的流動相強(qiáng)度圖也有報(bào)道。這些不同的標(biāo)度圖非常相似，只能在樣品分離時作為粗略參考（準(zhǔn)確度±5%

11、B）。圖6-4在RPC方法建立中的應(yīng)用將在6-3-2和6-4-2-2節(jié)中作深入討論。圖6-3 圖6-2中樣品化合物保留值（log k）與流動相強(qiáng)度（%B）的關(guān)系圖圖6-4及其它文獻(xiàn)數(shù)據(jù)認(rèn)為RPC中溶劑強(qiáng)度順序?yàn)椋核ㄗ钊酰?lt;甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃（THF）<丙醇<二氯甲烷（最強(qiáng)）。可見溶劑強(qiáng)度隨著溶劑極性的降低而增加。附錄中收錄了一些常用溶劑的極性指數(shù)P。圖6-4反相HPLC的溶劑強(qiáng)度計(jì)算圖除了二氯甲烷與水不混溶外，上述溶劑都可在RPC與水共用。由于二氯甲烷很強(qiáng)，可用于清洗被強(qiáng)保留樣品組分污染的RPC柱（見5-4-3-2節(jié)）。乙腈（A CN）是流動相中有

12、機(jī)溶劑的最佳首選，A CN-水流動相可用于低波長（185210nm）UV檢測，這對于許多樣品是非常必要的（見3-2-2節(jié)）。另外，A CN-水流動相的黏度非常低，塔板數(shù)較高而柱壓較低（二者均為理想性質(zhì)）。有機(jī)溶劑的第二首選是甲醇（MeOH），再者則是四氫呋喃（THF）。這3種溶劑廣泛用于RPC中，控制選擇性與分離（見6-3-2節(jié)）。THF的缺點(diǎn)是：UV吸收高，遇氧會發(fā)生反應(yīng)，更換流動相后色譜柱平衡較慢等。但據(jù)報(bào)道THF有獨(dú)特的選擇性。用100% A CN無法將樣品洗脫出色譜柱的情況時有發(fā)生，這些強(qiáng)疏水樣品需用更強(qiáng)的流動相（如高濃度THF-水或THF-A CN）。流動相不含水的HPLC模式稱為非

13、水反相液相色譜（NARP），詳見6-5節(jié)中的討論。6-2-2色譜柱和柱溫的影響RPC分離通常使用硅膠基質(zhì)的鍵合相柱（見5-2-3節(jié)）。樣品的保留值由色譜柱的三個特性決定：柱類型、鍵合相濃度、柱表面積。保留值隨鍵合相的性質(zhì)而有所不同，通常隨鏈長的增加或鍵合相基團(tuán)疏水性的增強(qiáng)而增大。例如，C18柱的保留值通常略大于C8柱（包括鍵合相密度等其它條件相同）。非極性、非離子化合物的RPC保留值通常遵循以下規(guī)則：（弱）未鍵合硅膠氰基<C1（TMS）<C3<C4<苯基<C8C18（強(qiáng)） （6-2）圖6-5所示為非極性（蒽）與極性（二乙基鄰苯二甲酸鹽）在不同商品柱上的保留值關(guān)系圖

14、。當(dāng)其它條件等同時，聚苯乙烯與多孔石墨碳柱（見5-2-3-2節(jié)）比C18柱的保留更強(qiáng)。柱強(qiáng)度可由鍵合相判定，如氰基柱較弱，而C18柱較強(qiáng)。另外，k值與柱表面積成正比。普通柱填料（8nm孔隙）的表面積大約250m2/g，而30 nm孔隙顆粒的表面積大約60m2/g。當(dāng)其它條件相同時，30 nm孔隙（低表面積）色譜柱的k值大約為8nm孔隙色譜柱的k值的1/4（60：250）。因此，大孔隙（表面積低）的氰基柱很弱，其保留值大大低于小孔隙（表面積大）的C18柱。改變色譜柱強(qiáng)度可以控制樣品的保留值（k范圍），而大多數(shù)情況下，改變?nèi)軇?qiáng)度（%B）更為有效和方便。但有兩種例外應(yīng)注意：疏水性強(qiáng)的組分保留也強(qiáng)，

15、有時即使采用NARP條件（見6-5節(jié)）也不可能從強(qiáng)色譜柱（如小孔隙C18柱）上洗脫出來。這種情況下用較弱的色譜柱（如大孔隙的氰基柱）可能會使樣品較快洗脫出來。同樣，用小孔隙、強(qiáng)保留的C18柱或（尤其是）石墨碳柱，則利于強(qiáng)親水樣品的洗脫。對于非離子樣品，通常柱溫增加10C，k會減少12%，因此可通過改變溫度來控制樣品保留值（k范圍），這與改變%B類似。但這種方法在RPC中并不常用，因?yàn)楦淖內(nèi)軇?qiáng)度更加有效。對于疏水性極強(qiáng)的樣品，在較高溫度下采用極強(qiáng)流動相（NARP見6-5節(jié)）和極弱色譜柱效果更好。6-3反相色譜的選擇性調(diào)整樣品保留值k的范圍僅是獲得充分分離的第一步。當(dāng)整體保留值令人滿意時（即0.

16、5<k<20），可能有必要改善不同譜峰的峰間距或選擇性（）。RPC中用來改變中性樣品選擇性的主要參數(shù)有三個：流動相組成、柱類型和柱溫，其中改變流動相的組成通常最為有效且方便，故應(yīng)首先考慮。改變溫度雖然非常方便，但對值的改變通常較小，不過的很小改變有時可足以分離許多樣品。6-3-1溶劑強(qiáng)度的選擇性降低%B的主要影響是導(dǎo)致各樣品組分的k值增加。如圖6-2所示，%B的改變使化合物AD的k值發(fā)生了類似的改變。當(dāng)%B從30%增加到56%時（0.5<k<20范圍內(nèi)），相鄰峰對（如化合物B/C）的選擇性（）變化不大，雖然%B的降低使分離度不斷增加。但其它情況下，相鄰峰間距會隨%B顯著

17、變化。這種溶劑強(qiáng)度選擇性的說明見圖6-6的示例。采用60%與50% A CN分離時，A/B是關(guān)鍵峰對（即采用>50% A CN的流動相時，化合物A與B的分離度較差）。由于降低% A CN能改善A與B的分離，所以當(dāng)溶劑強(qiáng)度進(jìn)一步降低至40% A CN時，這兩個峰的分離將更好，如圖6-6所示。當(dāng)溶劑強(qiáng)度再降低時，峰對C/D的分離效果變差，所以當(dāng)采用40% A CN時，化合物C與D又成為關(guān)鍵峰對。當(dāng)%B的改變使某峰對的分離度增加而另一峰對的分離度降低時（如圖6-6），關(guān)鍵峰對的歸屬也將發(fā)生變化。最佳樣品分離度的理想%B值是兩峰對的分離度相同（此時兩者都為關(guān)鍵峰對）。在的示例中，采用中間溶劑強(qiáng)度

18、（45% A CN），可獲得最佳分離。圖6-5蒽與二乙基鄰苯二甲酸鹽在不同商品柱上的保留一般來說，%B值有一個合適的范圍，使樣品中各組分均獲得可接受的k值。在此范圍中，特定的流動相組分（%B）能使整體樣品分離度最佳（如圖6-6的45% A CN）。最佳溶劑強(qiáng)度（%B）的選擇可通過試-湊試驗(yàn)獲得。40%和50% A CN的運(yùn)行結(jié)果表明，中間濃度的% A CN可使2個峰對（A/B和C/D）都較好地分離。如10-2節(jié)中所述，也可用計(jì)算機(jī)程序通過最少的運(yùn)行次數(shù)、更精確的獲得最佳%B值。很多研究表明，通過改變?nèi)軇?qiáng)度來改變選擇性在RPC中往往是非常重要的，這種方法在調(diào)整峰間距方面的一大優(yōu)點(diǎn)是可以通過不同

19、%B值找出樣品的最佳保留值范圍（0.5<k<20）。這樣在為獲得充分分離而調(diào)整選擇性時，需要進(jìn)行的試驗(yàn)次數(shù)一般不多。例如圖6-7中所示為硝基取代苯衍生混合物分離的溶劑強(qiáng)度選擇性實(shí)驗(yàn)。以60%MeOH作為流動相（見圖6-7a），峰7/8（箭頭所指）為關(guān)鍵峰對；而采用50%MeOH（圖6-7c）峰2/3（箭頭所指）為關(guān)鍵峰對。本例中的最佳分離是二者中間的流動相組成：55%MeOH（圖6-7b）。溶劑強(qiáng)度選擇性的應(yīng)用主要受樣品保留值范圍的限制色譜圖中首峰（a）與末峰（z）的保留值之比k z / k a，若保持0.5<k<20，該比值最大可達(dá)40，如該比值較大（如>20）

20、，可允許的%B變化范圍將很小，以改變%B而使選擇性發(fā)生變化的可能性也很小。當(dāng)采用梯度洗脫時，這種限制將不太重要（見8-4-2節(jié)）。6-3-2溶劑類型選擇性改變有機(jī)溶劑類型來改變峰間距與改善分離度是一種常用的方法。按照溶質(zhì)會影響選擇性的那些特征（包括酸性、堿性、偶極性等）選用不同的RPC溶劑。不同的有機(jī)溶劑可根據(jù)這些特性進(jìn)行分類（如圖2-6和6-8所示）。這種選擇性表示法（溶劑選擇性三角形）在2-3-2節(jié)中已有詳述。溶劑分類對實(shí)際方法建立的意義在于一般只需選用3種溶劑，即可能將選擇性達(dá)到要求的結(jié)果。圖6-8中的3種水溶性溶劑A CN、MeOH、THF的選擇性（陰影部分）有很大差別，其紫外吸收和黏

21、度也較合適，因此推薦這3種溶劑在RPC中作溶劑類型選擇性試驗(yàn)。通過適當(dāng)?shù)鼗旌线@3種溶劑可獲得理想的選擇性（如果特定樣品需要的話）。圖6-6 溶劑強(qiáng)度選擇性：改變有機(jī)溶劑百分比對樣品RPC分離的影響條件：15×0.46 cm C18柱，流速：1.5ml/min圖6-9所示為一溶劑類型選擇性的典型示例。50% MeOH改為25%THF使4種化合物的流出順序完全逆轉(zhuǎn)，但應(yīng)注意即使流出順序未發(fā)生逆轉(zhuǎn)，選擇性的這種變化仍是非常有用的。對于關(guān)鍵峰對，通過改變一些實(shí)驗(yàn)條件，即使選擇性（或值）有微小增加（25%），對獲得較好的分離也可能是非常必要的。圖6-10所示為一個更復(fù)雜的溶劑類型選擇示例，采用

22、50% MeOH（如圖6-10a）分離取代苯的混合物，重疊峰1/2為關(guān)鍵峰對。用THF 代替MeOH，改變%B保持相同的溶劑強(qiáng)度（見圖6-4）。采用32% THF（如6-10b）時1/2的分離很好，但此時2/3又成為關(guān)鍵峰對。因此，這兩種流動相的某種混合應(yīng)能更好地分離該樣品，以50% MeOH和32% THF按1：4比例混合可得到如圖6-10c的結(jié)果。還應(yīng)注意，本例中當(dāng)由50% MeOH改為32% THF時，譜峰46的相對保留發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。優(yōu)化選擇性時，除A CN、MeOH和THF外，有時也使用二氧六環(huán)、丙醇、二甲亞砜、2-甲氧乙醇等。對于某些樣品，用這些替代溶劑可能提供有益的選擇性差別，但也必

23、須考慮到它們的一些弊端：UV吸收高、柱壓高、以及純度與穩(wěn)定性問題。在RPC中，改變?nèi)軇╊愋屯ǔＪ歉淖冞x擇性、分離多組分中性樣品最有效的措施。因此，在建立復(fù)雜樣品的反相分離方法時，調(diào)節(jié)流動相中有機(jī)溶劑種類和濃度應(yīng)作為一種主要手段。6-3-3柱類型對選擇性的影響改變柱類型可改變選擇性。在圖6-11三種不同柱類型的色譜圖中，峰間距確有較大變化。例如峰6和7在苯基和C18柱上的分離效果好于氰基柱。相反，峰6和7在氰基柱上的分離效果好于C8柱。該樣品在這種特定的流動相中，苯基柱的分離最好。改變%B或溶劑類型有可能進(jìn)一步改變各柱的選擇性，所以對圖6-11的樣品來說，苯基柱可能并非唯一的（或最好的）色譜柱。

24、如6-2-2節(jié)中所述，改變柱類型也會改變整體樣品組分的保留值。幾種除莠劑在鍵合官能團(tuán)不同的3種色譜柱上，采用35% A CN-水進(jìn)行的分離見圖6-11。溶質(zhì)在“較強(qiáng)的” C8柱與苯基柱上保留值較大（且運(yùn)行時間較長），在“較弱的” 氰基柱上則較小改變色譜柱通常不如改變流動相類型效果明顯，因此，只有在調(diào)整溶劑強(qiáng)度或溶劑類型改變選擇性不成功時，才嘗試改變柱類型來改善選擇性與分離。如果改變色譜柱，必須針對新柱重新優(yōu)化流動相。也有研究表明，氰基、苯基與C8或C18柱的選擇性差異很大。通常應(yīng)先試驗(yàn)C8或C18柱，然后再試氰基柱、苯基柱。如果只可以采用一種有機(jī)溶劑時，通過改變柱型來改變選擇性則較有利。例如，

25、樣品需要在UV短波長檢測（<210nm）時只有A CN和水可用。如某些樣品組分或全部樣品不穩(wěn)定或可能與流動相發(fā)生反應(yīng)時，可能需用特殊的有機(jī)溶劑。類型相同、來源不同的色譜柱，也可能會影響RPC峰間距。如X牌號的C18柱被替換成Y牌號的C18柱，盡管柱長和直徑相同，選擇性可能發(fā)生改變（尤其是離子樣品），但我們不推薦這種方法。這種選擇性差別由很多原因引起，包括：所采用硅膠的類型、鍵合化學(xué)的技術(shù)和類型，是否經(jīng)過封尾處理及其它因素（見第5章中詳述）。不同批次的柱填料之間的差別通常難以控制，導(dǎo)致使用一段時間后，柱重現(xiàn)性不好，RPC方法的普適性變差。該問題的討論詳見7-3-3節(jié)。上述建議的一個重要例外

26、是不要用來源不同的色譜柱作為改變選擇性的手段。用多官能團(tuán)（聚合物）硅烷制備的大孔隙RPC C18柱對形狀不同的（由于分子內(nèi)的聚集）多環(huán)芳烴（PAH）似乎有獨(dú)特的選擇性。因此，這種由多官能團(tuán)硅烷制得的大孔隙柱，適用于PAH樣品混合物的分離。采用PAH測試混合物有可能說明C18鍵合情況與相應(yīng)柱的選擇性差異，見附錄。選擇性相似的RPC柱在一些HPLC法中可以相互替換，可由附錄中表-2色譜柱的分類中推斷（亦見圖5-9）。環(huán)糊精（CD）鍵合的柱填料也可用于RPC，尤其是用于分離對映異構(gòu)體（見12-5節(jié)）。這些CD柱在分離其它（非手性）異構(gòu)體中也很有效。在這方面，CD鍵合柱分離異構(gòu)體可與正相HPLC相比美

27、。見6-6-1節(jié)與圖6-12中的示例。6-3-4溫度對選擇性的影響采用RPC分離中性化合物時，k值通常隨著柱溫升高而降低（見6-2-2節(jié)）。然而，非離子溶質(zhì)的選擇性隨溫度變化很大的情況不多。因此，大多數(shù)情況下，改變柱溫對改變非離子化合物的選擇性，進(jìn)而改變分離的效果不大。但在圖6-13中的情況也可能發(fā)生，化合物2與4是兩種卷曲分子（鄰-三聯(lián)苯和間-三聯(lián)苯），而其余4種化合物是平面稠環(huán)多環(huán)芳烴。當(dāng)柱溫升高時，平面化合物相對保留值的降低比非平面化合物快。于是關(guān)鍵峰24在溫度變化時峰間距發(fā)生了變化；峰3在360C時重疊入峰4中，當(dāng)溫度升高時向峰2遷移，480C時與峰2重疊。而在420C時達(dá)到該流動相/

28、固定相系統(tǒng)的最佳峰間距。圖6-7硝基取代苯分離效果與溶劑強(qiáng)度（甲醇百分含量）的關(guān)系箭頭所指為關(guān)鍵峰對6-4反相色譜中非離子樣品的分離條件的優(yōu)化第9章中總結(jié)的RPC方法建立的初始運(yùn)行方案適用于各種常規(guī)樣品（離子的或中性的）。用此方法可以使大多數(shù)中性樣品達(dá)到理想的分離。也可以通過其它方式更有效地進(jìn)行方法建立，尤其那些需另外方法建立實(shí)驗(yàn)、改變選擇性的樣品。本節(jié)中對這樣一些技術(shù)加以闡述，它們包括：圖6-8 改良的溶劑選擇性三角形陰影區(qū)域?yàn)镸eOH、AcN、THF的選擇性圖6-9 RPC中溶劑類型的選擇性（a）50% MeOH-水；（b）25%THF-水；色譜峰：1對-硝基苯酚；2對-二硝基苯；3硝基苯

29、；4苯甲酸甲酯溶劑類型和%B的使用（見6-4-2-2節(jié)）1有機(jī)溶劑混合使用（見6-4-2-3節(jié)）2柱類型及%B的改變（見6-4-2-4節(jié)）3不同溶劑和不同柱型的結(jié)合使用（見6-4-2-5節(jié)）6-4-1開始為非離子化合物建立RPC方法的初始推薦條件見表1-3的總結(jié)。選取這些參數(shù)必須兼顧分離度、運(yùn)行時間和柱壓。15或25 cm 、5m C8或C18柱為首選，以未經(jīng)緩沖p H的A CN-水為流動相。流速12ml/min。為了避免由于室溫變化可能引起的保留值和選擇性變化，柱溫應(yīng)控制在35450C之間，但溫度控制對于分離非離子樣品不很重要。如果開始不知道UV檢測的最佳波長，在210nm檢測可能是最佳首選

30、（見3-2-2節(jié)）。圖6-10 RPC中溶劑類型的選擇性（a）50% MeOH-水；（b）32%THF-水；（c）10% MeOH-25%THF-水。色譜峰：1苯乙醇；2苯酚；33-苯丙醇；42，4-二甲基苯酚；5苯；6二乙基鄰苯二甲酸酯。中性樣品等度分離的RPC方法建立的推薦方法歸納如表6-2。首次實(shí)驗(yàn)采用等度方法或梯度方法均可。此處假設(shè)采用等度；如首次應(yīng)用梯度實(shí)驗(yàn)（這樣更好）見8-2-2與9-2-1節(jié)的討論。圖6-2與6-6所示為采用初始等度分離（100% A CN）與下面進(jìn)行的試-湊法實(shí)驗(yàn)，使樣品保留值達(dá)到滿意（0.5<k<20）。保留太強(qiáng)或太弱的樣品需要特殊處理（見9-2-

31、2節(jié)）。另外，若峰拖尾、柱塔板數(shù)（N）較低或峰形不理想，則應(yīng)在繼續(xù)進(jìn)行方法建立實(shí)驗(yàn)前解決。這往往需要采用第7章中所討論的解決方案。6-4-2優(yōu)化選擇性使樣品保留值范圍合適的% A CN確定之后，可能有必要調(diào)整選擇性以改善分離（即：使運(yùn)行時間更短或分離度更佳）。如本章前面所述，有許多方法可改變選擇性：表6-3中以改變選擇性的優(yōu)先順序列出了一些可能的方法。6-4-2-1溶劑強(qiáng)度（%B）的影響 改變?nèi)軇?qiáng)度（%B）方法簡便，是分離重疊峰的首選。如圖6-6與6-7中所示，調(diào)整%B使保留值范圍合適時（0.5<k<20），溶劑強(qiáng)度對選擇性的影響通常很顯著。最終選擇%B時應(yīng)綜合考慮保留值范圍（0

32、.5<k<20）、分離度和運(yùn)行時間。若% A CN值不能得到適宜的選擇性（峰重疊），則必須進(jìn)一步改變實(shí)驗(yàn)條件。當(dāng)研究用另一方式改變選擇性時，最好重新優(yōu)化%B使0.5<k<20。6-4-2-2溶劑類型與%B的影響 對于大多數(shù)中性樣品來說，當(dāng)有機(jī)溶劑由A CN替換為MeOH或THF時，那些以A CN作溶劑時重疊的峰對的峰間距和分離度有可能發(fā)生很大變化。見圖6-14所示的甾體樣品的分離。圖6-14左側(cè)3張色譜圖的流動相分別為24%A CN、45%MeOH與19%THF為流動相，各圖末峰的k=20（即溶劑強(qiáng)度相同）。其中24%A CN的峰1和3未分開，而用45%MeOH和19%

33、THF時，該2峰可達(dá)基線分離。另外，MeOH和THF的峰4和峰6相對位置發(fā)生了變化。圖6-14也說明改變?nèi)軇r，優(yōu)化%B對選擇性及保留值范圍（0.5<k<20）的重要性。在以A CN作溶劑的情況下，24%A CN（末峰k=20）及42%A CN（首峰k=0.5）均未能將峰1和3分開。這種情況下，即使再進(jìn)一步調(diào)節(jié)%B（修飾劑不變）以改變選擇性，也不可能成功分離該混合物。用MeOH作溶劑，當(dāng)濃度為45%時（末峰k=20），4/5為關(guān)鍵峰對，但濃度為65%時（首峰k=0.5），1/2則為關(guān)鍵峰對。改變%B關(guān)鍵峰對也改變時，%B有一中間值可使分離效果最好，48%MeOH可達(dá)到最佳分離（Rs

34、=1.5）。以THF為溶劑時，濃度在19%<%B<37%范圍內(nèi)保留值可達(dá)到0.5<k<20。19%THF時峰1/2為關(guān)鍵峰對，而37% THF時峰4/6為關(guān)鍵峰對。中間濃度值24% THF分離最好（Rs=1.9）。圖6-11柱類型對選擇性的影響色譜柱：Zorbax SB-CN，SB-苯基，SB- C8，15×0.46cm；流動相：A CN-水（35：65）；1.0ml/min；220C；254nm UV檢測圖6-14的分離列舉了簡捷的方法建立策略，該策略適于10種或10種以下組分的樣品分離。第一組實(shí)驗(yàn)的目的為了解%A CN與分離（Rs及運(yùn)行時間）的關(guān)系。通常經(jīng)

35、4或5次運(yùn)行試驗(yàn)，即可找到最佳%A CN，如圖6-2和6-6所示。如果分離結(jié)果可以接受，則不需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。但對于圖6-14的甾體樣品，僅改變%A CN不能成功地進(jìn)行分離，因此應(yīng)試驗(yàn)其它溶劑。采用溶劑強(qiáng)度計(jì)算圖（圖6-4）可以很快通過少數(shù)幾次試驗(yàn)估算出最佳% MeOH。在圖6-14中，48% MeOH在12 min內(nèi)分離可以達(dá)到（Rs=1.5）。如用A CN 或MeOH作溶劑，分離度或保留時間均不能滿意，應(yīng)再作幾次附加實(shí)驗(yàn)，以找出THF濃度的最佳值。在本例中，24% THF可在9 min內(nèi)達(dá)到Rs=1.9。盡管這是圖6-14中所示的最佳分離效果，但事先并不能預(yù)測哪一種溶劑（A CN、MeOH、T

36、HF）最好。如果溶劑類型和%B的某種結(jié)合可以成功的話，圖6-14的逐步試驗(yàn)步驟則可確保用最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)獲得成功的分離。圖6-12 采用環(huán)糊精鍵合柱對異構(gòu)體的分離條件：25×0.46cm Cyclobond 色譜柱30% A CN-緩沖液（p H4.5）；2.0ml/min；350C表6-3改善選擇性的方法a改變?nèi)軇?qiáng)度優(yōu)點(diǎn)：簡單方便，在0.5< k <20范圍內(nèi)通過改變%B尋找合適的；缺點(diǎn)：控制<時不如改變?nèi)軇┯行?，尤其對于等度洗脫時k（末峰）>>k（首峰）的樣品；改變?nèi)軇╊愋停ˋCN，MeOH，THF）優(yōu)點(diǎn)：當(dāng)僅改變%B不足時，改變值的有效方法（值的變

37、化可能比僅改變%B要大）缺點(diǎn)：由于需要更多的實(shí)驗(yàn)，故不如改變%B方便；混合不同溶劑優(yōu)點(diǎn)：分離一對以上的關(guān)鍵峰對時，可提供中間選擇性；擴(kuò)展了改變?nèi)軇╊愋偷膽?yīng)用范圍；缺點(diǎn)：需要大量實(shí)驗(yàn)不方便；改變柱類型優(yōu)點(diǎn)：在改變選擇性方面與改變%B的效果相當(dāng)。當(dāng)僅有一種溶劑類型（如ACN）可用時，改變柱類型則非常有用；缺點(diǎn)：不方便，因?yàn)楸仨毎惭b新柱，并需重新平衡。將不同類型色譜柱串聯(lián)起來使用，以獲得中間選擇性的實(shí)用價(jià)值不大（而混合溶劑則較好）改變柱溫優(yōu)點(diǎn)：如柱溫可以控制，則非常方便；缺點(diǎn)：隨柱溫的變化通常小于其它條件；a大致以重要性優(yōu)先順序?？山Y(jié)合使用兩種或兩種以上方法（如改變柱類型時，同時也可改變?nèi)軇?qiáng)度和/

38、或溶劑類型）。表6-2反相方法建立的推薦步驟1調(diào)整%B，使0.5<k<20，（1<k<10更好）2檢查峰拖尾或塔板數(shù)低的現(xiàn)象3如果必要，調(diào)整選擇性a微調(diào)%Bb改變有機(jī)溶劑c混合有機(jī)溶劑d改變柱類型e改變溫度4優(yōu)化柱條件（柱長、顆粒尺寸、流速）圖6-13改變柱溫對多環(huán)芳烴混合物選擇性的影響樣品：1蒽；2鄰-三聯(lián)苯；3熒蒽；4間-三聯(lián)苯5苯并9，10菲；6芘條件：31.4×0.46cm C18柱，80%A CN-水 1.0ml/min；柱溫如圖示6-4-2-3混合有機(jī)溶劑的使用 圖6-15中列出了另一種優(yōu)化溶劑類型選擇性的有效方法。該方法在保持溶劑強(qiáng)度恒定的同時，

39、按各種可能的比例混合A CN、MeOH和THF。圖6-15中實(shí)驗(yàn)1先調(diào)節(jié)%A CN，使達(dá)到0.5<k<20的分離結(jié)果。若分離不充分，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)2，3）直到分離結(jié)果滿意?；趯?shí)驗(yàn)1的最佳%A CN，從溶劑強(qiáng)度計(jì)算圖中（圖6-4）選出實(shí)驗(yàn)2（MeOH）和3（THF）的流動相。實(shí)驗(yàn)47的流動相由實(shí)驗(yàn)13的流動相按不同比例混合配制。例如，運(yùn)行4中流動相由等體積的實(shí)驗(yàn)1和2的流動相混合制得。流動相混合流動相的體積實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)2實(shí)驗(yàn)3實(shí)驗(yàn)411實(shí)驗(yàn)511實(shí)驗(yàn)511實(shí)驗(yàn)6111經(jīng)過圖6-15中的7次實(shí)驗(yàn)，即可得到使樣品獲得最佳分離度的流動相組成。如前所述，該步驟可借助計(jì)算機(jī)，實(shí)現(xiàn)方法建立自動

40、化（見10-3節(jié)）。不過，圖6-16的示例說明逐步方法建立如不采用計(jì)算機(jī)時，可能不必用圖6-15的全部7次實(shí)驗(yàn)。圖6-14 溶劑強(qiáng)度和溶劑類型的優(yōu)化樣品：1強(qiáng)的松，2可的松，3氫化可的松，4地塞米松，5皮質(zhì)酮，6 11-脫氧皮醇條件：15×0.46cm Zorbax C18柱；2.0 ml/min；350C；圖6-15 基于乙腈、甲醇與四氫呋喃混合液的RPC選擇性優(yōu)化方案。所有流動相強(qiáng)度相等（見圖6-4）。圖6-16中的9組分樣品為取代萘的混合物。開始用改變% A CN的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果A CN可得到0.7<k<8（保留值可接受）：圖6-16的實(shí)驗(yàn)1。該濃度52% A

41、CN有2組峰對重疊（2/3，6/7），所以需改變選擇性以改善分離。根據(jù)溶劑強(qiáng)度計(jì)算圖（圖6-4），下一次實(shí)驗(yàn)（運(yùn)行2）需采用63% MeOH。峰對2/3和6/7在此實(shí)行仍重疊。由于峰對6/7在運(yùn)行1和2中均未分開，所以MeOH和 A CN的混合液不可能成功分離該樣品的所有組分。（這一結(jié)論由圖6-16中實(shí)行4的色譜圖證實(shí)，但實(shí)際工作中無需進(jìn)行該次實(shí)驗(yàn)）由于A CN和MeOH的混合液不能分離該樣品，采用THF進(jìn)行下一實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)3）。所需%B（39% THF）的估計(jì)值可從溶劑強(qiáng)度計(jì)算圖（圖6-4）中得到。注意對于某些樣品，圖6-4給出的近似值可能需經(jīng)一次或二次附加運(yùn)行，以獲得與用A CN的實(shí)驗(yàn)1相似

42、運(yùn)行時間的% MeOH或% THF。在實(shí)驗(yàn)3中，峰對3/4和8/9發(fā)生重疊，但這些關(guān)鍵峰對與在實(shí)驗(yàn)1（2/3，6/7）或?qū)嶒?yàn)2（1/2，6/7）中不同。因此將運(yùn)行3的流動相與運(yùn)行1或2的流動相進(jìn)行混合，分離效果將有所改善。圖6-16 取代萘的溶劑選擇性實(shí)驗(yàn)的7份色譜圖色譜柱：15×0.46cm Zorbax C8柱；流速：2.0 ml/min；溫度：400C；如將實(shí)驗(yàn)2和3的流動相混合（實(shí)驗(yàn)6，MeOH-THF），峰對3/4發(fā)生重疊，峰對1/2則勉強(qiáng)分離；再將實(shí)驗(yàn)6和3的流動相混合，峰對3/4仍未分離；而混合實(shí)驗(yàn)6與2的流動相可使峰對1/2勉強(qiáng)分離。因此，接下來應(yīng)試驗(yàn)混合實(shí)驗(yàn)1和3的

43、流動相。該試驗(yàn)（5）結(jié)果表明色譜圖中所有9個峰均達(dá)到了基線分離。由于運(yùn)行5的關(guān)鍵峰對（6/7）在實(shí)驗(yàn)3中分離更好，故可將少量實(shí)驗(yàn)3的流動相與大量實(shí)驗(yàn)2的流動相混合，或許能有進(jìn)一步的改善。對于含1對以上關(guān)鍵峰對的分離，最佳流動相組成應(yīng)是使2對關(guān)鍵峰對的分離度相等（本例中為6/7與3/4或8/9）。多項(xiàng)研究表明有機(jī)溶劑（A CN、MeOH、THF）的最佳混合一般不會都用到所有3種溶劑，然而對于困難的分離，實(shí)驗(yàn)7可提供關(guān)鍵峰對相對移動的其它選擇性信息。因此，為更有效地進(jìn)行RPC方法建立，應(yīng)首先考慮圖6-15中三角形邊緣上的條件（僅為實(shí)驗(yàn)16）。4種溶劑的實(shí)驗(yàn)7應(yīng)最后、且只有需要時才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖6-1

44、4中所示的方法建立過程可作為圖6-15運(yùn)行的開始。這樣，用圖6-14實(shí)驗(yàn)找出圖6-15中運(yùn)行1，2和3的最佳%B值。而對于需要復(fù)合條件（改變?nèi)軇?qiáng)度和類型，見圖6-14與6-15）的困難樣品，% A CN 、% MeOH與%THF的最佳值在最終運(yùn)行中得到。這樣，圖6-14與6-15的2種分離方式高度互補(bǔ)，非常有效。更重要的是，那些不需要嚴(yán)格控制選擇性的樣品，僅通過幾次實(shí)驗(yàn)即可分離，如圖6-6（改變%B）或圖6-14（利用不同溶劑類型）所示。6-4-2-4柱類型與%B的影響 柱類型（C8、C18、苯基、氰基）也可用于改變選擇性，與改變%B結(jié)合使用時尤其有效。不同類型的色譜柱有特定的選擇性，調(diào)整%

45、B可以進(jìn)一步微調(diào)其選擇性，改變保留時間范圍，也可能縮短分離時間，如圖6-17所示的取代苯甲酸樣品的分離。盡管該樣品并不適于我們對“中性”樣品的定義，但在低p H值條件下分離，樣品中的所有化合物實(shí)際上皆為中性。6-17a所示為用3支不同色譜柱（C8、苯基、氰基）、C8柱使樣品保留最大（末峰k=20）的% MeOH分離該樣品的色譜圖。此時苯基柱的分離效果最佳，在C8柱上峰4/6部分重疊，而氰基柱上1/2重疊。然而，由于該樣品組成簡單及保留范圍有限，可以用更強(qiáng)的流動相，如圖6-17b所示調(diào)節(jié)有機(jī)溶劑濃度可使首峰k=0.5，如C8柱可用52% MeOH（b）替代26% MeOH。相同色譜柱用不同% M

46、eOH（如圖6-17a與b），峰間距（即溶劑強(qiáng)度選擇性）有顯著變化。在每支柱上的通過2次運(yùn)行可以系統(tǒng)地調(diào)整% MeOH獲得最佳分離度，見圖6-17c。苯甲酸樣品在氰基柱上選用最佳值32% MeOH時，可分離更好，相當(dāng)于苯基柱的分離效果（Rs=2.0），但運(yùn)行時間更短（5 min替代13min）。6-4-2-5不同溶劑與柱類型的結(jié)合使用 溶劑種類和柱類型選擇性的結(jié)合使用對于分離極困難的樣品可能有效。圖6-18概述了這種方法。用圖6-15方法，首先在C8或C18柱上研究溶劑種類的選擇性。若分離結(jié)果滿意，無需再進(jìn)一步改善選擇性。若分離不充分，用氰基柱重復(fù)圖6-15方法（注意：一支色譜柱的最佳流動相會

47、與另一柱的不同）。若這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍不滿意，用苯基柱重復(fù)圖6-15實(shí)驗(yàn)。圖6-18的步驟已用來分離20種PTH氨基酸混合物。圖6-19所示為各柱型的最佳分離結(jié)果，及采用芐基柱（與苯基柱相似）時以5% A CN，15% MeOH與13% THF作流動相獲得的最佳整體分離度（Rs=1.2）。注意：該分離效果只是比C8（Rs=0.9）或氰基柱（Rs=1.0）略好一些。6-5非水反相HPLC圖6-17 苯甲酸的混合物在3種類型柱上的分離非水反相色譜法（NARP）主要用于強(qiáng)疏水性樣品的分離，這種樣品通常在色譜柱上保留極強(qiáng)或即使采用100% A CN作為流動相時仍然無法洗脫出（如脂類或合成聚合物）。NARP

48、分離的流動相通常為高極性（A）和低極性（B）有機(jī)溶劑的混合液。一般來說，A溶劑為A CN或MeOH，B溶劑為THF、氯仿、二氯甲烷、丙酮、甲基-叔-丁基醚（MTBE）或這些溶劑的不同混合液。改變%B與強(qiáng)溶劑B的種類可控制樣品的保留值。改變溫度也可用于優(yōu)化分離。圖6-20所示為NARP分離標(biāo)準(zhǔn)品（b）與番茄提取液（c）混合液中各種胡蘿卜素（a）的結(jié)果。番茄紅素（峰1）是圖6-20 c樣品中含有的主要胡蘿卜素。強(qiáng)疏水樣品一般不溶于水溶劑，這也是采用NARP分離該類樣品的另一個原因。NARP的方法建立類似于使用通常的水-有機(jī)溶劑流動相的RPC法。一般首選采用A CN（A）和THF（B）的混合液作為初

49、始流動相。若用100%THF，樣品保留仍太強(qiáng)，可以用極性較弱（更強(qiáng)）的B溶劑（如二氯甲烷或氯仿）替換，但應(yīng)用二氯甲烷或氯仿時分別要求UV檢測波長不得小于236nm與250nm。目前NARP的使用不多，這可能是因?yàn)橥ǔ２捎枚燃淄樽鳛锽-溶劑限制了低波長UV檢測；很多經(jīng)NARP分離的樣品可采用正相色譜方便地分離。圖6-17取代苯甲酸的混合物在3種類型柱上的分離條件：15×0.46cm 5m 柱；流動相見圖示。緩沖液25mM枸櫞酸（p H2.5）；2.0 ml/min；350C。（a）% MeOH調(diào)整至末峰k=20；（b）% MeOH調(diào)整至首峰k=0.5；（c）% MeOH調(diào)整至最大分離

50、度。圖6-18 溶劑種類與柱類型選擇性結(jié)合的方法建立用C8、氰基和苯基柱，含A CN、MeOH、THF的流動相實(shí)驗(yàn)的示意圖。溶劑強(qiáng)度和運(yùn)行時間保持恒定。圖6-19 圖6-18中方法在分離20種PTH氨基酸中的應(yīng)用色譜柱：25×0.46cm 6m 微粒；（a）CN，（b）芐基，（c）C8；流速：2.0 ml/min，柱溫：500C，各色譜柱上每次分離均采用最佳流動相。A/B/C/D：甲醇/乙腈/四氫呋喃/ p H2.1磷酸。（a）A=9.2/B=1.3/C=21.0/D =67.6；（b）A=15.2/B=5.4/C=13.4/D=66.0（c）A=0.8/B=26.5/C=4.5/D

51、=68.2。第二部分 正相色譜正相色譜（NPC）與RPC相反，固定相的極性大于流動相。樣品的保留值隨流動相的極性降低而增加（與RPC相反）。一般來說，流動相采用不含水的有機(jī)溶劑混合液（如異丙醇與己烷），柱填料為無機(jī)吸附劑（硅膠、有時也用氧化鋁）或硅膠擔(dān)體的極性鍵合相（氰基、二醇基或氨基）。NPC可用于分離中性或離子（或可電離的）樣品，但以中性樣品為主。NPC分離離子樣品時可以在流動相中使用水，保留機(jī)理較為復(fù)雜。用NPC分離離子樣品時，通常最好在流動相中加入三乙胺分離堿性化合物；而加入乙酸或甲酸分離酸性化合物。中性樣品采用NPC或RPC分離的效果一般相近，其主要差異在于2種HPLC方法的洗脫順序

52、相反。在NPC中，弱極性（疏水的）化合物先流出，強(qiáng)極性（親水的）化合物后流出；該性質(zhì)與圖6-1的RPC行為恰恰相反。應(yīng)用NPC的原因前面已述，見表6-4中的總結(jié)。表6-4使用正相色譜（NPC）的理由1樣品在RPC中不保留（親水性太強(qiáng)）2樣品在RPC中保留太強(qiáng)（疏水性太強(qiáng)）3采用RPC分離不能獲得足夠的峰間距（=1）4樣品含有空間異構(gòu)體，立體異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體5期望回收到大量疏水性樣品組分（制備色譜）6樣品溶于非極性溶劑（若采用RPC柱，會對直接進(jìn)樣造成問題）NPC的優(yōu)缺點(diǎn)見表6-5中總結(jié)。通常，應(yīng)首先實(shí)驗(yàn)RPC分離模式，但由于表6-4中的原因，有些情況首先用NPC分離可能更好。當(dāng)初始RPC實(shí)

53、驗(yàn)表明不同溶劑與/或色譜柱均不能充分分離樣品或選擇性達(dá)不到預(yù)期效果時，則需要將RPC更換為NPC，見表6-6。圖6-20 胡蘿卜素的非水反相（NARP）分離條件：25×0.46cm C18柱；8%氯仿-A CN流動相，2.0 ml/min；室溫，UV470nm。表6-5正相色譜的特征優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)1通過改變流動相或柱填料（尤其是無機(jī)填料，如硅膠），分離選擇性可以改變很大。2用非水流動相時，色譜柱非常穩(wěn)定。3許多有機(jī)化合物在正相溶劑中易溶。（制備HPLC中的突出優(yōu)點(diǎn)）。4溶劑黏度低，柱壓降較低；5適用于在水溶液中可能分解的樣品。1離子樣品用RPC分離更容易。2溶劑強(qiáng)度的控制比RPC中難預(yù)測且

54、更亢長。3NPC柱的塔板數(shù)有時低于RPC柱。4低沸點(diǎn)溶劑更易蒸發(fā)或產(chǎn)生氣泡；尤其在室溫較高時（不方便）。5對于原硅膠：a：柱填料吸收水分后，會導(dǎo)致保留值飄忽不定；b：由于溶劑分層及硅膠柱易吸水，不能進(jìn)行梯度洗脫；6有機(jī)溶劑的成本和處理費(fèi)用較高。表6-6 NPC和RPC的選擇性比較具有不同官能團(tuán)的化合物：硅膠柱比C18柱的值大；NPC極性鍵合相柱與RPC C18的值非常相似。同系物或含碳數(shù)目不同的化合物：RPC比NPC的值大；異構(gòu)體：硅膠柱比C18柱的值大得多；極性鍵合相柱比C18柱的值大；6-6正相色譜的保留6-6-1一般原理RPC的保留機(jī)理類似于分配過程（如圖6-1），而NPC的保留機(jī)理類似

55、于吸附過程。圖6-21a所示為一個樣品分子S在含極性溶劑分子E的流動相NPC中的保留過程。在保留之前，柱填料（吸附劑）的表面首先覆蓋有一層溶劑分子E。樣品分子S在發(fā)生保留時必須將溶劑分子E置換下來，以提供吸附S的空間。6-6-1-1樣品和溶劑的定位 極性樣品和溶劑分子（如圖6-21中的S與E）被牢固地吸附于柱填料表面上的極性基團(tuán)（吸附位點(diǎn)）上，硅膠的吸附位點(diǎn)為硅羥基（-SiOH）。對于NPC中常用的氰基、氨基或二醇基柱，吸附位點(diǎn)可以為鍵合相配體或硅羥基。極性樣品分子可在殘余烴基（如己烷或苯）上吸附一個或多個極性官能團(tuán)，與吸附的極性基團(tuán)相反，非極性烴類樣品僅微弱地吸附于吸附位點(diǎn)上，見圖6-21b

56、 中極性基團(tuán)X和Y取代的苯衍生物的吸附示意圖。圖6-21正相保留示意圖。S為樣品分子；E為強(qiáng)溶劑（B）分子；X和Y是極性官能團(tuán)。對于單取代基化合物X-苯和Y-苯（見圖6-21b），極性基團(tuán)X-或Y-吸附于吸附位點(diǎn)A上。若基團(tuán)X-或Y-的極性很大，則這種吸附也非常強(qiáng)，基團(tuán)X-或Y-將吸附于或定位于吸附位點(diǎn)上。當(dāng)同一個分子中存在兩個或更多極性基團(tuán)時，這些基團(tuán)不可能同時進(jìn)行定位（如圖6-21b所示）。而極性非常強(qiáng)的溶劑分子也可以參與定位，這對于加強(qiáng)選擇性的控制具有重要的實(shí)際意義。極性樣品和溶劑分子與NPC固定相的作用較強(qiáng)烈。因此，NPC通過改變強(qiáng)溶劑（B）或色譜柱，通常能夠比RPC更強(qiáng)地控制選擇性。

57、表6-7所示為2種化合物在氧化鋁柱上以用2種不同流動相的NPC分離結(jié)果。當(dāng)以A CN-苯-戊烷（ABP）（5：10：85）作流動相時，1，3，5-三硝基苯（TNB）和N，N-二甲基-1-萘胺（DMN）的保留值相似（=1.2）。流動相換為苯時，選擇性發(fā)生巨大變化（=290?。?。這種選擇性的改變是由2種溶質(zhì)和2種強(qiáng)溶劑在固定相表面的作用位點(diǎn)不同而引起的：苯不定位，而A CN定位牢固；溶劑A CN的定位競爭削弱了DMN的強(qiáng)定位，因此其保留值降低。而由于TNB定位并不強(qiáng)（無極性很強(qiáng)的取代基），故A CN的定位對TNB的保留影響較小。這些重要的溶劑選擇性定位效應(yīng)在6-6-2節(jié)中再作進(jìn)一步討論。表6-7 NPC分離的選擇性：改變流動相的影響a化合物不同流動相的k值A(chǔ)BPb（5/10/85）苯1，3，5-三硝基苯5.90.3N，N-二甲基-1-萘胺7.188=1.2290a 色譜柱：25×0.38cm 以水鈍化的堿性氧化鋁填裝填。b A 乙腈，B 苯， P，戊烷溶劑和溶質(zhì)與NPC固定相作用強(qiáng)烈，在溶劑分類與方法建立方面（見6-7節(jié)），需采用與RPC略微不同的方法（見圖6-15）。6-6-2流動相的影響NPC流動相的選擇方式與RPC相同。也是先選擇一種弱（非極性）溶劑A和一種強(qiáng)（極性）溶劑B，然后混合以獲得使樣品達(dá)到0.5<K<20的中等極性的流動相。為使保留值足夠大，