交大生化筆記4

1、第四 章 酶酶(enzyme)是生物催化劑，體內(nèi)的代謝反應都是由酶所催化的，所以它在物質(zhì)代謝中發(fā)揮非常重要的作用。因此在討論物質(zhì)代謝之前必先對酶有一個全面的了解；本章重點為酶的化學結(jié)構(gòu)和其催化活性之間的關系、酶的作用機制和酶反應動力學。第一節(jié)，酶的概念酶是由活細胞產(chǎn)生的一類具有催化作用的蛋白質(zhì)，故又有生物催化劑(biocatalyst)之稱與一般催化劑相比，酶的催化作用有高度專一性、高度催化效率及其催化活性的可調(diào)節(jié)性和高度的不穩(wěn)定性（變性失活）等特點酶的這些性質(zhì)使細胞內(nèi)錯綜復雜的物質(zhì)代謝過程能有條不紊地進行，使物質(zhì)代謝與正常的生理機能互相適應若因遺傳缺陷造成某個酶缺損，或其它原因造成酶的活性減

2、弱，均可導致該酶催化的反應異常，使物質(zhì)代謝紊亂，甚至發(fā)生疾病因此酶與醫(yī)學的關系十分密切，自1982年以來隨著具有催化功能的RNA和DNA的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，目前認為生物體內(nèi)除了存在酶這類催化劑外，另一類則是核酸催化劑，如其本質(zhì)為RNA則稱為核酶（ribozyme），因此現(xiàn)代科學認為酶是由活細胞所產(chǎn)生，能在體內(nèi)或體外發(fā)揮相同催化作用的一類具有活性中心和特殊結(jié)構(gòu)的生物大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸，但由于核酸參與催化反應有限，而且這些反應均可有相應的酶所催化，因此酶仍是體內(nèi)最主要的催化劑。第二節(jié) 酶作用的分子基礎 一、酶的化學組成按照酶的化學組成可將酶分為單純酶和結(jié)合酶兩大類。單純酶分子中只有氨基酸殘基組成的肽

3、鏈，結(jié)合酶分子中則除了多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，還有非蛋白成分，如金屬離子、鐵卟啉或含B族維生素的小分子有機物。結(jié)合酶的蛋白質(zhì)部分稱為酶蛋白(apoenzyme)，非蛋白質(zhì)部分統(tǒng)稱為輔助因子 (cofactor)，兩者一起組成全酶(holoenzyme)；只有全酶才有催化活性，如果兩者分開則酶活力消失。非蛋白質(zhì)部分如鐵卟啉或含B族維生素的化合物若與酶蛋白以共價鍵相連的稱為輔基(prosthetic group)，用透析或超濾等方法不能使它們與酶蛋白分開；反之兩者以非共價鍵相連的稱為輔酶(coenzyme)，可用上述方法把兩者分開。表4-1為以金屬離子作結(jié)合酶輔助因子的一些例子。表4-2列出含B族維生

4、素的幾種輔酶(基)及其參與的反應。結(jié)合酶中的金屬離子有多方面功能，它們可能是酶活性中心的組成成分；有的可能在穩(wěn)定酶分子的構(gòu)象上起作用；有的可能作為橋梁使酶與底物相連接。輔酶與輔基在催化反應中作為氫(H+和e)或某些化學基團的載體，起傳遞氫或化學基團的作用。體內(nèi)酶的種類很多，但酶的輔助因子種類并不多，從表41中已見到幾種酶均用某種相同的金屬離子作為輔助因子的例子，同樣的情況亦見于輔酶與輔基，如3-磷酸甘油醛脫氫酶和乳酸脫氫酶均以NAD+作為輔酶。酶催化反應的特異性決定于酶蛋白部分，而輔酶與輔基的作用是參與具體的反應過程中氫(H+和e)及一些特殊化學基團的運載。二、酶的活性中心酶屬生物大分子，分子

5、質(zhì)量至少在1萬以上，大的可達百萬。酶的催化作用有賴于酶分子的一級結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)的完整。若酶分子變性或亞基解聚均可導致酶活性喪失。一個值得注意的問題是酶所催化的反應物即底物（substrate），卻大多為小分物質(zhì)它們的分子質(zhì)量比酶要小幾個數(shù)量級。酶的活性中心（active center）只是酶分子中的很小部分，酶蛋白的大部分氨基酸殘基并不與底物接觸。組成酶活性中心的氨基酸殘基的側(cè)鏈存在不同的功能基團，如-NH2、-COOH、-SH、-OH和咪唑基等，它們來自酶分子多肽鏈的不同部位。有的基團在與底物結(jié)合時起結(jié)合基團(binding group)的作用，有的在催化反應中起催化基團(catalytic

6、 group)的 作用。但有的基團既在結(jié)合中起作用，又在催化中起作用，所以常將活性部位的功能基團統(tǒng)稱為必需基團(essential group)。它們通過多肽鏈的盤曲折疊，組成一個在酶分子表面、具有三維空間結(jié)構(gòu)的孔穴或裂隙，以容納進入的底物與之結(jié)合（圖4-1）并催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，這個區(qū)域即稱為酶的活性中心。而酶活性中心以外的功能集團則在形成并維持酶的空間構(gòu)象上也是必需的，故稱為活性中心以外的必需基團。對需要輔助因子的酶來說，輔助因子也是活性中心的組成部分。酶催化反應的特異性實際上決定于酶活性中心的結(jié)合基團、催化基團及其空間結(jié)構(gòu)。三、酶的分子結(jié)構(gòu)與催化活性的關系酶的分子結(jié)構(gòu)的基礎是其氨基酸的序

7、列，它決定著酶的空間結(jié)構(gòu)和活性中心的形成以及酶催化的專一性。如哺乳動物中的磷酸甘油醛脫氫酶的氨基酸殘基序列幾乎完全相同，說明相同的一級結(jié)構(gòu)是酶催化同一反應的基礎。又如消化道的糜蛋白酶，胰蛋白酶和彈性蛋白酶都能水解食物蛋白質(zhì)的肽鍵，但三者水解的肽鍵有各自的特異性，糜蛋白酶水解含芳香族氨基酸殘基提供羧基的肽鍵，胰蛋白酶水解賴氨酸等堿性氨基酸殘基提供羧基的肽鍵，而彈性蛋白酶水解側(cè)鏈較小且不帶電荷氨基酸殘基提供羧基的肽鍵這三種酶的氨基酸序列分析顯示40左右的氨基酸序列相同，都以絲氨酸殘基作為酶的活性中心基團，三種酶在絲氨酸殘基周圍都有G1y-Asp-Ser-Gly-Pro序列，X線衍射研究提示這三種酶

8、有相似的空間結(jié)構(gòu)，這是它們都能水解肽鍵的基礎。而它們水解肽鍵時的特異性則來自酶的底物結(jié)合部位上氨基酸組成上有徽小的差別所致（圖4-2）。 圖說明這三個酶的底物結(jié)合部位均有一個袋形結(jié)構(gòu)，糜蛋白酶該處能容納芳香基或非極性基；胰蛋白酶袋子底部稍有不同其中一個氨基酸殘基為天冬氨酸取代，使該處負電荷增強，故該處對帶正電荷的賴氨酸或精酸殘基結(jié)合有利；彈性蛋白酶口袋二側(cè)為纈氨酸和蘇氨酸殘基所取代，因此該處只能結(jié)合較小側(cè)鏈和不帶電荷的基團說明酶的催化特異性與酶分子結(jié)構(gòu)的緊密關系。四、酶原與酶原激活（zymogen and activation of zymogen）有些酶如消化系統(tǒng)中的各種蛋白酶以無活性的前體

9、形式合成和分泌，然后，輸送到特定的部位，當體內(nèi)需要時，經(jīng)特異性蛋白水解酶的作用轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿付l(fā)揮作用。這些不具催化活性的酶的前體稱為酶原（zymogen）。如胃蛋白酶原(pepsinogen)、胰蛋白酶原(trypsinogen)和胰凝乳蛋白酶原(chymotrypsinogen)等。某種物質(zhì)作用于酶原使之轉(zhuǎn)變成有活性的酶的過程稱為酶原的激活。使無活性的酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿傅奈镔|(zhì)稱為活化素?；罨貙τ诿冈募せ钭饔镁哂幸欢ǖ奶禺愋?。例如胰腺細胞合成的糜蛋白酶原為245個氨基酸殘基組成的單一肽鏈，分子內(nèi)部有5對二硫鍵相連，該酶原的激活過程如圖4-3所示首先由胰蛋白酶水解15位精氨酸和16位異

10、亮氨酸殘基間的肽鍵，激活成有完全催化活性的p-糜蛋白酶，但此時酶分子尚未穩(wěn)定，經(jīng)p-糜蛋白酶自身催化，去除二分子二肽成為有催化活性井具穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的糜蛋白酶。在正常情況下，血漿中大多數(shù)凝血因子基本上是以無活性的酶原形式存在，只有當組織或血管內(nèi)膜受損后，無活性的酶原才能轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿?，從而觸發(fā)一系列的級聯(lián)式酶促反應，最終導致可溶性的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的纖維蛋白多聚體，網(wǎng)羅血小板等形成血凝塊。酶原激活的本質(zhì)是切斷酶原分子中特異肽鍵或去除部分肽段后有利于酶活性中心的形成酶原激活有重要的生理意義，一方面它保證合成酶的細胞本身不受蛋白酶的消化破壞， 另一方面使它們在特定的生理條件和規(guī)定的部位受到激活并發(fā)

11、揮其生理作用。如組織或血管內(nèi)膜受損后激活凝血因子；胃主細胞分泌的胃蛋白酶原和胰腺細胞分泌的糜蛋白酶原、胰蛋白酶原、彈性蛋白酶原等分別在胃和小腸激活成相應的活性酶，促進食物蛋白質(zhì)的消化就是明顯的例證。特定肽鍵的斷裂所導致的酶原激活在生物體內(nèi)廣泛存在，是生物體的一種重要的調(diào)控酶活性的方式。如果酶原的激活過程發(fā)生異常，將導致一系列疾病的發(fā)生。出血性胰腺炎的發(fā)生就是由于蛋白酶原在未進小腸時就被激活，激活的蛋白酶水解自身的胰腺細胞，導致胰腺出血、腫脹。四、同工酶(isoenzyme)同工酶的概念：即同工酶是一類催化相同的化學反應，但酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫原性各不相同的一類酶。 它們存在于生物的

12、同一種族或同一個體的不同組織，甚至在同一組織、同一細胞的不同細胞器中。至今已知的同工酶已不下幾十種，如己糖激酶，乳酸脫氫酶等，其中以乳酸脫氫酶（Lactic acid dehydrogenase,LDH）研究得最為清楚。人和脊柱動物組織中，有五種分子形式，它們催化下列相同的化學反應： 五種同工酶均由四個亞基組成。 LDH的亞基有骨骼肌型(M型)和心肌型(H型)之分，兩型亞基的氨基酸組成不同，由兩種亞基以不同比例組成的四聚體，存在五種LDH形式即H4（LDHl）、 H3M1（LDH2）、H2M2 (LDH3)、H1M3(LDH4)和M4 (LDH5)。M、H亞基的氨基酸組成不同，這是由基因不同所

13、決定。五種LDH中的M、H亞基比例各異，決定了它們理化性質(zhì)的差別通常用電冰法可把五種LDH分開，LDH1向正極泳動速度最快，而LDH5泳動最慢，其它幾種介于兩者之間，依次為LDH2、LDH3和LDH4(圖4-5) 圖4-5還說明了不同組織中各種LDH所含的量不同，心肌中以LDHl及LDH2的量較多，而骨骼肌及肝中LDH5和LDH4為主不同組織中LDH同工酶譜的差異與組織利用乳酸的生理過程有關LDH1和LDH2對乳酸的親和力大，使乳酸脫氫氧化成丙酮酸，有利于心肌從乳酸氧化中取得能量。LDH5和LDH4對丙酮酸的親和力大，有使丙酮酸還原為乳酸的作用，這與肌肉在無氧酵解中取得能量的生理過程相適應(詳

14、見糖代謝章)在組織病變時這些同工酶釋放入血，由于同工酶在組織器官中分布差異，因此血清同工酶譜就有了變化。故臨床常用血清同工酶譜分析來診斷疾病(圖4-5)。 五、 別構(gòu)酶別構(gòu)酶(allosteric enzyme)往往是具有四級結(jié)構(gòu)的多亞基的寡聚酶，酶分子中除有催化作用的活性中心也稱催化位點（catalytic site）外；還有別構(gòu)位點(allosteric site)后者是結(jié)合別構(gòu)劑(allesteric effector)的位置，當它與別構(gòu)劑結(jié)合時，酶的分子構(gòu)象就會發(fā)生輕微變化，影響到催化位點對底物的親和力和催化效率。若別構(gòu)劑結(jié)合使酶與底物親和力或催化效率增高的稱為別構(gòu)激活劑(allost

15、eric activator)，反之使酶底物的r親和力或催化效率降低的稱為別構(gòu)抑制劑(allosteric inhibitor)。酶活性受別構(gòu)劑調(diào)節(jié)的作用稱為別構(gòu)調(diào)節(jié)(allosteric regulation)作用別構(gòu)酶的催化位點與別構(gòu)位點可共處一個亞基的不同部位，但更多的是分別處于不同亞基上在后一種情況下具催化位點的亞基稱催化亞基，而具別構(gòu)位點的稱調(diào)節(jié)亞基。多數(shù)別構(gòu)酶處于代謝途徑的開端，而別構(gòu)酶的別構(gòu)劑往往是一些生理性小分子及該酶作用的底物或該代謝途徑的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物。故別構(gòu)酶的催化活性受細胞內(nèi)底物濃度、代謝中間物或終產(chǎn)物濃度的調(diào)節(jié)。終產(chǎn)物抑制該途徑中的別構(gòu)酶稱反饋抑制(feedback

16、 inhibition)說明一旦細胞內(nèi)終產(chǎn)物增多，它作為別構(gòu)抑制劑抑制處于代謝途徑起始的酶，及時調(diào)整該代謝途徑的速度，以適應細胞生理機能的需要。別構(gòu)酶在細胞物質(zhì)代謝上的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。故別構(gòu)酶又稱調(diào)節(jié)酶。（regulatory enzyme）六、修飾酶 體內(nèi)有些酶需在其它酶作用下，對酶分子結(jié)構(gòu)進行修飾后才具催化活性，這類酶稱為修飾酶（modification enzyme）。其中以共價修飾為多見，如酶蛋白的絲氨酸，蘇氨酸殘基的功能基團-OH可被磷酸化， 這時伴有共價鍵的修飾變化生成，故稱共價修飾(covalent modification)。由于這種修飾導致酶活力改變稱為酶的共價修飾調(diào)節(jié)(

17、covalent modification regulation)。體內(nèi)最常見的共價修飾是酶的磷酸化與去磷酸化，此外還有酶的乙?；c去乙?；?、尿苷酸化與去尿苷酸化、甲基化與去甲基化。由于共價修飾反應迅速，具有級聯(lián)式放大效應所以亦是體內(nèi)調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的重要方式。如催化糖原分解第一步反應的糖原磷酸化酶存在有活性和無活性兩種形式，有活性的稱為磷酸化酶a，無活性的稱為磷酸化酶b，這兩種形式的互變就是通過酶分子的磷酸化與去磷酸化的過程（詳見糖代謝章）七、多酶復合體與多酶體系體內(nèi)有些酶彼此聚合在一起，組成一個物理的結(jié)合體，此結(jié)合體稱為多酶復合體 (multienzyme complex)。若把多酶復合體解體

18、，則各酶的催化活性消失。參與組成多酶復合體的酶有多有少，如催化丙酮酸氧化脫羧反應的丙酮酸脫氫酶多酶復合體由三種酶組成，而在線粒體中催化脂肪酸-氧化的多酶復合體由四種酶組成。多酶復合體第一個酶催化反應的產(chǎn)物成為第二個酶作用的底物，如此連續(xù)進行，直至終產(chǎn)物生成 多酶復合體由于有物理結(jié)合，在空間構(gòu)象上有利于這種流水作業(yè)的快速進行，是生物體提高酶催化效率的一種有效措施。 體內(nèi)物質(zhì)代謝的各條途徑往往有許多酶共同參與，依次完成反應過程，這些酶不同于多酶復合體，在結(jié)構(gòu)上無彼此關聯(lián)。故稱為多酶體系(multienzyme system)。如參與糖酵解的11個酶均存在于胞液，組成一個多酶體系。八、多功能酶近年來

19、發(fā)現(xiàn)有些酶分子存在多種催化活性，例如大腸桿菌DNA聚合酶I是一條分子質(zhì)量為109kDa的多肽鏈，具有催化DNA鏈的合成、3-5核酸外切酶和5-3核酸外切酶的活性，用蛋白水解酶輕度水解得兩個肽段，一個含5-3核酸外切酶活性，另一個含另兩種酶的活性，表明大腸桿菌DNA聚合酶分子中含多個活性中心。哺乳動物的脂肪酸合成酶由兩條多肽鏈組成，每一條多肽鏈均含脂肪酸合成所需的七種酶的催化活性。 這種酶分子中存在多種催化活性部位的酶稱為多功能酶(multifunctional enzyme)或串聯(lián)酶(tandem enzyme)。多功能酶在分子結(jié)構(gòu)上比多酶復合體更具有優(yōu)越性，因為相關的化學反應在一個酶分子上進

20、行，比多酶復合體更有效，這也是生物進化的結(jié)果。第三節(jié) 酶的分類與命名原則為了更有效地研究酶，人們曾提出各種酶分類命名的方法，但目前普遍接受的是國際生化聯(lián)合會酶委員會推薦的系統(tǒng)，其主要內(nèi)容如下：一、 根據(jù)酶的反應性質(zhì)、將酶分成六大類：（一） 氧化還原酶類（oxidoreductase） （二） 轉(zhuǎn)移酶類（transferases）（三） 水解酶類（hydrolases ） （四） 裂解酶類（lyases）（五） 異構(gòu)酶類（isomerases）（六） 合成酶類（ligase）在每一大類中，再根據(jù)更具體的酶反應、底物性質(zhì)分成若干亞類和亞亞類。對每一種酶同時采用系統(tǒng)和習慣兩種命名二、 習慣命名法三、

21、系統(tǒng)命名法鑒于新酶的不斷發(fā)現(xiàn)和過去對酶命名的紊亂，為避免一種酶有幾種名稱或不同的酶用同一種名稱的現(xiàn)象，國際酶學委員會規(guī)定了一個系統(tǒng)命名法，包括了酶的系統(tǒng)命名和4個數(shù)字分類的酶編號例如對催化下列反應的酶的命名為 ATP十D一葡萄糖 ADP十D一葡萄糖-6磷酸ATP葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶，它催化從ATP中轉(zhuǎn)移一個磷酸到葡萄糖的反應它的分類數(shù)是E、C、2，7，l，1E、C表示國際酶學委員會，第一個數(shù)字“2”代表酶的分類(轉(zhuǎn)移酶類)，第二個 “7”代表亞類(磷酸轉(zhuǎn)移酶類)；第三個 “l(fā)”代表亞亞類(以羥基作為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶類);第四個 “1”代表該酶在亞亞類中的排號(以D-葡萄糖作為磷酸基的受體)。 第四

22、節(jié) 酶促反應的特點及作用機制一、酶促反應的特點(一)酶促反應具有高度的催化速率酶是高效生物催化劑，比一般催化劑的效率高107-1013倍。酶能加快化學反應的速度，但酶不能改變化學反應的平衡點，也就是說酶在促進正向反應的同時也以相同的比例促進逆向的反應，所以酶的作用是縮短了到達平衡所需的時間，但平衡常數(shù)不變，在無酶的情況下達到平衡點需幾個小時，在有酶時可能只要幾秒鐘就可達到平衡。酶和一般催化劑都是通過降低反應活化能的機制來加快化學反應速度的。 (二) 酶催化具有高度特異性酶的催化特異性表現(xiàn)在它對底物的選擇性和催化反應的特異性兩方面。體內(nèi)的化學反應除了個別自發(fā)進行外，絕大多數(shù)都由專一的酶催化，一種

23、酶能從成千上萬種反應物中找出自己作用的底物，這就是酶的特異性。根據(jù)酶催化特異性程度上的差別，分為絕對特異性(absolute specificity)、相對特異性(relative specificity)和立體異構(gòu)特異性(stereospecificity)三類。一種酶只催化一種底物進行反應的稱絕對特異性，如脲酶只能水解尿素使其分解為二氧化碳和氨；若一種酶能催化一類化合物或一類化學鍵進行反應的稱為相對特異性，如酯酶既能催化甘油三脂水解，又能水解其他酯鍵。具有立體異構(gòu)特異性的酶對底物分子立體構(gòu)型有嚴格要求，如L乳酸脫氫酶只催化L-乳酸脫氫，對D-乳酸無作用。(三) 酶活性的可調(diào)節(jié)性有些酶的催化

24、活性可受許多因素的影響，如別構(gòu)酶受別構(gòu)劑的調(diào)節(jié)，有的酶受共價修飾的調(diào)節(jié)，激素和神經(jīng)體液通過第二信使對酶活力進行調(diào)節(jié)，以及誘導劑或阻抑劑對細胞內(nèi)酶含量(改變酶合成與分解速度)的調(diào)節(jié)等。二、酶促反應的作用機制(一) 酶(E)與底物(S)形成酶-底物復合物(ES)酶的活性中心與底物定向結(jié)合生成ES復合物是酶催化作用的第一步。定向結(jié)合的能量來自酶活性中心功能基團與底物相互作用時形成的多種非共價鍵，如離子鍵、氫鍵、疏水鍵，也包括范德瓦力。它們結(jié)合時產(chǎn)生的能量稱為結(jié)合能（binding energy）。這就不難理解各個酶對自己的底物的結(jié)合有選擇性。 (二)酶與底物的過渡狀態(tài)互補若酶只與底物互補生成ES復合

25、物，不能進一步促使底物進入過渡狀態(tài)，那末酶的催化作用不能發(fā)生。這是因為酶與底物生成ES復合物后尚需通過酶與底物分子間形成更多的非共價健，生成酶與底物的過渡狀態(tài)互補的復合物(圖4-8)，才能完成酶的催化作用。實際上在上述更多的非共價健生成的過程中底物分子由原來的基態(tài)轉(zhuǎn)變成過渡狀態(tài)。即底物分子成為活化分子，為底物分子進行化學反應所需的基團的組合排布、瞬間的不穩(wěn)定的電荷的生成以及其他的轉(zhuǎn)化等提供了條件。所以過渡狀態(tài)不是一種穩(wěn)定的化學物質(zhì)，不同于反應過程中的中間產(chǎn)物。就分子的過渡狀態(tài)而言，它轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物(P)或轉(zhuǎn)變?yōu)榈孜?S)的概率是相等的。當酶與底物生成ES復合物并進一步形成過渡狀態(tài)，這過程已釋放較多

26、的結(jié)合能，現(xiàn)知這部分結(jié)合能可以抵消部分反應物分子活化所需的活化能，從而使原先低于活化能閾的分子也成為活化分子，于是加速化學反應的速度 (三)酶促反應作用機制1鄰近效應與定向排列2多元催化（multielement catalysis） 3表面效應(surface effect) 應該指出的是，一種酶的催化反應常常是多種催化機制的綜合作用，這是酶促反應高效率的重要原因。第五節(jié) 酶促反應的動力學酶促反應動力學是研究酶促反應速度和影響酶促反應速度的因素。許多因素如酶濃度、底物濃度、pH、溫度、激活劑和抑制劑等都能影響酶促反應的速度。在研究某一因素對酶反應速度的影響時，要使酶催化系統(tǒng)的其他因素不變，并

27、保持嚴格的反應初速度條件。如酶反應速度與酶濃度呈正比的條件，在此條件下酶催化系統(tǒng)所用的底物量足以飽和所有的酶，而生成的產(chǎn)物不足以影響酶催化效率，反應系統(tǒng)的其他條件如pH等未發(fā)生明顯改變。 動力學研究可為酶作用機制提供有價值的信息，也有助于確定酶作用的最適條件。應用抑制劑探討酶活性中心功能基團的組成，對酶的結(jié)構(gòu)與功能方面的研究甚至臨床實用方面的研究都有重要價值。一、酶濃度對酶促反應速度的影響在一定的溫度和pH條件下，當?shù)孜餄舛冗h大于酶的濃度時，酶反應速度與酶濃度成正比（圖4-11） 即 v=KE (1) 式中v為反應速度，K為反應速度常數(shù)， E代表酶濃度二、底物濃度對酶促反應速度的影響(一)底物

28、濃度曲線在酶濃度不變的情況下，底物濃度對反應速度的影響呈矩形雙曲線。 (二)米-曼氏(Michaelis-Menten)方程式體內(nèi)大多數(shù)酶均表現(xiàn)上述底物濃度與反應速度的關系，于是米曼兩人在前人工作的基礎上提出酶與底物首先形成中間復合物的學說，即： K1 K3 E+S ES E+P K2式中E、S、ES和P分別代表游離酶、底物、酶-底物復合物和反應產(chǎn)物。Kl為ES生成的反應速度常數(shù)，K2和K3分別代表ES分解為E+S和E+P的反應速度常數(shù)。他們假設在反應初速度條件下，P濃度很低，那末E+P逆向生成ES的反應可忽略不計；也假設S+E生成ES和由ES分解為E+S的反應為快反應并很快達到嚴衡，但ES分

29、解為E+P的反應為慢反應，它是整個反應過程的限速步驟，于是上述反應的反應速度為： v=K3 ES Km=（ K2+K3 ）/K1 。 Km 為常數(shù)， 可得到米曼氏方程式： v=VmaxS Km+S 式中v為反應速度，Vmax為所有酶被底物飽和時的最大反應速度，Km為米氏常數(shù)，這個方程式正確地說明底物濃度對酶反應速度的影響。當?shù)孜餄舛群艿?，即S<<Km時，(11)式分母上的S可以忽略不計，于是 v=VmaxS/ Km對一個酶來說，Vmax和Km均為常數(shù)，于是反應速度與底物濃度成正比關系。若底物濃度很高，即S>> Km，方程式(11)分母中Km可以忽略不計，于是 v=Vma

30、xS/S=Vmax此時再增加底物濃度，反應速度也不會增加。若S= Km，則方程式成為 v=VmaxS/2S= Vmax/2在S= Km時，反應速度正好為最大反應速度的一半，故只要知道酶的最大反應速度，即可知道達最大反應速度一半時所需的底物濃度，此底物濃度也就是該酶的Km，Km的單位與底物相同，均為mol/L（mol/L）.(三)米氏方程中的Km與Vmax的意義1. 當反應速度為最大速度一半時米氏方程式可以變換如下：進一步整理得Km =s。由此可見，Km值等于酶促反應速度為最大速度一半時的底物濃度。2Km = K2+K3 , 當K2>>K3,即ES解離成E和S的速度大大超過分解成E和

31、P的速K1度時,K3可以忽略不計.此時Km值近似于ES的解離常數(shù)Ks。在這種情況下，Km值可用來表示酶對底物的親和力。ES ESKm= K2/ K1=此時，Km值愈小，酶與底物的親和力愈大。這表示不需要很高的底物濃度便可容易地達到最大反應速度。但K3值并非在所有酶促反應中都遠小于K2，所以，此時Ks值和Km值的涵義不同，不能相互替代使用。3Km值是酶的特征性常數(shù)之一，只與酶的結(jié)構(gòu)、酶所催化的底物和反應環(huán)境（如溫度、pH、離子強度）有關，與酶的濃度無關。各種酶的Km值范圍很廣。對于同一底物，不同的酶有不同的Km值；多底物反應的酶對于不同底物也有不同的Km值。4Vmax是酶完全被底物飽和時的反應速

32、度，與酶濃度呈正比。如果酶的總濃度已知，便可從Vmax計算酶的轉(zhuǎn)換數(shù)（turnover number）.例如，10-6mol/L的碳酸酐酶溶液在一秒鐘內(nèi)催化生成0.6mol/L H2CO3，則每一分鐘酶可催化生成6×105個分子的H2CO3。k動力學常數(shù)K3稱為酶的轉(zhuǎn)換數(shù)，其定義是；當酶被底物充分飽和時，單位時間內(nèi)每個酶分子（或活性中心）催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù)。（四） Km和Vmax值的測定： 通過上述底物濃度曲線可以近似的測出Vmax和Km，但精確度差，且費時費力。為此人們將米氏方程式進行種種變換，應用最多的是將曲線作圖轉(zhuǎn)變?yōu)橹本€的雙倒數(shù)作圖法(Lineweave- Burk

33、plot)， 以1v對1/S作圖，得一條直線，其斜率為Kmv，直線與y軸相交的截距為1/v， 與軸相交的一點為-1Km(圖4-14)。 三、溫度對酶促反應速度的影響和酶作用的最適溫度化學反應的速度隨溫度升高而加速，酶促反應在一定溫度范圍內(nèi)也遵循這規(guī)律。但酶是蛋白質(zhì)，慍度升高可使酶變性失活，故以酶反應速度v對溫度作圖，可得一條鐘罩形曲線（圖4-17）。 曲線頂部所指的溫度稱為該酶的最適溫度(optimum temperature)。酶的最適溫度是溫度升高使酶促反應加速和使酶變性兩種拮抗因素作用的總和。故若酶促反應持續(xù)時間短，則溫度促使化學反應加速的影響大于對酶變性的影響，此條件下測得的最適溫度往

34、往偏高。反之若反應時間長，溫度導致酶失活的影響變?yōu)槊黠@，此時測得的最適溫度偏低(圖417)。 因此酶的最適溫度不是酶的特征性常數(shù)。 四、pH對酶促反應速度的影響和酶作用的最適pH酶促反應速度受介質(zhì)pH的影響，一種酶在幾種PH介質(zhì)中測其活力，可看到在某一pH 時酶促效率最高，這個pH稱為該酶的最適pH(optimun pH), 酶作用存在最適pH提示酶分子活性基團的電離狀態(tài)、底物分子及輔酶與輔基的電離狀態(tài)都與酶的催化作用相關，但酶的最適pH也不是酶的特征性常數(shù)，如緩沖液的種類與濃度，底物濃度等均可改變酶作用的最適pH。大多數(shù)酶的反應速度對pH的變化呈鐘罩形曲線（圖4-17）個別的只有鐘罩形的一半

35、(圖4-15b和c)。也有的酶，如木瓜蛋白酶的活力與反應液的pH變化關系不大。多數(shù)植物和微生物來源的酶，最適pH在4.5-6.5左右；動物酶的最適pH在6.58.0左右；個別也有例外；如胃蛋白酶的最適pH為，精氨酸酶的最適pH在9.8-10.0.。 五、激活劑的影響凡能提高酶活性，加速酶促反應進行的物質(zhì)都稱為該酶的激活劑(activator)。激活劑按其分子質(zhì)量大小可分為以下三種。(1)無機離子激活劑 (2)一些小分子的有機化合物 (3)生物大分子激活劑 六、抑制劑對酶促反應速度的影響能使酶活力降低的物質(zhì)稱為酶的抑制劑(inhibitor)。但強酸、強堿等造成酶變性失活不屬酶的抑制作用而稱酶的

36、鈍化?？梢娒傅囊种谱饔檬侵敢种苿┳饔孟旅富钚灾行幕虮匦杌鶊F發(fā)生性質(zhì)的改變并導致酶活性降低或喪失的過程。按抑制劑作用方式分為不可逆性抑制和可逆性抑制兩類。() 不可逆性抑制 (irreversible inhibition)不可逆性抑制作用的抑制劑以共價鍵與酶的必需基團結(jié)合，因結(jié)合甚牢不能用透析或超濾方法使兩者分開，故所造成的抑制作用是不可逆的。按抑制劑對酶必需基團選擇程度不同，又分非專一性和專一性抑制兩類。1非專一性不可逆性抑制作用 抑制劑與酶的一類或幾類基團結(jié)合抑制劑并不區(qū)分其結(jié)合的基團屬必需基團或非必需基團。如重金屬離子Pb2+、Cu2+、等和對氯汞苯甲酸與酶分子的巰基進行不可逆結(jié)合，化學

37、毒劑“路易士氣”則是一種含砷的化合物，它能抑制含巰基酶的活性重金屬離子與酶分子必需基團巰基結(jié)合是造成酶活性抑制的主要原因。二巰基丙醇或丁二酸鈉等含巰基的化合物，可以置換結(jié)合于酶分子上的重金屬離子而使酶恢復活性，因此臨床上用于搶救重金屬中毒的藥物 2、專一性不可逆性抑制作用 抑制劑專一性作用于酶活性中心的必需基團并導致酶活性的抑制。如二異丙基氟磷酸（diisopropyl phosphofluoride,DIFP）專一性地共價結(jié)合于膽堿酯酶活性中心的絲氨酸殘基的羥基，造成酶活性的抑制。有機磷農(nóng)藥，敵敵畏等具有與DIFP類似的結(jié)構(gòu)，它能使昆蟲膽堿酯酶磷酰話，而膽堿酯酶與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關。正常機體在

38、神經(jīng)興奮時，神經(jīng)末梢釋放出乙酰膽堿傳導刺激。乙酰膽堿發(fā)揮作用后，被乙酰膽堿酯酶水解為乙酸和膽堿。若膽堿酯酶被抑制，神經(jīng)末梢分泌的乙酰膽堿不能及時地分解掉，造成突觸間隙乙酰膽堿的積累，引起一系列膽堿能神經(jīng)過度興奮，如抽搐等癥狀，最后導致昆蟲死亡，但同樣的機制可使人畜受害，因此這類物質(zhì)又稱神經(jīng)毒劑。解磷定等藥物可以置換結(jié)合于膽堿酯酶上的磷?；謴兔富盍?，故用于搶救農(nóng)藥中毒病人。氰化物和一氧化碳等這些物質(zhì)能與金屬離子形成穩(wěn)定的絡合物，而使一些需要金屬離子的酶的活性受到抑制。如含鐵卟啉輔基的細胞色素氧化酶。 (二) 可逆性抑制作用（ reversible inhibition）抑制劑以非共價鍵與酶結(jié)

39、合，故不甚牢固，可用透析等物理方法把酶與抑制劑分開，使酶恢復催化活性，故稱為酶的可逆性抑制作用。根據(jù)抑制劑、底物與酶三者的相互關系，可逆性抑制又可分競爭性抑制(competitive inhibition)、非競爭性抑制(non competitive inhibition)和反競爭性抑制(uncompetitive inhibition)三種。1.競爭性抑制作用 抑制劑I的化學結(jié)構(gòu)與酶作用的底物S十分類似，它們都能與酶的活性中心結(jié)合，兩者對酶的結(jié)合有競爭作用。結(jié)合后分別形成EI或ES復合物。形成EI后酶不具催化作用，由此導致反應系統(tǒng)中游離酶濃度降低并使酶活性抑制(圖4-18a)。酶與抑制劑形

40、成EI后成為反應的死端，但生成的EI與E和I之間很快達到平衡，此時若增加底物濃度就增加了底物與酶形成ES的可能性。只要反應系統(tǒng)中加入的底物濃度足夠高，就有可能使全部EI解離為E和I，E和底物形成ES，從而恢復酶的全部活性。因此競爭性抑制的顯著特點是其抑制作用可用高濃度的底物來解除。經(jīng)典的例子是丙二酸競爭性地抑制琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸的反應。丙二酸只比琥珀酸少一個碳原子，故可與琥珀酸競爭與琥珀酸脫氫酶的活性中心結(jié)合，但酶不能催化丙二酸脫氫而形成死端，從而抑制琥珀酸脫氯酶的活力。此時增加反應系統(tǒng)中琥珀酸的濃度，可以解除丙二酸對酶的抑制作用。草酰乙酸，蘋果酸的化學結(jié)構(gòu)亦與琥珀酸相似，

41、它們亦是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。運用米氏萬程式推導的方法，演算出競爭性抑制的動力學方程式為：v=VmaxS Km(1+I/ ki )+S (13)式(13)中ki 為EI的解離常數(shù)，1為抑制劑濃度。把式(13)與米氏方程式相比，競爭性抑制劑的存在使Km增大了(1+1ki)倍，其增加的程度取決于ki 的大小和抑制劑的濃度，酶促反應速度v卻因Km項增大而減小，但最大反應速度Vmax不受競爭性抑制劑的影響。應用雙倒數(shù)法，競爭性抑制的動力學方程式以1v對1/S作圖，可以得到競爭性抑制的特征性曲線(圖4-19)。 由圖4-19可知，競爭性抑制劑存在時直線的斜率比無抑制劑存在時升高(1+1Ki)倍，直

42、線在橫軸的截距1Km(1+Iki)比無抑制劑時要小，也就是Km值增大，而直線與縱軸相交點1v并不因抑制劑存在而變化，亦即最大反應速度Vm不變。酶的競爭性抑制有重要的實際應用，很多藥物是酶的競爭性抑制劑。如磺胺類藥物的抑制作用就基于這一原理。細菌利用對氨基苯甲酸、二氫蝶呤及谷氨酸作原料，在二氫葉酸合成酶的催化下合成二氫葉酸，后者還可轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸，是細菌合成核酸所不可缺的輔酶?；前匪幍幕瘜W結(jié)構(gòu)與對氨基苯甲酸十分相似，故能與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶的活性中心，造成該酶活性抑制，進而減少四氫葉酸和核酸的合成，最終導致細菌繁殖生長停止。2.非競爭性抑制作用 非競爭性抑制劑可逆地與酶的非活性中心區(qū)

43、結(jié)合，故酶與抑制劑形成EI后，還可結(jié)合底物形成EIS。由于抑制劑不與底物競爭酶的活性中心，故稱為非競爭性抑制作用(4-18c)。 非競爭性抑制作用中增加底物濃度不能解除非競爭性抑制劑的抑制作用。用米氏方程式推導的方法可以演算出非競爭性抑制的動力學方程式： v= VmaxS (Km+S)(1+I/ki) (15)應用雙倒數(shù)式為以1v對 1/S 作圖，可得到非競爭性抑制的特征性曲線(圖4-20)。在有非競爭性抑制劑存在時，直線的斜率升高(1+1Ki)倍，直線與縱軸相交點亦比無抑制劑時升高(1+1Ki )倍，說明Vmax降低，但直線與橫軸相交點與無抑制劑時相同，即Km不受抑制劑影響。3.反競爭性抑制

44、作用：反競爭性抑制劑不直接與酶結(jié)合，而是與ES復合物結(jié)合，生成ESI后酶失去催化活性，造成酶的抑制(4-18b)。用米氏方程式推導，演算出反競爭性抑制動力學方程式為： v= VmaxS Km+S(1+I/ki) (17)改寫成雙倒數(shù)式后以1v對1/S作圖，可得到反競爭性抑制的持征性曲線(圖4-21)。由圖可知，反競爭性抑制劑使最大反應速度Vmax和Km均等地減少(1+I/ki)倍，但直線的斜率KmVmax不受抑制劑的影響，在用不同濃度反競爭性抑制劑時得到一組平行線。 比較酶的三種可逆性抑制的動力學第六節(jié)、其他類型的生物催化劑一、 核酶在1982年， Cech從四膜蟲rRNA前體的加工研究中首先觀察rRNA前體具有自我剪接作用，隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有些RNA分子也可以催化其自身或其他RNA分子進行的生化反應，這一發(fā)現(xiàn)打破了酶都是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念。對于具有催化活性的RNA現(xiàn)稱為核酶（ribozyme）至今發(fā)現(xiàn)