動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1、第十二章：動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 第一節(jié)第一節(jié) 體外培養(yǎng)動物細(xì)胞的生物學(xué)特征體外培養(yǎng)動物細(xì)胞的生物學(xué)特征 第二節(jié)第二節(jié) 動物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù) 第三節(jié)第三節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查和特性鑒定培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查和特性鑒定 第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞同步化細(xì)胞同步化 第五節(jié)第五節(jié) 器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)是用無菌操作的方法將動物體動物細(xì)胞培養(yǎng)是用無菌操作的方法將動物體內(nèi)的組織或器官取出，模擬動物體內(nèi)的生理內(nèi)的組織或器官取出，模擬動物體內(nèi)的生理條件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞的生長，條件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞的生長，發(fā)育及衰老等生命現(xiàn)象的技術(shù)。動

2、物細(xì)胞培發(fā)育及衰老等生命現(xiàn)象的技術(shù)。動物細(xì)胞培養(yǎng)有很多優(yōu)越性，但也有不足之處。養(yǎng)有很多優(yōu)越性，但也有不足之處。動物細(xì)胞培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)，免疫學(xué)，動物細(xì)胞培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)，免疫學(xué)，遺傳學(xué)，腫瘤學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，毒理學(xué)和臨遺傳學(xué)，腫瘤學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，毒理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)床醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)生產(chǎn)出了多種生物制品，如狂犬病疫苗，干生產(chǎn)出了多種生物制品，如狂犬病疫苗，干擾素，生長調(diào)節(jié)素。擾素，生長調(diào)節(jié)素。第一節(jié)體外培養(yǎng)動物細(xì)胞的生物學(xué)特征第一節(jié)體外培養(yǎng)動物細(xì)胞的生物學(xué)特征一、體外培養(yǎng)物的細(xì)胞生物學(xué)特點（一）生物學(xué)特征的兩重性 1、基本生物學(xué)特征與體

3、內(nèi)細(xì)胞相似 體外培養(yǎng)的細(xì)胞不僅存在細(xì)胞和基質(zhì)的相互關(guān)系， 而且細(xì)胞和細(xì)胞之間在形態(tài)和機能上還存在著相互關(guān)系 2、差異性 細(xì)胞離體后，失去神經(jīng)和體液調(diào)節(jié)以及細(xì)胞間的相互影響，在體外培養(yǎng)條件下可能會出現(xiàn)分化現(xiàn)象減弱，形態(tài)功能單一化，生存一定時間后衰退死亡，出現(xiàn)連續(xù)生長的細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系等。因此體外培養(yǎng)的細(xì)胞可視為一種在特定條件下的細(xì)胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本機構(gòu)和功能，也有不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。（二）培養(yǎng)細(xì)胞分化狀態(tài)的改變（二）培養(yǎng)細(xì)胞分化狀態(tài)的改變1、分化在個體發(fā)育的過程中，細(xì)胞后代的形態(tài)和功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異過程稱為細(xì)胞分化。細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，其原有的功能可能會迅速改變或消失，

4、但其分化能力并未完全喪失。細(xì)胞是否分化，關(guān)鍵是在于是否存在使細(xì)胞分化的條件，把表皮細(xì)胞放在企業(yè)界面上培養(yǎng)，可分化成含大量角蛋白絲的膠質(zhì)細(xì)胞，但這種能力會隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸喪失。2、去分化去分化也叫脫分化是指各種分化細(xì)胞，逐漸失去各自的形態(tài)與功能個性，表現(xiàn)出某種趨同性的過程。二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)當(dāng)細(xì)胞初一較好的培養(yǎng)條件時，形態(tài)上有相對的一致性。在一定程度上能反映細(xì)胞的起源以及正常和異常的區(qū)別，故可作為細(xì)胞形態(tài)學(xué)的一個指標(biāo)或依據(jù)。但它可受很多因素的影響而發(fā)生改變。（一）貼附型細(xì)胞和懸浮型細(xì)胞1、貼附型細(xì)胞（見下圖） 1） 成纖維細(xì)胞型 2 ）上皮細(xì)胞型 3 ）游走細(xì)胞型

5、 4 ）多形細(xì)胞型2、懸浮性細(xì)胞懸浮性細(xì)胞（二）細(xì)胞帖壁過程（二）細(xì)胞帖壁過程對于貼壁型細(xì)胞，在液體環(huán)境中生長時，基本呈圓形，當(dāng)附于支持物表面后，開始仍為圓形，但很快會發(fā)生形態(tài)上的改變，轉(zhuǎn)變?yōu)閳A餅形即放射延展細(xì)胞。在1/2至2小時后，過渡為極性細(xì)胞，可呈紡錘形，三角形或不規(guī)則多角形等各種形態(tài)。支持物能影響貼附，底物表面不潔不利于貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附，一些特殊物質(zhì)如LETS，細(xì)胞表面蛋白等也參與貼附過程。（三）接觸抑制和密度抑制（三）接觸抑制和密度抑制細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中，細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長空間漸趨減少，最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如果培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的

6、相互接觸能抑制細(xì)胞的運動，這種現(xiàn)象稱接接觸抑制觸抑制當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。三、培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力三、培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力 體內(nèi)細(xì)胞生長處于動態(tài)平衡環(huán)境中，而體外培養(yǎng)細(xì)胞的生體內(nèi)細(xì)胞生長處于動態(tài)平衡環(huán)境中，而體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或其他容器。生存空間和營養(yǎng)是存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或其他容器。生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)增殖到一定密度時，則需分離出一部分細(xì)胞并有限的。當(dāng)增殖到一定密度時，則需分離出一部分細(xì)胞并跟新營養(yǎng)液，否則將會影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程稱跟新營養(yǎng)液，否則將

7、會影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程稱傳代傳代（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期、（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期、 培養(yǎng)細(xì)胞生命期是指細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)增殖和生培養(yǎng)細(xì)胞生命期是指細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)增殖和生長的時間。正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，不論細(xì)胞的種類和供長的時間。正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，不論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何，在細(xì)胞生存全過程中，基本經(jīng)歷以下三個體的年齡如何，在細(xì)胞生存全過程中，基本經(jīng)歷以下三個階段階段。1、原代培養(yǎng)基、原代培養(yǎng)基原代培養(yǎng)基也稱初代培養(yǎng)基，即從動物機體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一原代培養(yǎng)基也稱初代培養(yǎng)基，即從動物機體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)一到四周。此期的細(xì)胞移動活躍，可見

8、細(xì)胞活次傳代階段，一般持續(xù)一到四周。此期的細(xì)胞移動活躍，可見細(xì)胞活躍，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。原代培養(yǎng)的細(xì)胞于體內(nèi)相應(yīng)的細(xì)胞性躍，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。原代培養(yǎng)的細(xì)胞于體內(nèi)相應(yīng)的細(xì)胞性狀相似，更能代表其來源組織的細(xì)胞類型及組織特異性。狀相似，更能代表其來源組織的細(xì)胞類型及組織特異性。2、傳代期、傳代期初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱為細(xì)胞系。此期最長，細(xì)胞增殖旺盛，初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱為細(xì)胞系。此期最長，細(xì)胞增殖旺盛，能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期冷凍。如不冷凍

9、則要反復(fù)倍體細(xì)胞性質(zhì)應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期冷凍。如不冷凍則要反復(fù)傳代。一般，傳代十至五十次左右，細(xì)胞增殖逐漸減慢，甚至停止，傳代。一般，傳代十至五十次左右，細(xì)胞增殖逐漸減慢，甚至停止，進(jìn)入衰退期。進(jìn)入衰退期。3、衰退期、衰退期衰退期的細(xì)胞雖然能存活，但增殖很慢并逐漸停止，進(jìn)而發(fā)生衰退死亡衰退期的細(xì)胞雖然能存活，但增殖很慢并逐漸停止，進(jìn)而發(fā)生衰退死亡傳代細(xì)胞由于目中因素的影響，可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化，其標(biāo)志傳代細(xì)胞由于目中因素的影響，可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化，其標(biāo)志是細(xì)胞獲得永生性或惡性性。細(xì)胞永生性也稱不死性，即是細(xì)胞獲得永生性或惡性性。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲得永久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無

10、限細(xì)胞系。細(xì)胞獲得永久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。轉(zhuǎn)化細(xì)胞除了比細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。轉(zhuǎn)化細(xì)胞除了比正常細(xì)胞能分裂更多的代數(shù)之外，還具有不受細(xì)胞密度的正常細(xì)胞能分裂更多的代數(shù)之外，還具有不受細(xì)胞密度的影響，不具有接觸抑制現(xiàn)象和細(xì)胞形狀不規(guī)則，出現(xiàn)異常影響，不具有接觸抑制現(xiàn)象和細(xì)胞形狀不規(guī)則，出現(xiàn)異常染色體的特性。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。染色體的特性。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。（二）培養(yǎng)細(xì)胞（二）培養(yǎng)細(xì)胞“一代一代”生存期生存期 體外培養(yǎng)的細(xì)胞當(dāng)生長達(dá)到一定密度后，都需要做傳代體外培養(yǎng)的細(xì)胞當(dāng)生長達(dá)到一定密度后，都需要做

11、傳代處理。處理。 所謂細(xì)胞所謂細(xì)胞“一代一代”是指從細(xì)胞接種到分離在培養(yǎng)是指從細(xì)胞接種到分離在培養(yǎng)時的一段時間。它與細(xì)胞世代和倍增不同，在細(xì)胞一代中，時的一段時間。它與細(xì)胞世代和倍增不同，在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增三至六次。每一代的細(xì)胞群體都會經(jīng)歷以下四細(xì)胞能倍增三至六次。每一代的細(xì)胞群體都會經(jīng)歷以下四個階段：個階段：1、潛伏期、潛伏期 2、對數(shù)生長期、對數(shù)生長期 3、穩(wěn)定期、穩(wěn)定期 4、衰亡、衰亡期期1、潛伏期：、潛伏期：細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中懸浮狀態(tài)的懸浮期，細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中懸浮狀態(tài)的懸浮期，此時細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于第五表面上的

12、此時細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于第五表面上的過程，稱為貼壁，懸浮期結(jié)束。過程，稱為貼壁，懸浮期結(jié)束。細(xì)胞貼附于支持物后，要經(jīng)過一個潛伏階段，才進(jìn)入生長和增殖期。細(xì)胞處細(xì)胞貼附于支持物后，要經(jīng)過一個潛伏階段，才進(jìn)入生長和增殖期。細(xì)胞處于潛伏期可有運動行為，基本無增殖，少見分裂相。細(xì)胞潛伏期和細(xì)胞密度、于潛伏期可有運動行為，基本無增殖，少見分裂相。細(xì)胞潛伏期和細(xì)胞密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，24至至96h或更長，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅或更長，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅

13、624h；細(xì)胞接種密度大時潛；細(xì)胞接種密度大時潛伏期短。伏期短。2、對數(shù)生長期、對數(shù)生長期：當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入對：當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入對數(shù)生長期。這是細(xì)胞增長最旺盛的階段。對數(shù)生長期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為數(shù)生長期。這是細(xì)胞增長最旺盛的階段。對數(shù)生長期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)MI表示，即細(xì)表示，即細(xì)胞群中每胞群中每1000個細(xì)胞中的分裂相數(shù)。個細(xì)胞中的分裂相數(shù)。MI=（分裂相個數(shù)（分裂相個數(shù)/1000個細(xì)胞）個細(xì)胞）100%3、穩(wěn)定期、穩(wěn)

14、定期細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞逐漸停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時細(xì)胞數(shù)量不細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞逐漸停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)再增加，故也稱平頂期。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)逐漸耗盡，代謝產(chǎn)物積累，液中營養(yǎng)逐漸耗盡，代謝產(chǎn)物積累，ph降低。此時需做分離培養(yǎng)培養(yǎng)即傳代，降低。此時需做分離培養(yǎng)培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，甚至從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。否則細(xì)胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，甚至從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。4、衰亡期、衰亡期一個達(dá)到穩(wěn)定生長期的細(xì)胞群體，由于生長環(huán)境

15、的繼續(xù)惡化和營養(yǎng)物質(zhì)的短一個達(dá)到穩(wěn)定生長期的細(xì)胞群體，由于生長環(huán)境的繼續(xù)惡化和營養(yǎng)物質(zhì)的短缺，群體中細(xì)胞死亡率則逐漸上升，以致細(xì)胞死亡數(shù)逐漸超過新生細(xì)胞數(shù)，缺，群體中細(xì)胞死亡率則逐漸上升，以致細(xì)胞死亡數(shù)逐漸超過新生細(xì)胞數(shù)，群體中活細(xì)胞數(shù)下降。群體中活細(xì)胞數(shù)下降。（二）原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)（二）原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)1、原代培養(yǎng)、原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)即第一次培養(yǎng)，是指將培養(yǎng)物放置在體外原代培養(yǎng)即第一次培養(yǎng)，是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。由于原代細(xì)胞離體時間短，其原有的生物過程。由于原代細(xì)胞離體時間短，其原有的生物學(xué)特征仍然保

16、持。一般在原代培養(yǎng)時期合適于作學(xué)特征仍然保持。一般在原代培養(yǎng)時期合適于作藥物測試，細(xì)胞分化等方面的研究。藥物測試，細(xì)胞分化等方面的研究。（1）組織塊培養(yǎng)法）組織塊培養(yǎng)法1）薄層培養(yǎng)法）薄層培養(yǎng)法2）翻轉(zhuǎn)干涸法）翻轉(zhuǎn)干涸法 1、取材修剪沖洗 2、剪切成1mm3 小塊 3、移入培養(yǎng)瓶 4、分布組織小塊間距5mm 5翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并加培養(yǎng)液37*c靜止12h 6、翻正培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng) 7、原代細(xì)胞培養(yǎng)（2）分散細(xì)胞培養(yǎng)法）分散細(xì)胞培養(yǎng)法1）機械分散法）機械分散法采用一些纖維成分很少的組織進(jìn)行培養(yǎng)時，可以直接用分散法采用一些纖維成分很少的組織進(jìn)行培養(yǎng)時，可以直接用分散法進(jìn)行分散?？蓪⒔M織直接用剪刀剪切，用吸

17、管吸打，這種進(jìn)行分散?？蓪⒔M織直接用剪刀剪切，用吸管吸打，這種對組織損傷較大，一般可用注射器針心擠壓通過不銹鋼網(wǎng)對組織損傷較大，一般可用注射器針心擠壓通過不銹鋼網(wǎng)的方法。的方法。2）消化分散法）消化分散法使用生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞的使用生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞的方法。消化培養(yǎng)法可以將細(xì)胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等去除，方法。消化培養(yǎng)法可以將細(xì)胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等去除，是的細(xì)胞分散，形成懸液，適用于大量組織的分離。常用是的細(xì)胞分散，形成懸液，適用于大量組織的分離。常用的消化液有胰蛋白酶，膠原酶。另外，鏈酶蛋白酶，黏蛋的消化液有胰蛋白酶，膠原酶。另外，

18、鏈酶蛋白酶，黏蛋白酶，蝸牛酶等也可以用于細(xì)胞的分化。白酶，蝸牛酶等也可以用于細(xì)胞的分化。膠原酶膠原酶是從細(xì)菌中提取的酶，對膠原和細(xì)胞間質(zhì)有較強的消化是從細(xì)菌中提取的酶，對膠原和細(xì)胞間質(zhì)有較強的消化作用，適用于分離纖維性組織，上皮組織和癌組織，作用，適用于分離纖維性組織，上皮組織和癌組織，Ga Mg 和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，作用溫和，無和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，作用溫和，無須機械振動。其常用量為須機械振動。其常用量為200iu/ml胰蛋白酶胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細(xì)作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞

19、分離。胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。2、傳代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞持續(xù)生長增殖一段時間到達(dá)一定的細(xì)胞密度后，就應(yīng)當(dāng)細(xì)胞持續(xù)生長增殖一段時間到達(dá)一定的細(xì)胞密度后，就應(yīng)當(dāng)將細(xì)胞分離到新的培養(yǎng)器皿并補充新的培養(yǎng)培養(yǎng)液進(jìn)行當(dāng)將細(xì)胞分離到新的培養(yǎng)器皿并補充新的培養(yǎng)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，即為細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。在首次培養(yǎng)應(yīng)注意以下幾點：培養(yǎng)，即為細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。在首次培養(yǎng)應(yīng)注意以下幾點：1細(xì)胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不細(xì)胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代，要急于傳代，2原代培養(yǎng)時細(xì)胞多為混雜生長，上皮樣細(xì)原代培養(yǎng)時細(xì)胞多為混雜生長，上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞并

20、存的情況很多見，傳代時不同的細(xì)胞胞和成纖維樣細(xì)胞并存的情況很多見，傳代時不同的細(xì)胞有不同的傳代時間，因而要根據(jù)需要注意觀察并及時進(jìn)行有不同的傳代時間，因而要根據(jù)需要注意觀察并及時進(jìn)行處理，處理，3首次傳代時細(xì)胞接種數(shù)量要多些，使細(xì)胞盡快適首次傳代時細(xì)胞接種數(shù)量要多些，使細(xì)胞盡快適應(yīng)新的環(huán)境而李宇細(xì)胞生存和增殖。應(yīng)新的環(huán)境而李宇細(xì)胞生存和增殖。貼壁細(xì)胞的傳代大都采用酶消化法來進(jìn)行。部分貼壁生長的貼壁細(xì)胞的傳代大都采用酶消化法來進(jìn)行。部分貼壁生長的細(xì)胞可用直接吹打或離心分離后傳代。懸浮細(xì)胞可直接傳細(xì)胞可用直接吹打或離心分離后傳代。懸浮細(xì)胞可直接傳代。代。 （1）貼壁細(xì)胞的消化法傳代 （2）懸浮細(xì)胞

21、的傳代（三）細(xì)胞純化（三）細(xì)胞純化1、自然純化、自然純化自然純化是利用某一細(xì)胞的增殖優(yōu)勢，而排擠其他細(xì)胞生長，最后留下生長優(yōu)勢細(xì)自然純化是利用某一細(xì)胞的增殖優(yōu)勢，而排擠其他細(xì)胞生長，最后留下生長優(yōu)勢細(xì)胞，去除其他細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。胞，去除其他細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。2、人工純化、人工純化（1）酶消化法）酶消化法： 1）先用）先用0，5%胰蛋白酶和胰蛋白酶和0，02%EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞，然后）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞，然后再換新的混合液繼續(xù)消化，之后在導(dǎo)致的顯微鏡下觀察并不時搖動培養(yǎng)瓶，等再換新的混合液繼續(xù)消化，之后在導(dǎo)致的顯微鏡下觀察并不時搖動培養(yǎng)瓶，等到半數(shù)細(xì)胞脫落下來

22、后，便立即停止消化。到半數(shù)細(xì)胞脫落下來后，便立即停止消化。 2）吧消化液吸入離心管中，離心去上清，然后移入另一培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液）吧消化液吸入離心管中，離心去上清，然后移入另一培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)，再向原瓶中也不加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過幾次反復(fù)處理，置溫箱中培養(yǎng)，再向原瓶中也不加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過幾次反復(fù)處理，可把成纖維細(xì)胞除凈?？砂殉衫w維細(xì)胞除凈。（2）機械刮除法）機械刮除法 1)標(biāo)記標(biāo)記 鏡下觀察，在培養(yǎng)皿背面圈下上皮細(xì)胞生長部位鏡下觀察，在培養(yǎng)皿背面圈下上皮細(xì)胞生長部位 2)刮除刮除 棄培養(yǎng)基，把無菌刀深入瓶中，肉眼或顯微鏡下刮除無標(biāo)記空間棄培養(yǎng)基，把無菌刀深入瓶中，肉

23、眼或顯微鏡下刮除無標(biāo)記空間 3)沖洗沖洗 用用hanks液沖洗液沖洗1或或2次，洗出被掛掉的細(xì)胞次，洗出被掛掉的細(xì)胞 4）培養(yǎng)）培養(yǎng) 然后注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞存留，可重刮除然后注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞存留，可重刮除（3）反復(fù)貼壁法）反復(fù)貼壁法 操作方法與貼壁細(xì)胞傳代基本相同操作方法與貼壁細(xì)胞傳代基本相同（4）克隆法）克隆法（5）流式細(xì)胞儀技術(shù)）流式細(xì)胞儀技術(shù)（6）其他純化方法）其他純化方法（四）細(xì)胞的凍存復(fù)蘇及運輸（四）細(xì)胞的凍存復(fù)蘇及運輸1、細(xì)胞冷凍保存、細(xì)胞冷凍保存（1）細(xì)胞超低溫保存的原理）細(xì)胞超低溫保存的原理細(xì)胞在細(xì)胞在-70*c以下時，細(xì)胞內(nèi)的酶活

24、性降低，代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長以下時，細(xì)胞內(nèi)的酶活性降低，代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵在于通過期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵在于通過-200*c階段的處理過程。在此溫度范階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，易造成細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。如果不加保護(hù)直接冷凍，細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)晶，圍內(nèi)，易造成細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。如果不加保護(hù)直接冷凍，細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)晶，導(dǎo)致胞內(nèi)電解質(zhì)濃度增高，導(dǎo)致胞內(nèi)電解質(zhì)濃度增高，ph改變，部分蛋白質(zhì)變性，溶酶體膜受損而導(dǎo)致改變，部分蛋白質(zhì)變性，溶酶體膜受損而導(dǎo)致溶解酶釋放破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而造成細(xì)胞死亡。因此，為了減少細(xì)胞內(nèi)的冰溶解酶釋放破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而造成細(xì)胞死亡。

25、因此，為了減少細(xì)胞內(nèi)的冰晶形成，一般在培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑以減少冰晶形成和細(xì)胞死亡。晶形成，一般在培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑以減少冰晶形成和細(xì)胞死亡。根據(jù)冷凍保護(hù)劑是否透過細(xì)胞膜可將其分為：根據(jù)冷凍保護(hù)劑是否透過細(xì)胞膜可將其分為：1滲透性保護(hù)劑滲透性保護(hù)劑2非滲透性保護(hù)劑非滲透性保護(hù)劑最常用的保護(hù)劑為最常用的保護(hù)劑為dmso本身對細(xì)菌有毒性作用，可自身滅菌。本身對細(xì)菌有毒性作用，可自身滅菌。（2）細(xì)胞冷凍過程）細(xì)胞冷凍過程將對數(shù)期細(xì)胞以等體積將對數(shù)期細(xì)胞以等體積20%DMSO培養(yǎng)液重懸，并分裝于冷凍管或安培平中，封培養(yǎng)液重懸，并分裝于冷凍管或安培平中，封口，然后降溫至口，然后降溫至4*c30min，冰盒

26、，冰盒10min，液氮罐氣相，液氮罐氣相2h，最后投入液氮中保，最后投入液氮中保存。存。2、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇（1）離心法）離心法1）取出冷凍管，迅速投入）取出冷凍管，迅速投入3740*c水浴中，振蕩，使之融化。水浴中，振蕩，使之融化。2）吸入到）吸入到10ml的培養(yǎng)液中，混懸，離心洗滌的培養(yǎng)液中，混懸，離心洗滌1或或2次次3）取上清加培養(yǎng)液，調(diào)濃度為）取上清加培養(yǎng)液，調(diào)濃度為1*1052*105個個/ml（2）直接鋪板法）直接鋪板法取貯存細(xì)胞，取貯存細(xì)胞，37*c水浴中快速融化，移入完全生長培養(yǎng)集中，進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，水浴中快速融化，移入完全生長培養(yǎng)集中，進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，密度密度3

27、*105個個/ml 培養(yǎng)培養(yǎng)1224小時，更換新鮮的完全生長培養(yǎng)基，以去除冷小時，更換新鮮的完全生長培養(yǎng)基，以去除冷凍劑。凍劑。3.細(xì)胞運輸1冷凍儲存運輸2充液法1）選生長良好的細(xì)胞，待接近或剛連接成片時去掉培養(yǎng)液，充新培養(yǎng)液，液量達(dá)到瓶頸部，擰緊螺帽，保留微量空氣；2）妥善包轉(zhuǎn)運送，瓶口用膠帶密封，并用棉花等做防震防壓處理。3）到目的地后，倒出大部分培養(yǎng)液，僅保留維持細(xì)胞生長所需液量，置于37*c培養(yǎng)，次日傳代二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法（一）懸滴培養(yǎng)法（二）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法（三）培養(yǎng)板培養(yǎng)法（四）旋轉(zhuǎn)管 培養(yǎng)法（五）灌注小室培養(yǎng)法（六）克隆培養(yǎng)法六、單細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)主

28、要分為三種，即多孔塑料板克隆六、單細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)主要分為三種，即多孔塑料板克隆細(xì)胞法、瓊脂培養(yǎng)法和飼養(yǎng)細(xì)胞層克隆法細(xì)胞法、瓊脂培養(yǎng)法和飼養(yǎng)細(xì)胞層克隆法1、多孔塑料板克隆細(xì)胞法多孔塑料板克隆細(xì)胞法首先將細(xì)胞懸液混合均勻，在每孔內(nèi)加入，首先將細(xì)胞懸液混合均勻，在每孔內(nèi)加入，0，1ml的細(xì)胞懸液。加完后的細(xì)胞懸液。加完后迅速蓋好蓋板，鏡檢，記錄含有單個細(xì)胞的孔。觀察時要特別注意孔迅速蓋好蓋板，鏡檢，記錄含有單個細(xì)胞的孔。觀察時要特別注意孔底邊緣，凡不能確認(rèn)者不要計算在內(nèi)，用筆標(biāo)記。然后于底邊緣，凡不能確認(rèn)者不要計算在內(nèi)，用筆標(biāo)記。然后于co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。等到培養(yǎng)板孔內(nèi)細(xì)胞增至進(jìn)

29、行原代和傳代培養(yǎng)。等到培養(yǎng)板孔內(nèi)細(xì)胞增至500600個時，可以個時，可以進(jìn)行分離培養(yǎng)。進(jìn)行分離培養(yǎng)。2、瓊脂培養(yǎng)、瓊脂培養(yǎng)當(dāng)瓊脂凝固時，可以把細(xì)胞接種在瓊脂表面，生長成克隆后，容易分離，當(dāng)瓊脂凝固時，可以把細(xì)胞接種在瓊脂表面，生長成克隆后，容易分離，適于做單細(xì)胞克隆。此外，也可以用營養(yǎng)液配成軟瓊脂，在溶解狀態(tài)適于做單細(xì)胞克隆。此外，也可以用營養(yǎng)液配成軟瓊脂，在溶解狀態(tài)下把細(xì)胞與之混合起來，細(xì)胞在松軟的瓊脂中攝取營養(yǎng)和生長，軟瓊下把細(xì)胞與之混合起來，細(xì)胞在松軟的瓊脂中攝取營養(yǎng)和生長，軟瓊脂培養(yǎng)是測定克隆形成率及測試轉(zhuǎn)化細(xì)胞形狀的重要手段。脂培養(yǎng)是測定克隆形成率及測試轉(zhuǎn)化細(xì)胞形狀的重要手段。3、飼

30、養(yǎng)細(xì)胞層克隆法、飼養(yǎng)細(xì)胞層克隆法此法是將飼養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)兩天后，即可接種準(zhǔn)備克隆的此法是將飼養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)兩天后，即可接種準(zhǔn)備克隆的細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞也稱為滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過特殊處理的用做克隆底細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞也稱為滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過特殊處理的用做克隆底物的細(xì)胞層物的細(xì)胞層三、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)三、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是指在人工條件下，在細(xì)胞生物反動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是指在人工條件下，在細(xì)胞生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法。應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法。（一）動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法（一）動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法動物細(xì)胞與微生物細(xì)胞

31、相比有顯著差別：動物細(xì)胞與微生物細(xì)胞相比有顯著差別：1）動物細(xì)胞比微）動物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大的多，無細(xì)胞壁，耐機械強度低，對剪切力敏生物細(xì)胞大的多，無細(xì)胞壁，耐機械強度低，對剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差感，適應(yīng)環(huán)境能力差2）倍增時間長，生長緩慢，易受微）倍增時間長，生長緩慢，易受微生物感染，培養(yǎng)時需要抗生素生物感染，培養(yǎng)時需要抗生素3）培養(yǎng)過程需氧量少）培養(yǎng)過程需氧量少4）培）培養(yǎng)過程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在養(yǎng)過程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在5）原代培養(yǎng)細(xì)胞）原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖一般繁殖50代即退化死亡代即退化死亡 6）代謝產(chǎn)物具有生物活性，）代謝產(chǎn)物具有生物活性， 生產(chǎn)成本高，但附加值也高

32、生產(chǎn)成本高，但附加值也高1、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)2、反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)、反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)3、懸浮培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)4、固定化培養(yǎng)、固定化培養(yǎng) 是將動物細(xì)胞與非水溶性載體結(jié)合起來，在生物反應(yīng)器中是將動物細(xì)胞與非水溶性載體結(jié)合起來，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的方法。進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的方法。固定化培養(yǎng)（1）微載體系統(tǒng)1)微載體法2）多空載體或大孔微載體法其優(yōu)點：1比表面積大，是實心微載體的幾 倍甚至幾十倍2細(xì)胞在孔內(nèi)生長，受到保護(hù)，剪切損傷少3細(xì)胞三維生長，細(xì)胞密度是實心微載體的十倍以上，有的可達(dá)108個/ml 4適用于長期維持培養(yǎng)5實心載體在培養(yǎng)液中濃度怎大到一定時，細(xì)胞密度反而下降，大孔微載體在濃度較高時，

33、表面碰撞增加，能促使細(xì)胞在孔內(nèi)生長6最適合與蛋白質(zhì)生產(chǎn)，因此有人預(yù)言，大孔微載體技術(shù)將成為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的一種常用方式。（2）中空纖維培養(yǎng)技術(shù)(3)微囊培養(yǎng)系統(tǒng)（二）動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器種類（二）動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器種類1、攪拌式生物反應(yīng)器、攪拌式生物反應(yīng)器 1）供養(yǎng)方式）供養(yǎng)方式 一般情況下，攪拌式反應(yīng)器常伴有鼓泡，為細(xì)胞生長提供一般情況下，攪拌式反應(yīng)器常伴有鼓泡，為細(xì)胞生長提供所需養(yǎng)分。因動物細(xì)胞對鼓泡敏感，所以對供養(yǎng)方式進(jìn)行改進(jìn)，生產(chǎn)了籠式所需養(yǎng)分。因動物細(xì)胞對鼓泡敏感，所以對供養(yǎng)方式進(jìn)行改進(jìn)，生產(chǎn)了籠式供養(yǎng)方式的動物細(xì)胞反應(yīng)器。特點是既能保證混合效果又有竟可能小

34、的剪切供養(yǎng)方式的動物細(xì)胞反應(yīng)器。特點是既能保證混合效果又有竟可能小的剪切力，以滿足細(xì)胞生長的要求。力，以滿足細(xì)胞生長的要求。 2）攪拌器）攪拌器 改進(jìn)中，再攪拌器較薄而面積較大，或攪拌角較大而攪拌速改進(jìn)中，再攪拌器較薄而面積較大，或攪拌角較大而攪拌速度較低的情況下，可顯著降低剪切力。度較低的情況下，可顯著降低剪切力。2、氣升式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器 其是以氣體為動力，靠導(dǎo)流裝置引導(dǎo)，形成氣液混合式的總體有序循環(huán)。其是以氣體為動力，靠導(dǎo)流裝置引導(dǎo)，形成氣液混合式的總體有序循環(huán)。3、填充床反應(yīng)器、填充床反應(yīng)器填充床反應(yīng)器中，細(xì)胞可以位于支持物表面，也可以包埋于支持物之中，培填充床反應(yīng)器中，細(xì)

35、胞可以位于支持物表面，也可以包埋于支持物之中，培養(yǎng)物流經(jīng)支持物顆粒。細(xì)胞被固定于支持物之中時，填充床反應(yīng)器每單位體養(yǎng)物流經(jīng)支持物顆粒。細(xì)胞被固定于支持物之中時，填充床反應(yīng)器每單位體積能容納大量細(xì)胞。但是，填充床式固定化細(xì)胞反應(yīng)器存在許多缺點。由于積能容納大量細(xì)胞。但是，填充床式固定化細(xì)胞反應(yīng)器存在許多缺點。由于其混合效果低，對必要的氧傳遞其混合效果低，對必要的氧傳遞,ph,溫度控制和氣體產(chǎn)物的排除造成了困難。溫度控制和氣體產(chǎn)物的排除造成了困難。4、流化床反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器 其是通過流體的上升運動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)即流化狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)的其是通過流體的上升運動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)即流化狀

36、態(tài)進(jìn)行反應(yīng)的裝置。有魚固體顆粒和流體充分地進(jìn)行混合，因而流化床反應(yīng)器具有傳熱傳裝置。有魚固體顆粒和流體充分地進(jìn)行混合，因而流化床反應(yīng)器具有傳熱傳質(zhì)性能好，可使用較小顆粒催化劑，床層壓力小等特點。但同時也帶來固體質(zhì)性能好，可使用較小顆粒催化劑，床層壓力小等特點。但同時也帶來固體催化劑磨損較大的不足。催化劑磨損較大的不足。 （三）大規(guī)模培養(yǎng)操作方式可分為分批式，流加式，半連續(xù)式，連續(xù)式和灌流式。其中，分批式，半連續(xù)式，連續(xù)式和植物細(xì)胞培養(yǎng)基本相同。1、分批式培養(yǎng)分批式培養(yǎng)是將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過程中和外界沒有物料交換。其體積不變，到細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成

37、積累到一定時間，一次性收獲細(xì)胞和產(chǎn)物。周期一般在三到五天，收獲產(chǎn)物一般是在細(xì)胞快要死亡或已經(jīng)死亡后進(jìn)行。2、流加式培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜環(huán)境下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，根據(jù)細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基，流加速度和消耗的速率相同按底物濃度控制相應(yīng)的流加過程，從而使細(xì)胞持續(xù)生長至較高的濃度，目標(biāo)產(chǎn)物達(dá)到較高的水平。通常流加多在指數(shù)生長后期，細(xì)胞在進(jìn)入衰退期之前，添加高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)。在細(xì)胞衰亡后終止整個體系，進(jìn)行分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮，純化產(chǎn)物。其特點是能調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)物的濃度。一，可以避免因某種營養(yǎng)成分初始濃度太高而產(chǎn)生抑制現(xiàn)象。二，能防

38、止某些限制性成分在培養(yǎng)過程中被耗盡而影響而影響細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的生成，這是流加式操作和分批式操作的明顯不同。此外，由于新鮮營養(yǎng)液的加入，整個過程中反應(yīng)體積變化，這也是其重要特征。3、半連續(xù)式培養(yǎng)、半連續(xù)式培養(yǎng)、其特點是培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物的體積逐漸增加，反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持其特點是培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物的體積逐漸增加，反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變；細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培不變；細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長時間；可進(jìn)行多次回收。養(yǎng)過程可延續(xù)到很長時間；可進(jìn)行多次回收。4、連續(xù)式培養(yǎng)、連續(xù)式培養(yǎng)是一種常見的懸浮培養(yǎng)

39、模式，采用機械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該模式事將是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，采用機械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該模式事將細(xì)胞接種于一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細(xì)胞達(dá)到最大細(xì)胞接種于一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細(xì)胞達(dá)到最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)田間新鮮培養(yǎng)基。同時，含有細(xì)胞密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)田間新鮮培養(yǎng)基。同時，含有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過程可以無限連續(xù)下去。其優(yōu)點是反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，講，該過程可以無限連續(xù)下去

40、。其優(yōu)點是反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。細(xì)胞濃度以及細(xì)胞的生長速率可維持不變。細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。細(xì)胞濃度以及細(xì)胞的生長速率可維持不變。5、灌流式培養(yǎng)、灌流式培養(yǎng)是把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷是把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷將部分條件培養(yǎng)基取出，同時又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式將部分條件培養(yǎng)基取出，同時又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式培養(yǎng)的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器培養(yǎng)的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在

41、取培養(yǎng)物的同時也取出了部分細(xì)胞。灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點：內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物的同時也取出了部分細(xì)胞。灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點：細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)107109個個/mL，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量。連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量。連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞穩(wěn)定的處在較好的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；反應(yīng)速率容易穩(wěn)定的處在較好的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；產(chǎn)品在罐內(nèi)停留控制，培養(yǎng)周期較長，可提高生產(chǎn)率，

42、目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。這種方法最大時間短，可及時回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。這種方法最大困難是污染概率較高，且存在長期培養(yǎng)中保持細(xì)胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性以及規(guī)困難是污染概率較高，且存在長期培養(yǎng)中保持細(xì)胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性以及規(guī)模放大過程中的工程問題。模放大過程中的工程問題。（四）動物細(xì)胞工程表達(dá)產(chǎn)品應(yīng)用（四）動物細(xì)胞工程表達(dá)產(chǎn)品應(yīng)用20世紀(jì)世紀(jì)60年代初，英國年代初，英國AVRI研究所在貼壁細(xì)胞系研究所在貼壁細(xì)胞系BHK21中將口蹄疫病毒培養(yǎng)中將口蹄疫病毒培養(yǎng)成功后，動物培養(yǎng)技術(shù)在規(guī)模和可靠性方面都不斷發(fā)展，生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)藥

43、物成功后，動物培養(yǎng)技術(shù)在規(guī)模和可靠性方面都不斷發(fā)展，生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)藥物和疫苗越來越受人們的重視并在疾病防御方面也得到了應(yīng)用。和疫苗越來越受人們的重視并在疾病防御方面也得到了應(yīng)用。1、疫苗、疫苗是用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)的主要產(chǎn)品之一。美國公司應(yīng)用是用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)的主要產(chǎn)品之一。美國公司應(yīng)用SV40作為載體，作為載體，將乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，已獲得高效表達(dá)，并制成乙型將乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，已獲得高效表達(dá)，并制成乙型肝炎疫苗。目前，已實現(xiàn)商業(yè)化產(chǎn)品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病肝炎疫苗。目前，已實現(xiàn)商業(yè)化產(chǎn)品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病

44、病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰疹病毒疫苗和巨細(xì)胞病毒病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰疹病毒疫苗和巨細(xì)胞病毒疫苗等。這些疫苗已被大規(guī)模應(yīng)用。疫苗等。這些疫苗已被大規(guī)模應(yīng)用。2、單克隆抗體、單克隆抗體應(yīng)用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)各種不同的單克隆抗體是經(jīng)濟(jì)可靠地方法。英國應(yīng)用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)各種不同的單克隆抗體是經(jīng)濟(jì)可靠地方法。英國的的Celltech公司采用公司采用100L和和1000L自動氣升式培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)各種生產(chǎn)單克隆自動氣升式培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)各種生產(chǎn)單克隆抗體的小鼠、大鼠和人的細(xì)胞株，生產(chǎn)各種單克隆抗體的產(chǎn)品，已應(yīng)用于疾病抗體的小鼠、大鼠和人的細(xì)胞株，生產(chǎn)各

45、種單克隆抗體的產(chǎn)品，已應(yīng)用于疾病診斷、治療和免疫學(xué)研究。診斷、治療和免疫學(xué)研究。3、基因重組產(chǎn)品、基因重組產(chǎn)品動物細(xì)胞能精確地轉(zhuǎn)譯和加工較大或更復(fù)雜的蛋白質(zhì)。此外動物細(xì)胞動物細(xì)胞能精確地轉(zhuǎn)譯和加工較大或更復(fù)雜的蛋白質(zhì)。此外動物細(xì)胞還可以把人們所需的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)液內(nèi)，而從培養(yǎng)液分離蛋白質(zhì)還可以把人們所需的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)液內(nèi)，而從培養(yǎng)液分離蛋白質(zhì)要比細(xì)胞勻漿更容易。因此，利用動物細(xì)胞培養(yǎng)方式可大量生產(chǎn)基因要比細(xì)胞勻漿更容易。因此，利用動物細(xì)胞培養(yǎng)方式可大量生產(chǎn)基因重組產(chǎn)品。如美國的重組產(chǎn)品。如美國的En -dotronic公司用公司用Acusyst-P型中空纖維培養(yǎng)型中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)出了

46、免疫球蛋白系統(tǒng)生產(chǎn)出了免疫球蛋白G、A和和M，尿激酶，人生長激素，乙型肝炎，尿激酶，人生長激素，乙型肝炎表面抗原等產(chǎn)品。表面抗原等產(chǎn)品。目前，國內(nèi)外采用動物細(xì)胞生產(chǎn)的藥物主要有重組人粒細(xì)胞集落刺激目前，國內(nèi)外采用動物細(xì)胞生產(chǎn)的藥物主要有重組人粒細(xì)胞集落刺激因子、因子、a-2a干擾素、干擾素、a-2b干擾素、干擾素、y-干擾素、人白細(xì)胞介素干擾素、人白細(xì)胞介素-2、重組、重組人紅細(xì)胞生成素、表皮生長因子和重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子等。人紅細(xì)胞生成素、表皮生長因子和重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子等。第三節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查和特性鑒定一、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定和細(xì)胞系（株）的建立一、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定

47、和細(xì)胞系（株）的建立 由于體內(nèi)和體外環(huán)境不同，培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性與體內(nèi)細(xì)胞有所不同。在培養(yǎng)由于體內(nèi)和體外環(huán)境不同，培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性與體內(nèi)細(xì)胞有所不同。在培養(yǎng)細(xì)胞期間，要對細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)性檢測，包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長狀況、營養(yǎng)液和微生細(xì)胞期間，要對細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)性檢測，包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長狀況、營養(yǎng)液和微生物污染等方面。一旦細(xì)胞生長成形態(tài)上單一的細(xì)胞群或細(xì)系后，還要做一系列的細(xì)胞物污染等方面。一旦細(xì)胞生長成形態(tài)上單一的細(xì)胞群或細(xì)系后，還要做一系列的細(xì)胞生物學(xué)方面的檢測。生物學(xué)方面的檢測。（一）、細(xì)胞形態(tài)觀察（一）、細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞形態(tài)的觀察內(nèi)容主要包括細(xì)胞的形態(tài)、核質(zhì)比例、染色質(zhì)、核仁大小

48、和多少細(xì)胞形態(tài)的觀察內(nèi)容主要包括細(xì)胞的形態(tài)、核質(zhì)比例、染色質(zhì)、核仁大小和多少以及微絲微管的排列狀態(tài)等。一般生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，在相差顯微鏡下觀察，輪廓以及微絲微管的排列狀態(tài)等。一般生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，在相差顯微鏡下觀察，輪廓清晰，如細(xì)胞生長條件改變或細(xì)胞功能不良時，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒清晰，如細(xì)胞生長條件改變或細(xì)胞功能不良時，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可以變得不規(guī)則，如上皮細(xì)胞變成纖維類細(xì)胞。狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可以變得不規(guī)則，如上皮細(xì)胞變成纖維類細(xì)胞。（二）、細(xì)胞生長情況（二）、細(xì)胞生長情況1、細(xì)胞生長曲線的測定、細(xì)胞生長曲線的測

49、定 細(xì)胞生長曲線是觀察細(xì)胞生長規(guī)律的重要方法。因而，在細(xì)胞的生長特性觀察中，細(xì)胞生長曲線是觀察細(xì)胞生長規(guī)律的重要方法。因而，在細(xì)胞的生長特性觀察中，生長曲線的測定是最為基本的指標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生長曲線近似生長曲線的測定是最為基本的指標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生長曲線近似“S”形。一般在傳代后形。一般在傳代后第一天細(xì)胞數(shù)有所減少，在經(jīng)過幾天的潛伏適應(yīng)期，進(jìn)入對數(shù)生長期，達(dá)到平臺期后第一天細(xì)胞數(shù)有所減少，在經(jīng)過幾天的潛伏適應(yīng)期，進(jìn)入對數(shù)生長期，達(dá)到平臺期后生長穩(wěn)定，最后衰老。生長穩(wěn)定，最后衰老。 在生長曲線上細(xì)胞數(shù)量增加一倍的時間，稱為細(xì)胞倍增時間，可以從曲線上換算在生長曲線上細(xì)胞數(shù)量增加一倍的時間，稱為細(xì)胞倍

50、增時間，可以從曲線上換算出。細(xì)胞倍增的時間區(qū)間即細(xì)胞對數(shù)生長期。細(xì)胞傳代、實驗等都應(yīng)在此區(qū)間進(jìn)行。出。細(xì)胞倍增的時間區(qū)間即細(xì)胞對數(shù)生長期。細(xì)胞傳代、實驗等都應(yīng)在此區(qū)間進(jìn)行。細(xì)胞群體倍增時間的計算方法有兩種，一為通過作圖方法在細(xì)胞生長曲線的對數(shù)生長細(xì)胞群體倍增時間的計算方法有兩種，一為通過作圖方法在細(xì)胞生長曲線的對數(shù)生長期找出細(xì)胞增長一倍所需的時間，即倍增時間；二為通過公式按細(xì)胞倍增時間計算細(xì)期找出細(xì)胞增長一倍所需的時間，即倍增時間；二為通過公式按細(xì)胞倍增時間計算細(xì)胞群體倍增時間。常用細(xì)胞生長曲線的測定方法有：胞群體倍增時間。常用細(xì)胞生長曲線的測定方法有：（1）細(xì)胞計數(shù)法）細(xì)胞計數(shù)法 1） 將細(xì)

51、胞利用一般傳代方法進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液。經(jīng)計數(shù)后，精確地將將細(xì)胞利用一般傳代方法進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液。經(jīng)計數(shù)后，精確地將細(xì)胞分別接種于細(xì)胞分別接種于2130個大小一致的培養(yǎng)瓶中。每瓶細(xì)胞總數(shù)要求一致，加個大小一致的培養(yǎng)瓶中。每瓶細(xì)胞總數(shù)要求一致，加入培養(yǎng)液的量也要一致。細(xì)胞接種數(shù)不能過多，也不能太少，太少細(xì)胞適應(yīng)入培養(yǎng)液的量也要一致。細(xì)胞接種數(shù)不能過多，也不能太少，太少細(xì)胞適應(yīng)期太長；數(shù)量太多細(xì)胞將很快進(jìn)入增殖穩(wěn)定期，需要在短期內(nèi)進(jìn)行傳代，生期太長；數(shù)量太多細(xì)胞將很快進(jìn)入增殖穩(wěn)定期，需要在短期內(nèi)進(jìn)行傳代，生長曲線不能確切反應(yīng)細(xì)胞生長情況。一般接種數(shù)量以長曲線不能確切反應(yīng)細(xì)胞生長情況。一般接

52、種數(shù)量以710天能長滿而不發(fā)生天能長滿而不發(fā)生生長抑制為度。同種細(xì)胞的生長曲線先后測定要采用同一接種密度，這樣才生長抑制為度。同種細(xì)胞的生長曲線先后測定要采用同一接種密度，這樣才能做縱向比較。不同細(xì)胞也要接種細(xì)胞數(shù)相同，才能進(jìn)行比較。能做縱向比較。不同細(xì)胞也要接種細(xì)胞數(shù)相同，才能進(jìn)行比較。2)每天或隔天取出每天或隔天取出3瓶細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，計算均值。一般每隔瓶細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，計算均值。一般每隔24h取取1瓶，連續(xù)觀察瓶，連續(xù)觀察一至二周或到細(xì)胞總數(shù)有一至二周或到細(xì)胞總數(shù)有 明顯減少為止。培養(yǎng)三到五天后常要給未計數(shù)的細(xì)明顯減少為止。培養(yǎng)三到五天后常要給未計數(shù)的細(xì)胞換液。胞換液。3）以培養(yǎng)時間為橫軸，

53、細(xì)胞數(shù)為縱軸，連接成曲線后即成該細(xì)胞的生長曲線。）以培養(yǎng)時間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，連接成曲線后即成該細(xì)胞的生長曲線。（2）四唑鹽比色實驗）四唑鹽比色實驗四唑鹽是一種能接受氫原子的燃料，簡稱四唑鹽是一種能接受氫原子的燃料，簡稱MTT?；驹硎腔罴?xì)胞線粒體中的。基本原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。用酶聯(lián)免疫檢測儀在中，而死細(xì)胞無此功能。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，波長處測定其光吸收值，可間接反應(yīng)其細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，可間接

54、反應(yīng)其細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量和細(xì)結(jié)晶物形成的量和細(xì)胞數(shù)成正比。它的特點是靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡便，無放射性污染。胞數(shù)成正比。它的特點是靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡便，無放射性污染。（3）CCK-8試劑盒檢測法試劑盒檢測法其基本原理是，該試劑中含有其基本原理是，該試劑中含有WST-8，它在電子載體，它在電子載體1-甲氧基甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲酸二甲酯的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲贊產(chǎn)物。生成的數(shù)量和活細(xì)胞的數(shù)量成正比，細(xì)胞增殖越多，則顏色越深。贊產(chǎn)物。生成的

55、數(shù)量和活細(xì)胞的數(shù)量成正比，細(xì)胞增殖越多，則顏色越深。CCK-8與與MTT的不同之處在于的不同之處在于CCK-8法生成的法生成的formazan是水溶性的，不需要再是水溶性的，不需要再吸出培養(yǎng)液加入有機溶劑溶解這一步，因此可以減少誤差。優(yōu)點是重復(fù)性和吸出培養(yǎng)液加入有機溶劑溶解這一步，因此可以減少誤差。優(yōu)點是重復(fù)性和靈敏度優(yōu)于靈敏度優(yōu)于MTT，對細(xì)胞毒性小。，對細(xì)胞毒性小。2、細(xì)胞分裂指數(shù) 分裂指數(shù)是指細(xì)胞群體中分裂細(xì)胞所占的百分比，即細(xì)胞群的分裂相數(shù)/1000個細(xì)胞。獲得細(xì)胞相數(shù)值后，可以繪制成細(xì)胞分裂指數(shù)曲線。一般細(xì)胞分裂指數(shù)曲線與生長曲線趨勢一致，但細(xì)胞增長進(jìn)入停滯期后，細(xì)胞數(shù)值增大，而分裂

56、相完全消失。3、細(xì)胞接種存活率細(xì)胞接種存活率=（貼壁存活細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）x100%4、細(xì)胞周期（1）放射性核素標(biāo)記自顯影法在細(xì)胞進(jìn)入增殖期后，可以用川標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷處理30min后，每隔30min取材，直到48h為止。觀察和計算細(xì)胞分裂相出現(xiàn)的時間、高峰和消失分裂相數(shù)，繪制成圖進(jìn)行分析。（2）流式細(xì)胞儀測定法選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，用消化法制成細(xì)胞懸液，使細(xì)胞成為單個細(xì)胞，不能成團(tuán)。然后根據(jù)流式細(xì)胞儀的檢測步驟進(jìn)行操作。最后通過計算機分析結(jié)果計算出細(xì)胞周期。 5、細(xì)胞活力的檢測、細(xì)胞活力的檢測 細(xì)胞損傷或死亡時，某些燃料可穿透變性的細(xì)胞細(xì)胞損傷或死亡時，某些燃料可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的

57、膜，與解體的DNA結(jié)合而著色。而活細(xì)胞能阻止結(jié)合而著色。而活細(xì)胞能阻止這類染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。借此可以鑒別死細(xì)胞與活這類染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。借此可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。細(xì)胞。 1）臺盼藍(lán)排斥實驗）臺盼藍(lán)排斥實驗 死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞據(jù)染，從而達(dá)到區(qū)別培養(yǎng)細(xì)胞活力的目的。細(xì)胞據(jù)染，從而達(dá)到區(qū)別培養(yǎng)細(xì)胞活力的目的。 2）伊紅）伊紅Y排斥實驗排斥實驗 本法與臺盼藍(lán)排斥實驗類似，本法與臺盼藍(lán)排斥實驗類似，但用伊紅但用伊紅Y染色后，活細(xì)胞與死細(xì)胞的對比度不染色后，活細(xì)胞與死細(xì)胞的對比度不如臺盼藍(lán)排斥實驗。如臺盼藍(lán)排斥實驗。 3）苯胺黑排斥實驗）苯胺黑排斥實驗 死細(xì)胞被染成黑色，活

58、細(xì)胞死細(xì)胞被染成黑色，活細(xì)胞不被染色。不被染色。（三）培養(yǎng)細(xì)胞種屬鑒定的方法（三）培養(yǎng)細(xì)胞種屬鑒定的方法1、熒光抗體染色鑒別細(xì)胞的種屬、熒光抗體染色鑒別細(xì)胞的種屬利用間接熒光抗體染色技術(shù)對細(xì)胞系的種系進(jìn)行鑒定。步驟是用兔身上產(chǎn)生的特異性利用間接熒光抗體染色技術(shù)對細(xì)胞系的種系進(jìn)行鑒定。步驟是用兔身上產(chǎn)生的特異性抗血清標(biāo)記待檢測陽性對照細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞，然后加標(biāo)記有熒光染料異硫氰酸熒抗血清標(biāo)記待檢測陽性對照細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞，然后加標(biāo)記有熒光染料異硫氰酸熒光素的山羊抗兔免疫球蛋白抗體，加上的熒光抗體將結(jié)合到已標(biāo)記有兔抗體的靶細(xì)胞光素的山羊抗兔免疫球蛋白抗體，加上的熒光抗體將結(jié)合到已標(biāo)記有兔抗體的

59、靶細(xì)胞上，借助熒光即可看到抗原上，借助熒光即可看到抗原-抗體復(fù)合物。抗體復(fù)合物。2同工酶譜系鑒別細(xì)胞種屬同工酶譜系鑒別細(xì)胞種屬通過確定通過確定6-磷酸葡萄糖脫氫酸，乳酸脫氫酶和核苷酸酸化酶的淀粉膠電泳的遷移率，磷酸葡萄糖脫氫酸，乳酸脫氫酶和核苷酸酸化酶的淀粉膠電泳的遷移率，鑒定細(xì)胞系的種屬。該法有高度的可靠性，鑒定細(xì)胞系的種屬。該法有高度的可靠性，G6PD、LDH、NP的電泳遷移率差異不僅的電泳遷移率差異不僅可用來鑒別細(xì)胞系種屬，還可查出種內(nèi)細(xì)胞的交叉污染。根據(jù)同種異體同工酶的表型可用來鑒別細(xì)胞系種屬，還可查出種內(nèi)細(xì)胞的交叉污染。根據(jù)同種異體同工酶的表型和正常人群體的表型頻率資料，可以估計出一

60、特定細(xì)胞系遺傳特征出現(xiàn)的頻率。和正常人群體的表型頻率資料，可以估計出一特定細(xì)胞系遺傳特征出現(xiàn)的頻率。3、染色體分析、染色體分析用顯微鏡觀察細(xì)胞核型特點，進(jìn)行染色體核型分析。包括檢測染色體數(shù)量，標(biāo)記染色用顯微鏡觀察細(xì)胞核型特點，進(jìn)行染色體核型分析。包括檢測染色體數(shù)量，標(biāo)記染色體的有無，帶型等。親緣關(guān)系近的靈長類細(xì)胞系之間和人癌細(xì)胞之間的比較可用體的有無，帶型等。親緣關(guān)系近的靈長類細(xì)胞系之間和人癌細(xì)胞之間的比較可用Giemsa現(xiàn)代分析現(xiàn)代分析4、人主要組織相容性抗原、人主要組織相容性抗原人主要組織相容性抗原又稱人類白細(xì)胞抗原，存在于大多數(shù)有核細(xì)胞膜上，常用的抗人主要組織相容性抗原又稱人類白細(xì)胞抗原