人胃蛋白酶(PG)酶聯(lián)免疫分析(精)

1、1人胃蛋白酶（PG）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書 本試劑盒僅供研究使用 產(chǎn)品編號：CSB-E08919h檢測范圍：4.7 ng/ml - 300 ng/ml最低檢測限：2 ng/ml特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人PG,且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。有效期：6 個月預(yù)期應(yīng)用：ELISA 法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生 物液體中 PG 含量。說明1.試劑盒保存：-20C（較長時間不用時）；2-8C（頻繁使用時）。2.濃洗滌液低溫保存會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。3.中、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準(zhǔn)。4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),

2、 此為正?，F(xiàn)象, 不會對實(shí) 驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。實(shí)驗(yàn)原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗 PG 抗體的微孔中依 次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗 PG 抗體、 HRP 標(biāo)記的親和素,經(jīng)過徹 底洗滌后用底物 TMB 顯色。 TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在 酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 PG 呈正相關(guān)。用酶標(biāo) 儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制1. 酶聯(lián)板 (Assay plate )：一塊(96 孔)。2.標(biāo)準(zhǔn)品(Standard):2 瓶(凍干品)。3.樣品稀釋液( (Sample Diluent)

3、:1 20ml/瓶。4.生物素標(biāo)記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent):1x10ml/瓶。25.辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 (HRP-avidin Diluent)1 xiOml/瓶。6.生物素標(biāo)記抗體(Biotin-antibody):1X20瓶(1:100)。7.辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素 (HRP-avidin):1X120/瓶 (1:100)。8.底物溶液(TMB Substrate):1X0ml/瓶。9.濃洗滌液(Wash Buffer):1X20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋 25 倍。10. 終止液(Stop Solution :1X0ml/瓶(2N

4、H2SO4)。需要而未提供的試劑和器材1.標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀2.高速離心機(jī)3.電熱恒溫培養(yǎng)箱4.干凈的試管和 Eppendof 管5.系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器6.蒸餾水，容量瓶等標(biāo)本的采集及保存1.血清：全血標(biāo)本請于室溫放置 2 小時或 4C過夜后于 1000g 離心 20 分鐘， 取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20T或-80C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2.血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后 30 分鐘內(nèi)于 2 - 8 C1000 g離心 15 分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20T或-80T保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3.細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000

5、g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測， 或?qū)?biāo)本放于-20C或-80C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注 標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。標(biāo)本的稀釋原則：首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。 只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng) 做好詳細(xì)的記錄。最后計算濃度時，稀釋了 “N 倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N。標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至 1ml，蓋好 后靜置 103分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為 300 ng/ml，做 系列倍比稀釋后，分別稀釋 300 ng/ml， 150 ng/

6、ml， 75 ng/ml， 37.5 ng/ml， 18.7 ng/ml，9.4 ng/ml，4.7 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度 0 ng/ml，臨用前 15 分鐘內(nèi)配制。如配制 150 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)品：取 0.5ml （不要少于 0.5ml） 300 ng/ml 的上述標(biāo)準(zhǔn) 品加入含 0.5ml 樣品稀釋液的 Eppendof 管中，混勻即可，其余濃度以此類推。生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實(shí)驗(yàn)所 需的總量配制（每孔 100 卩），實(shí)際配制時應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。女口 10 卩生物素 標(biāo)記抗體加 990 卩,生物

7、素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前 一小時內(nèi)配制。辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的 每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔 100 卩），實(shí)際配制時應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。女口 10 卩 1辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990 卩 1 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。操作步驟實(shí)驗(yàn)開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻 時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，用樣品 稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。1.加樣：分別設(shè)空白孔、

8、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?100 卩, 余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品 100 卩,注意不要有氣泡，加樣將樣品加于 酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜， 37C反應(yīng) 120 分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100 卩1（取 1 卩1生物素標(biāo)記抗體加 99 卩1生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37C,60 分鐘。43.溫育 60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘， 200卩/每孔，甩干。4.每孔加辣根過氧化物酶

9、標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液）100 卩，37C，60 分鐘。5.溫育 60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分鐘， 200卩/每孔，甩干。6.依序每孔加底物溶液 90 卩，37 C 避光顯色（30 分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo) 準(zhǔn)品的前 3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后 3-4 孔顯色不明顯，即可終止） 。7.依序每孔加終止溶液 50 卩，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加 入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。 為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性， 底 物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。8.用酶聯(lián)儀在 450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。在加終止液后

10、15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)備注1.用戶在初次使用試劑盒時， 應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘， 以便試劑集中到 管底。2.每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶 液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào) OD 值至零。3.為防止樣品蒸發(fā)， 試驗(yàn)時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)， 酶標(biāo)板加上 蓋或覆膜。4.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于 2-8C保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體 工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。 請 勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、 生物素標(biāo)記抗體工作液、 或辣根過氧化物 酶標(biāo)記親和素工作液。5.建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的

11、準(zhǔn)確性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺上 鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少 0.3ml 注入孔內(nèi)，浸泡 1-2 分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。 自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。計算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)） ，OD 值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)） ，在半對 數(shù)5坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度； 再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方 程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即 為樣品的實(shí)際濃度。注意事項(xiàng)1. 本操作說明適用于 48T 試劑盒，但 48T 試劑盒所有試劑減半。2. 當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。3.洗滌過程非常重要，不充