DNA提取實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)（二）實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)：質(zhì)粒擴(kuò)增、提取和鑒定實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)對(duì)智力擴(kuò)增、提取和鑒定試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)原理介紹和實(shí)際操作，加深對(duì)分子生物學(xué)基本技術(shù)的理解和掌握。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、搖床、離心機(jī)、不同型號(hào)移液槍若干支、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、電爐、制冰機(jī)、瓊脂糖凝膠電泳儀、超凈工作臺(tái)等。實(shí)驗(yàn)原理：質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線(xiàn)菌和真菌細(xì)胞中，通過(guò)對(duì)細(xì)菌、放線(xiàn)菌和真菌的培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)質(zhì)粒的擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)處理的線(xiàn)狀DNA在外界環(huán)境恢復(fù)正常的時(shí)候不能夠復(fù)性 而質(zhì)粒DNA可以復(fù)性，從而可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒DNA和染色體DNA的分離。限制性?xún)?nèi)切酶能特意地結(jié)合于一端被稱(chēng)為限制性酶識(shí)別系

2、列的DNA系列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割DNA。當(dāng)對(duì)提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行電泳時(shí)，同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開(kāi)環(huán)和線(xiàn)狀分子的泳動(dòng)速度快。實(shí)驗(yàn)步驟：一 質(zhì)粒擴(kuò)增（1）普通LB固體培養(yǎng)基制備：    制備LB培養(yǎng)基，倒入滅菌瓶中高壓滅菌，待完全冷卻后，保存?zhèn)溆?。?）將大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(200轉(zhuǎn)/分)二 質(zhì)粒DNA的提取(堿法)1將菌液倒入1.5ml的微量離心管中， 12000rpm離心一分30秒，棄去上清液，以得到較多的細(xì)菌沉淀；2、 將微量離心管開(kāi)口倒置在衛(wèi)生紙上，使離心管底部的液體流盡。3、 加入100l用

3、冰預(yù)冷的溶液I，劇烈振蕩，將沉淀徹底懸浮，然后室溫放置5分鐘。4、 加入200l現(xiàn)配的溶液II，蓋緊管口，輕輕快速顛倒離心管（不要振蕩，以避免DNA斷裂），使混合物混勻，冰浴510分鐘。5、 加入150l預(yù)冷的溶液III，蓋緊管口，溫和顛倒混勻，使粘稠地細(xì)菌裂解物均勻地分布于溶液III中，冰浴5分鐘。6、 取上部水相，移入新的離心管，加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇（也可同時(shí)加入1/10倍體積的醋酸鈉），震蕩混勻，室溫放置10分鐘沉淀雙鏈DNA，然后4，12000rpm離心10min。7、 棄去上清液，將離心管倒置于衛(wèi)生紙上，使離心管底部的液體流盡后，加 入預(yù)冷的1ml 70乙醇。8、棄去上清液，將

4、離心管倒置于衛(wèi)生紙上，使液體流盡，置DNA干燥510分鐘。9、吸除上清液，將管口倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥。10 、  將沉淀溶于34lTE緩沖液或滅菌水（pH8.0）中，儲(chǔ)于-20冰箱中三DNA酶切反應(yīng)1、 將潔凈干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf 管（最好0.5ml）編號(hào)，用微量移液槍分別加入DNA（l）和相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)10×緩沖液2l，將管內(nèi)溶液混勻后加入0.5l酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可以用微量離心機(jī)甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，要防止錯(cuò)加，漏加。使用限制性?xún)?nèi)切酶時(shí)應(yīng)盡量減少其離開(kāi)冰箱的時(shí)間，以免活

5、性降低。2、 混勻反應(yīng)體系后，將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?7水浴鍋保溫2-3小時(shí)，使酶切反應(yīng)完全。3、 每管加入2l0.1mol/L EDTA（pH8.0），混勻，以停止反應(yīng)，置于冰箱之保存?zhèn)溆?。?DNA的瓊脂糖凝膠電泳1、 取5×TBE緩沖液100ml加蒸餾水至1000ml，配成0.5×TBE稀釋緩沖液，待用。2、 膠液的制備：稱(chēng)取3g瓊脂糖置于1000ml錐形瓶中，加入300ml 0.5×TBE稀釋緩沖液，加入微波爐里加熱至瓊脂糖全部融化，取出搖勻，此為1%瓊脂糖凝膠液。加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng)，使其附于瓶蓋上的瓊脂糖顆粒進(jìn)

6、入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜，以減少水分蒸發(fā)。3、 膠版的制備：想冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠（EB）溶液使其終濃度為0.5lg/ml。倒膠時(shí)的溫度不可太低，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則溶液出現(xiàn)氣泡，待膠完全凝固后，拔出梳子注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至頁(yè)面恰好沒(méi)過(guò)膠板上表面4、 加樣：取20l的酶解液與2l10×載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中，每加完一個(gè)樣品要更換tip頭以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操做，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿5、 電泳：加完樣后合上電泳槽蓋，立即接通電源，控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿2cm時(shí)停止電泳6、 觀察和拍照五 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 六 實(shí)驗(yàn)結(jié)論通過(guò)本次試驗(yàn)加深了對(duì)分子生物學(xué)以及基因工程的深入了解，右上第三第四根亮柱是我的結(jié)果。結(jié)果顯示，第三條中酶切效果良好，RNA被降解的很完全，第四根沒(méi)有被酶切，質(zhì)粒DNA跟RNA同時(shí)存在，出現(xiàn)了兩條亮帶，質(zhì)粒DNA跟RNA分離效果較好。本實(shí)驗(yàn)需要細(xì)致認(rèn)真的完成，所以特別在凝膠電泳中要十分注意以下事項(xiàng)：（1） 取出梳子之前，一定要耐心等待瓊脂糖凝膠的凝固，拔梳子是一定要手穩(wěn)，而且要垂直拔出；（2） 點(diǎn)樣要細(xì)心，槍頭不要碰到凝膠