實(shí)驗(yàn)一兔血清 免疫球蛋白分離與純化

1、綜合實(shí)驗(yàn)一綜合實(shí)驗(yàn)一 兔血清免疫球蛋白兔血清免疫球蛋白分離與純化分離與純化主講教師：申慧芳主講教師：申慧芳 岳續(xù)朋岳續(xù)朋 生物工程教研室生物工程教研室 蛋白質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)課蛋白質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)課實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 兔血清免疫球蛋白分離兔血清免疫球蛋白分離一一 、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握鹽析法的原理及用鹽析法學(xué)習(xí)并掌握鹽析法的原理及用鹽析法進(jìn)行免疫球蛋白分離與純化的技術(shù)。進(jìn)行免疫球蛋白分離與純化的技術(shù)。（IgG ）三、三、 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑實(shí)驗(yàn)儀器及試劑1. 實(shí)驗(yàn)材料：血清（兔免疫血清）。實(shí)驗(yàn)材料：血清（兔免疫血清）。2. 試劑：試劑：0.01mol/LpH7.4 PBS、0.5 mol/L NaOH、0.

2、5mol/L HCl、飽和硫酸按（用前、飽和硫酸按（用前以以5mol/ L NaOH調(diào)至調(diào)至pH7.4）、奈氏試劑。）、奈氏試劑。三、三、 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑實(shí)驗(yàn)儀器及試劑3. 用具：三角瓶、燒杯、各種吸管、小試管、用具：三角瓶、燒杯、各種吸管、小試管、量筒、布氏漏斗、透析袋（用前用量筒、布氏漏斗、透析袋（用前用PBS或雙或雙蒸水煮沸蒸水煮沸10min）、飯盒（裝碎冰）等。）、飯盒（裝碎冰）等。4. 儀器：攪拌器、離心機(jī)等。儀器：攪拌器、離心機(jī)等。5. 溶液配制溶液配制四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1 兔免疫血清的制備兔免疫血清的制備2 硫酸銨分級(jí)沉淀硫酸銨分級(jí)沉淀（1）取制備好的血清）取制備好的血清2

3、0ml，逐滴加入（，逐滴加入（NH4）2SO4飽和溶液飽和溶液20ml，使成，使成50%（NH4）2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置靜置10min。（2）3000r/min離心離心10min，棄去上清。，棄去上清。（3）用）用6ml磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，再加（磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，再加（NH4）2SO4飽和溶液飽和溶液3ml，使成，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合，靜置溶液，充分混合，靜置10min。（4）3000r/min離心離心10min，棄上清。，棄上清。（5）為進(jìn)一步純化，可重復(fù)步驟）為進(jìn)一步純化，可重復(fù)步驟3 23次。次。3 3 透析去鹽透析去鹽（6）用）用5mlPBS溶解沉淀，裝入透析袋。溶解沉淀，裝入透析袋。（7）透析除鹽，中間換液數(shù)次，至奈氏試劑測(cè)透析外液）透析除鹽，中間換液數(shù)次，至奈氏試劑測(cè)透析外液無(wú)黃色。無(wú)黃色。 五、數(shù)據(jù)處理及計(jì)算五、數(shù)據(jù)處理及計(jì)算蛋白含量（蛋白含量（mg /mL）（1. 45OD 280nm 0. 74 OD 260nm） 樣品稀釋度樣品稀釋度 注：式中注：式中1.45與與0.74為常數(shù)，為常數(shù)，nm為波長(zhǎng)。為波長(zhǎng)。蛋白質(zhì)及其定量鑒定：取樣品少許作適量稀釋，以紫蛋白質(zhì)及