Flt3L及CCL5對primeboost免疫策略中抗原特異性免疫應(yīng)答的增強(qiáng)及.

1、Flt3L 及 CCL5 對 prime/boost 免疫策略中抗原特異 性免疫應(yīng)答的增強(qiáng)及抗腫瘤作用Answer a fool according to his folly.作者：劉春燕 , 鄭龍, 尤紅煜 , 張艷, 王俊霞 , 宋淑霞Throw away the apple because of the core.【摘要】目的：研究 Flt3L 與 CCL5 乍為聯(lián)合佐劑在 prime/boost 免疫策略中對 HBc 抗原特異性免疫應(yīng)答的增強(qiáng)及抗腫瘤作用。方法：將兩種細(xì)胞因子 質(zhì)粒與攜帶 HBc 抗原的 DNA 疫苗經(jīng)肌內(nèi)注射法共免疫小鼠,免疫 3 次后再用原 核表達(dá)的 HBc 顆粒蛋

2、白或 HBc DNAS苗加強(qiáng)，觀察對穩(wěn)定表達(dá) HBcAg 的小 鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16HBc的生長抑制作用；并分別采用 MTT 法檢測荷瘤小鼠 脾淋巴細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測脾 CD8+T 淋巴細(xì)胞中 IFNY表達(dá)、ELISA法檢測脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清 IL2、IL4 含量及乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測特 異性 CTL殺傷活性。結(jié)果：與對照組相比，佐劑聯(lián)合 DNA 疫苗免疫經(jīng)蛋白加 強(qiáng)組（DDP/Adj）顯著抑制腫瘤生長；佐劑聯(lián)合 DNAS苗免疫組（DDD/Adj）及 DDP/Adj 組均可促進(jìn)特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（P0.05）,且 DDP/Adj 高于 DDD/Adj 組（P0.05） ;

3、 DDD/Adj 及DDP/Adj 組小鼠脾臟 CD8+T#巴細(xì)胞中 IFNY表達(dá)、IL2 表達(dá)水平及 CTL 殺靶活性均高于對照組（P0.01 或 P0.05）。結(jié)論：在prime/boost 免疫策略中,采用 Flt3L 與 CCL5 兩種細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用可顯著 促進(jìn)荷瘤小鼠產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答及抗腫瘤作用 （） 。Knowledge will not be aquired without pain and application.【關(guān)鍵詞】DNAS苗；Flt3L/CCL5/佐劑；小鼠；抗原特異性免疫應(yīng)答；prime/boost 策略Abstract AIM：To investigate

4、 the immune enhancmentand antitumor effect of the recombinant plasmids pFlt3L and pCCL5 in DNA prime/protein boost regimens. METHODS：The mice werecoimmunized with HBcAg DNA vaccine and th e two cytokines DNA constructs byintramuscular injection forof 2 weeks. Then the mice wer e boosted withHBc part

5、icle proteins or DNA vaccines, respectively. The immune efficacy was evaluated by tumor growth curve. To furtherinvestigate the mechanism of inhibiting tum or growth, lymphocytes proliferationresponse and the number of IFNyproducing cells in splenocytes were measured byMTT or flow cytometry, respect

6、ively. The levels of IL2 and IL4 in supernatant of splenolymphocyte cultures were measured by ELISA. The CTLactivity of splenolymphocyte was detected with LDH release assay. RESULTS:Compared with negative con trol, DDP/Adj group significantly inhibit tumor growth; spthree times at an intervallenocyt

7、es proliferation response and the numbers of IFN 丫 produ cing cellsinDDD/Adj group and DDP/Adj group were significantlyhigher(P0.05 or P0.01). The levels ofIL2 in supernatant of splenolymphocyte cultures in DDD/Adj group and DDP/A dj group were alsomarkedly higher than that of negative co ntrol (P0.

8、05). The CTL activities in group of DD S/Adj and DDD/Adj werestronger than that of other groups ( P0.01 or P0.05). While, the CTL killing activity inDDS/ Adj group was over thatof DDD/Adj (P0.01 or P0.05). CONCLUSION:The significantTh1 response and specific CTL against B16HBc tumor cells are elicite

9、d by the combination of Fl t3L and CCL5 in the DNAprime/protein boost strategy.KeywordsDNA vaccines; Flt3L/CCL5/adjuvant;mouse; Agspecific immune response; prime/boost strategy摘 要 目的：研究 Flt3L 與 CCL5 乍為聯(lián)合佐劑在 prime/boost 免疫策略中對 HBc 抗原特異性免疫應(yīng)答的增強(qiáng)及抗腫瘤作用。方 法：將兩種細(xì)胞因子質(zhì)粒與攜帶HBc 抗原的 DNAS苗經(jīng)肌內(nèi)注射法共免疫小 鼠,免疫 3 次后再用

10、原核表達(dá)的 HBc 顆粒蛋白或 HBc DNA 疫苗加強(qiáng)，觀察對 穩(wěn)定表達(dá) HBcAg 的小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16HB)的生長抑制作用；并分別采 用 MTT 法檢測荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測脾CD8+T 淋巴細(xì)胞中 IFNY表達(dá)、ELISA 法檢測脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清 IL2、 IL4 含量及乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測特異性 CTL 殺傷活性。結(jié)果：與對照組相比,佐劑聯(lián)合 DNA 疫苗免疫經(jīng)蛋白加強(qiáng)組(DDP/Adj)顯著抑制腫瘤生長；佐劑聯(lián)合 DNA 疫 苗免疫組(DDD/Adj)及 DDP/Adj 組均可促進(jìn)特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(P0.05),且 DDP/Adj 高于 DD

11、D/Adj 組(P0.05) ; DDD/Adj 及 DDP/Adj 組小鼠脾臟CD8+T#巴細(xì)胞中 IFNY表達(dá)、 IL2 表達(dá)水平及 CTL 殺 靶活性均高于對照組 (P0.01 或P0.05)。結(jié)論：在 prime/boost 免疫策略中，采用 Flt3L 與 CCL5 兩種 細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用可顯著促進(jìn)荷瘤小鼠產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答及抗腫瘤作 用。關(guān)鍵詞DNA 疫苗；Flt3L/CCL5/佐劑；小鼠;抗原特異性免疫 應(yīng)答；prime/boost 策略質(zhì)粒 DNA 誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答依賴于樹突狀細(xì)胞（dendritic cells, DC 的存在,抗原注射部位 DC 的數(shù)量及功能狀態(tài)直接 影響

12、免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱1。而在非炎癥性的非淋巴組織,DC 數(shù)量很少,限 制了 DNA 疫苗的免疫效果。細(xì)胞因子 Flt3L 能夠刺激 DC 細(xì)胞的增殖2, 3 ;趨化因子 CCL5 不僅可募集未激活的 CD4+己憶 T 細(xì)胞、 刺激 CD4+T 和 CD8+T勺活化,而且參與不成熟 DCs 細(xì)胞的募集、促進(jìn) Th1 偏移的Th1 型細(xì)胞因子（IL2 , IFN）的產(chǎn)生4, 而 Flt3L 與 CCL5 協(xié)同 DNA 疫 苗的研究還未見報(bào)道 （ 醫(yī)藥學(xué)/ 臨床醫(yī)學(xué)論文 ） 。近期的研究結(jié)果已證實(shí) , 經(jīng) DNA 初次免疫后，再用不同類型的抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫的prime/boost 免疫策略是一種理想的免疫

13、方法 , 該方法誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是針對不同抗原形式中相同的 抗原表位5。我們采用經(jīng)攜帶 HBc 抗原的 DNA 疫苗初免及原核表達(dá)的 HBc 顆 粒蛋白加強(qiáng)免疫的“ PrimeBoost”免疫方案免疫小鼠,同時(shí)以真核表達(dá)載體 pFlt3l 和 pCCL5f 乍為佐劑，研究細(xì)胞因子 Flt3L 與趨化因子 CCL5 聯(lián)合應(yīng)用在 prime/boost 免疫策略中對穩(wěn)定表達(dá)HBcAg 的小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16HBc 細(xì) 胞）攻擊的免疫保護(hù)作用及對攜帶 HBc 抗原的 DNA 疫苗誘導(dǎo)的抗原特異性免疫 應(yīng)答的促進(jìn)乍用。1材料和方法1.1材料 真核表達(dá)載體 pFlt3L 、pCCL5、 pHBc 均由

14、本室構(gòu)建；大腸桿菌 BL21 （DE3 及 pET28aHBc 重組質(zhì)粒、B16HBc 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞（穩(wěn)定表達(dá) HBcAg 的小鼠黑色素瘤細(xì)胞）由本室保存；MTTConA 為天根公司產(chǎn)品；LDH 試劑盒購自 Roche 公司；FITC 標(biāo)記的抗小鼠 IFN 丫單克隆抗 體（mAb購自 eBioscienee 公司,PE 標(biāo)記的抗小鼠 CD8 抗體購自 Invitrogen 公司；IPTG 為 Sigma產(chǎn)品；BFA 為晶美公司產(chǎn)品；小鼠 IL2、 IL4 檢測試劑盒購自中晶公司。雄性 C57BL/6小鼠,46 周 齡, 由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。He that runs fastest gets

15、 the ring.1.2方法1.2.1DNAS苗及蛋白的制備及鑒定（1）重組真核表達(dá)載體的制備及鑒定：Flt3L 及 CCL5 基因的擴(kuò)增與純化：參照 RNA exregent 說明提取 C57BL/6 小鼠骨髓及 Co nA 刺激的外周血單個(gè)核細(xì)胞的總 RNA,常規(guī)反轉(zhuǎn) 錄后,用P1、 P2 及 P3 P4 引物擴(kuò)增 Flt3L 及 CCL5 全長基因。P1:5 cgggatcctcacaggcatgaggggtccc3 (BamH I),P2:5 gctctagagggatgggaggggaggggcacc3 (Xba I);P3:5 cgggatccAtga aggtctccgcggc

16、agcc3 (BamH I);P4:5 gctctagactcatctccaaagagttgatgtac3 (XbaI),PCF 產(chǎn)物經(jīng)鑒定后膠回收純化。pFlt3L 及 pCCL5 重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建：取經(jīng) BamH I 和 Xba I 雙酶切 Flt3L 或 CCL5 的 RTPC 產(chǎn)物和相同內(nèi)切 酶酶切的載體 pcDNA3.1/V5His 質(zhì)粒 DNA, 16C連接過夜，轉(zhuǎn)化 TOPO1 感受 態(tài)細(xì)胞，雙酶切篩選陽性重組克隆，DNA 測序測定。(2)HBc 顆粒蛋白制 備：將本制備的攜帶 pET28aHBd組質(zhì)粒的大腸桿菌 BL21 (DE3 培養(yǎng)于 2XYT 培養(yǎng)基并培養(yǎng)至 A60

17、0=0.75, 加入終濃度為0.1 mmol/L 的 IPTG 于 37C誘導(dǎo) 6 h,離心收集菌體并超聲破碎，然后再次離心得到包涵體。用 0.5 mol/L 尿素洗 1 次, 然后用 2 mol/L 尿素將包涵體溶解 , 在變性條件 下經(jīng) Ni2+柱親和層析純化 HBc 蛋白，按常規(guī)方法進(jìn)行蛋白復(fù)性4。將蛋白 顆粒吸附到 200 目銅網(wǎng) , 磷鎢酸染色后經(jīng)透射電鏡觀察。1.2.2小鼠免疫程序及腫瘤接種將 C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為 4組，每組 5 只。第 1 組(control 組)注射 pcDNA3.1/V5His 空質(zhì)粒，第 2 組(DDD 組)于小鼠股四頭肌肌內(nèi)注射 pHBc DNA

18、 疫苗 100 卩 g/只，第 3 組(DDD/Adj 組)和第 4 組(DDP/Adj 組)注射 pHBc DNA 疫苗時(shí)同時(shí)注射兩種佐 劑 pFlt3L及 pCCL5 各 50 卩 g/只，DDP/Adj 組在本次免疫注射原核表達(dá)的 HBc 顆粒蛋白 100 卩 g/只加強(qiáng)免疫。質(zhì)?？偭繛?200 卩 g/只，不足者用pcDNA3.1/V5His 補(bǔ)齊，總體積為 150 卩 L/只。免疫程序?yàn)? 、 2 、 4、 6 周。末次免疫后第 4 天, 小鼠右腋窩皮下注射0.1 mLB16HBc 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞 (1X106),接瘤后第 19 天，按常規(guī)方法進(jìn)行小鼠脾淋巴細(xì)胞制備。1.2.3淋巴細(xì)胞增殖

19、試驗(yàn) 常規(guī)無菌分離脾細(xì)胞 , 并調(diào)整細(xì)胞 密度5X109/L,按每孔 100 卩 L 加入 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別于試驗(yàn)孔中 加入原核表達(dá)的終濃度為 20g/L 的 HBc 顆粒蛋白，同時(shí)設(shè)未加蛋白的陰性對 照，每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。MTT 法檢測淋巴細(xì)胞增殖，用刺激指數(shù)(SI)表示細(xì) 胞增殖活性，SI=A 實(shí)驗(yàn)孔/A 對照孔。You never know what you can do till you.1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子 INF 丫常規(guī)分離免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1X1010/L, 加至 24 孔板，500 卩 L/孔，分別加入 HBc 顆粒蛋白(終濃度 10 m

20、g/L)和 10 卩 g/L IL2, 每組 3 復(fù)孔，設(shè)不 加 HBc 顆粒蛋白的為對照組。培養(yǎng) 72 h ,加入BFA 10mg/L, 孵育 2 h , 收集細(xì)胞, 常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)檢測表達(dá)量 6。I know no such thing as genius, it is nothing but labour and diligence.1.2.5ELISA 法檢測細(xì)胞因子 IL2, IL4 常規(guī)分離脾淋巴 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為 1X1010/L, 加至 24 孔板，1 mL/孔,分別加入HBc 顆粒蛋白（10 mg/L）,每組 3 復(fù)孔,設(shè)不加 HBc 顆粒蛋白的為對照組。 培養(yǎng) 72 h

21、后,ELISA 檢測細(xì)胞因子表達(dá),按試劑盒說明操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品 所測 A 值，繪制濃度、A 值相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線。測 A492 值并參照濃度曲線, 測定表達(dá)量。1.2.6乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測特異性 CTL 活性 調(diào)整脾淋巴細(xì)胞密度至 1x1010/L, 加入 6 孔板，用 50 mg/L 的絲裂酶素 C 滅活后 的 B16HBC細(xì)胞與免疫小鼠脾細(xì)胞共孵育，同時(shí)加入 2 萬 U/L 的重組小鼠 IL2 及 10 mg/L 的 ConA,于第 3 天和第 5 天分別換液，并補(bǔ)充新鮮 IL2。于第 7 天收集細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，用B16HBC 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞作為靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞：靶 細(xì)胞為 50： 1。

22、同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔和靶細(xì)胞最大釋放孔。CTL 活性按以下公式計(jì)算：CTL 殺傷率=（實(shí)驗(yàn)組釋放量-自發(fā)釋放量）/ （最大釋放量-自發(fā)釋 放量）x100%。1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和 t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1DNAS苗及蛋白的制備及鑒定提取 C57BL/6 小鼠骨髓及Co nA 刺激的外周血單個(gè)核細(xì)胞的總 RNA,經(jīng) RTPCR 勺方法成功地克隆得到 708 bp 的Flt3L 及 271 bp 的 CCL5 基因 ,與預(yù)計(jì)編碼基因大小一致（圖 1A） ; 將該產(chǎn)物分別克隆到載體 pcDNA3.1/V5His, 經(jīng)酶切鑒定, 電泳結(jié)果 可見在大約 5 50

23、0 bp 和 708 bp 處及 5500 bp 和 271 bp 處分別出現(xiàn) 2 條帶，與預(yù)期結(jié)果相同；測序結(jié)果顯示與 GenBank 提供的氨基酸序列完全一 致（圖 1B）。SDSPAG 分析結(jié)果表明，攜帶原核表達(dá)載體pET28aHBC 的大腸桿 菌經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)后高水平表達(dá) HBc 蛋白（圖 1C）。因該蛋白帶有 His 標(biāo)簽，經(jīng) Ni2+親和層析柱純化后蛋白純度達(dá) 95%以上。經(jīng) Western blot 結(jié)果顯示，純 化后的 HBc 蛋白 Mr 在 21000 出現(xiàn)條帶（圖 1D）,經(jīng)進(jìn)一步復(fù)性形成了在電鏡下可見的大小均勻的蛋白顆粒（圖 1E）。2.2佐劑聯(lián)合 DNA 疫苗初免經(jīng)

24、蛋白加強(qiáng)顯著抑制腫瘤生長以荷瘤鼠為模型 , 末次免疫后第 4 天,小鼠右腋窩皮下注射 0.1 mL B16HBc穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞 (1X106), 接瘤后第 19 天，測量腫瘤體積(mm3 =寬 2X長12。結(jié)果顯示,control 組及 DDDS 腫瘤體積呈進(jìn)行性生長,DDD/Adj 組和 DDP/Adj 組腫瘤生長緩慢 , 其中 DDP/Adj 組腫瘤生長最慢 , 體積最小( P0.05)。2.3佐劑聯(lián)合 DNA 疫苗初免經(jīng)蛋白加強(qiáng)免疫促進(jìn)抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)終濃度為10 mg/L 的 HBc 顆粒蛋白刺激后,除 DDDfi的增殖活性(1.014 0.035 )外,其余

25、各組均明顯高于對照 組(1.2230.068、1.3980.027 vs 1.0030.012,P0.05) ; 且DDP/Adj 組增殖活性明顯高于DDD/Adj (1.3980.027 vs 1.2230.068,P0.05)。2.4佐劑聯(lián)合 DNA 疫苗經(jīng)蛋白加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生 Th1 型細(xì)胞因子免疫小鼠脾細(xì)胞經(jīng) HBc 顆粒蛋白再次體外刺激后，誘生細(xì)胞因子檢測結(jié)果見表 1,與空質(zhì)粒組比,DDD/Adj 組及 DDP/Adj 組脾 CD8+T 淋巴細(xì)胞中 IFNY表達(dá)顯著增高(P0.01);為了進(jìn)一步研究 Th1 型偏移情況,我們用ELISA 方法檢測了各組脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中 IL2、

26、IL4 水平。與空質(zhì)粒組和 DDDS相比,DDD/Adj 及 DDP/Adj 組 IL2 水平顯著增高(P0.05), 且 DDP/Adj 組 IL2 水平高于其他各組( P0.05)。 表 1脾 CD8+T#巴細(xì)胞 IFNY表達(dá)及脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中 IL2, IL4 水平2.5佐劑聯(lián)合 DNA 疫苗初免經(jīng)蛋白加強(qiáng)免疫明顯提高了CTL 活性本結(jié)果顯示,DDD/Adj 組及 DDP/Adj 組殺傷效果顯著高于對照組及 DDD組(P0.05 或 P0.01), 而對照組與 DDDfi殺靶活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DDP/Adj 組殺傷效果顯著高于 DDD/Adj 組(P0.05,圖 3)。論文教育信息網(wǎng)

27、 http:/3討論使用細(xì)胞因子和趨化因子作為佐劑增加或募集抗原注射部位的DC 細(xì)胞, 是促進(jìn)抗原攝取和免疫應(yīng)答有效的方法 7。已有研究者將細(xì)胞因子或 趨化因子基因與其他一些免疫調(diào)節(jié)分子基因聯(lián)用作為佐劑 , 如 GMCSF 聯(lián)合 Flt3L 或 IL12, 或 Flt3L聯(lián)合 MIPa協(xié)同核酸疫苗進(jìn)行免疫,可有效地募 集 DC 細(xì)胞到達(dá)抗原注射部位,獲得較好的免疫效果7。研究證實(shí) Flt3L 和 CCL5 即是十分有效的免疫調(diào)節(jié)因子,同時(shí)又具有抗腫瘤作用8, 9。本實(shí) 驗(yàn)中,我們成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒 pFlt3L 和 pCCL5,并制備了表達(dá) HBc 抗 原的真核表達(dá)質(zhì)粒 pHBc 和 HB

28、c 顆粒蛋白,觀察了以細(xì)胞因子 Flt3L 與趨化因 子 CCL5 乍為佐劑聯(lián)合應(yīng)用在 prime/boost 免疫策略中能否促進(jìn) HBc 抗原特異性 免疫應(yīng)答及抗腫瘤免疫保護(hù)作用。小鼠抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Flt3L 和 CCL5 聯(lián)合 DNA 疫苗初免經(jīng)蛋白加 強(qiáng)免疫在體內(nèi)顯著抑制表達(dá) HBc 的 B16 腫瘤生長，腫瘤細(xì)胞接種的第 19 天，DDP/Adj 組小鼠腫瘤體積約為 888.5 mm3,為對照組腫瘤體積的 1/5, DDP/Adj 組腫瘤體積也明顯小于 DDD及 DDD/Adj 組（P0.01 或P0.05）。上述結(jié)果說明，F(xiàn)lt3L 和 CCL5 細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用在 prime/

29、DNAprotein/boost免疫策略中可以顯著提高機(jī)體的抗腫瘤乍用。T 細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞因子聯(lián)合疫苗經(jīng)蛋白加強(qiáng)免疫（DDP/Adj 組）后，小鼠脾淋巴細(xì)胞體外經(jīng)抗原再次刺激，其增殖活性明顯 高于單獨(dú)核酸疫苗免疫組 , 且該細(xì)胞增殖活性是抗原特異性的。 Flt3L 和 CCL5 聯(lián)用還可以誘導(dǎo)Th1 型細(xì)胞分化,與單獨(dú) DNAS苗組比,DDP/Adj 及 DDD/Adj 組均能誘導(dǎo)出針對 B16HBc腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷 , 殺傷率分別為 38.7%和 30.4%, 均高于對照組 （P0.01 或P0.05）, 且 DDP/Adj 組也顯著高于 DDD/Adj 組（P0.05）。進(jìn)

30、一步分析荷瘤小鼠脾臟 T 淋巴細(xì)胞 IFN 丫、 IL2 的 產(chǎn)生及 CTL 活性，結(jié)果與 T 淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果一致，而Flt3L 與 CCL5 對 IL4 的產(chǎn)生并無明顯影響。該結(jié)果表明 Flt3L 和 CCL5 不僅顯著促進(jìn)抗原特異性免疫 應(yīng)答,而且可誘導(dǎo) T 淋巴細(xì)胞向 Th1 偏移。綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道,Flt3L 與 CCL5 增強(qiáng) DNAS苗抗腫瘤及 抗原特異性免疫應(yīng)答的可能機(jī)制為：CCL5 促進(jìn)不成熟 DC 浸潤,Flt3L 誘導(dǎo) DC 增殖，其結(jié)果使抗原注射部位的 DC 數(shù)量增加。不僅如此，細(xì)胞因子 CCL5 還明顯促進(jìn) DC 到引流淋巴結(jié)的遷移和 CD86 MHC II

31、的表達(dá)，對 DC 的成熟 具有促進(jìn)作用4。DDD/Adj 組、DDP/Adj 組產(chǎn)生的高水平內(nèi)源性IFNY,可能與 Flt3L/CCL5 對 DC 的募集及活化有關(guān)。而 IFN 丫又可通過提高 CTL 活性對荷瘤宿主進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，產(chǎn)生了較明顯的抑瘤效果。另外，以往 的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，荷瘤宿主產(chǎn)生的內(nèi)源性 IFNY可通過對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫編輯 而提高宿主的抗腫瘤免疫10 ;IFNY還可通過影響腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 Fas及 RAIL的表達(dá),對腫瘤細(xì)胞的增殖進(jìn)行調(diào)控11?？傊撗芯孔C實(shí)應(yīng)用 Flt3L 和 CCL5 兩種佐劑提高了 DNA 疫苗初免 的潛能，比單獨(dú) DNA 疫苗更有效的誘導(dǎo)出抗原特異

32、性的免疫應(yīng)答，經(jīng)蛋白加 強(qiáng)免疫后 , 誘導(dǎo)出免疫記憶 , 較未應(yīng)用細(xì)胞因子初免組產(chǎn)生更強(qiáng)的抗 B16HBc 細(xì)胞的攻擊。本研究結(jié)果在prime/boost 免疫策略中聯(lián)合細(xì)胞因子進(jìn)行初免的 方法將為今后疫苗的發(fā)展提供新的形式和理論基礎(chǔ)。【參考文獻(xiàn)】1 Sumida SM, McKay PF, Truitt DM, et al. Recruitmentand expansion of dendritic cells in vivo potentiate the im munogenicity of plasmid DNAvaccinesJ . J Clin Invest, 2004,114(9)

33、：1334-1342. 10 Dunn GP, Koebel CM, Schreiber RD. Interferons, immunit y and cancerimmunoediting J . Tumor Immunol, 2006, 6(11): 836-848.11Meng RD, ElDeiryWS. p53independent upregulationof KI2 王良華 , 熊 文, 鄒紅巖 . 影響的研究 J. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志Flt3 配體對培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞免疫表型 ,2004, 19(4): 7-8. 3 Brasel K, murinedendritic w cultures J .De Smedt T,cells fromBlood, 2000,Smith JL, et al. Generation offlt3ligandsupplemented bone marro 96(9):3029-3039.Ma K,Xu W, Shao XN,etal.Coimmunization withES plasmid polarized Th1 immunevirusenvelope via recru