石磊--新型快速轉(zhuǎn)基因檢測方法在食品中的應用

1、LOGO新型快速轉(zhuǎn)基因檢測方法在食品中的應用新型快速轉(zhuǎn)基因檢測方法在食品中的應用政府檢測機構(gòu)為什么需要檢測？v日益嚴峻的食品安全局勢的需要v提高檢測效率v節(jié)約人力資源成本v與國際接軌企業(yè)為什么需要快速檢測？v 銷售環(huán)節(jié)要求快速出貨，尤其是一些保質(zhì)期短的產(chǎn)品v 減少物流的壓力，盡可能減少倉存，加快資金周轉(zhuǎn)v 節(jié)約人力資源成本v 對于運行HACCP(危害分析的臨界控制點)質(zhì)量保證體系的企業(yè)來說，快速檢測方法可以快速檢測原料及半成品的污染情況，以采取相應的措施控制最終產(chǎn)品的微生物超標情況最新事件 2013年12月廈門檢驗檢疫局從一批進口美國黃玉米中檢出未經(jīng)中國農(nóng)業(yè)部批準的轉(zhuǎn)基因成分MIR162。該批

2、玉米重5.81萬噸，貨值1582.1萬美元，其含抗蟲基因，能抵抗秋粘蟲、甘蔗食心蟲、玉米穗蛾以及其他鱗翅目害蟲，。最終，這些玉米全部被退運處理。 2014年2月一家網(wǎng)站聯(lián)合國內(nèi)第三方檢測機構(gòu)華測檢測對市面上永和大王、麥當勞、7-11、肯德基四家的豆?jié){進行檢測，發(fā)現(xiàn)肯德基的豆?jié){中含有轉(zhuǎn)基因成分。 2014年3月韓國市面上進口芥花油被曝使用轉(zhuǎn)基因（GMO）原料，消費者對韓國國內(nèi)GMO標識制度提出質(zhì)疑。ELISA免疫試紙條Western 印記普通PCR實時熒光PCR巢氏PCR競爭性PCR基因芯片現(xiàn)有標準快速方法勢在必行v 國外許多政府檢測機構(gòu)都在大量使用快速檢測方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和

3、顯色培養(yǎng)基法在國外應用相當成功v 國內(nèi)的許多政府檢測機構(gòu)也都已經(jīng)在使用或正在考慮使用國外先進的快速檢測技術(shù)v 從長遠發(fā)展趨勢來說，快速方法是檢測的大方向LOGO免疫學方法免疫學技術(shù)是利用特異性抗原抗體免疫學技術(shù)是利用特異性抗原抗體反應，借標記物的熒光或酶的有色反應，借標記物的熒光或酶的有色反應、放射性或高電子密度反應、放射性或高電子密度,在光鏡在光鏡或電鏡下進行定性、定位或定量研或電鏡下進行定性、定位或定量研究究 產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結(jié)果需要確但有假陽性存在，陽性結(jié)果需要確認。通常的原理有認。通常的原理有EIA，ELISA，GLI

4、SA，熒光酶免、免疫磁分離、，熒光酶免、免疫磁分離、免疫印跡等方法免疫印跡等方法 免疫學方法中突出代表：膠體金免疫層析檢測條大腸桿菌O157李斯特氏菌沙門氏菌PCR方法v普通PCR，熒光PCR，實時熒光PCR（定量PCR）等多種方法vPCR方法一般不需增菌太長時間，通過PCR方法對待測微生物的特征片斷進行擴增，然后通過凝膠電泳或熒光PCR技術(shù)判斷結(jié)果實時熒光PCR已經(jīng)廣泛用于微生物檢測LOGO PCR-聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）在體外通過酶促反應,進行一段特定DNA或RNA片段擴增的技術(shù),1.變性（denaturation）： 加熱使DNA雙

5、螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離形成單鏈DNA 2.退火（annealling）： 溫度降低時使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈 3.延伸（extension）： 在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷酸及Mg2存在的條件下，催化DNA鏈延伸反應LOGO熒光PCR技術(shù)(Real Time PCR)熒光PCR技術(shù)(Real Time PCR)v優(yōu)點： 測定結(jié)果迅速，靈敏度和特異性高 可做到定量分析，既可以用于臨床感染性疾病的診斷,又可用于監(jiān)測其療效 實時定量PCR 不需要PCR 后處理，所以可避免PCR 的實驗室污染及減少檢測耗時缺點：其假陽性概率仍偏高。儀器設(shè)備要求高，使用成本高，難以實現(xiàn)現(xiàn)場大批量快速檢

6、測抗原抗體專一性要求高抗原抗體專一性要求高加工產(chǎn)品不易檢測加工產(chǎn)品不易檢測不適用與蛋白表達量低不適用與蛋白表達量低或不表達的產(chǎn)品或不表達的產(chǎn)品耗時長耗時長操作復雜操作復雜成本昂貴成本昂貴技術(shù)要求高技術(shù)要求高現(xiàn)有檢測方法不足熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)是目前主流的分子檢測技術(shù)。相關(guān)產(chǎn)品占據(jù)全球分子診斷市場約一半。市場需求我們要解決的問題面臨主要問題：核酸檢測過程復雜，對操作人員要求高，操作誤差對結(jié)果影響大；實現(xiàn)核酸擴增信號檢測設(shè)備價格高對實驗室硬件條件要求高；局限于高端市場、普及推廣困難！基層醫(yī)療和檢測機構(gòu)需求得不到滿足！新型恒溫熒光核酸擴增分子檢測平臺設(shè)備簡便快速準確操作簡單易于推廣我們的解

7、決方案簡易高效的核酸擴增新技術(shù)簡易高效的核酸擴增新技術(shù)高效檢測時間可縮短至30min內(nèi)完成恒溫使操作變得簡單，不在需要高端檢測設(shè)備結(jié)果易判斷對結(jié)果信號的檢測變得簡單優(yōu)勢整合檢設(shè)備開發(fā)簡單，大幅度降低成本，為技術(shù)推廣創(chuàng)造全新空間技術(shù)特征技術(shù)特征v反應體系反應體系: : 具有鏈置換特性的具有鏈置換特性的DNADNA聚合酶、聚合酶、dNTPdNTP、適宜的緩沖、適宜的緩沖液和模板液和模板DNA,DNA,能夠識別靶能夠識別靶DNA 7DNA 7個特異序列的個特異序列的6 6 條條引物引物v反應原理反應原理: : 一種新型的等溫擴增技術(shù)，即一種新型的等溫擴增技術(shù)，即等溫多自配引發(fā)擴等溫多自配引發(fā)擴增增（

8、isothermal multiple self-matching-isothermal multiple self-matching-initiated amplificationinitiated amplification，IMSAIMSA）。）。一：引物設(shè)計二：擴增原理LOGOIMSA恒溫擴增方法特點v特異性強 6條引物對靶序列的7個特異序列區(qū)的識別,保證了IMSA擴增的高度特異性v等溫高效 IMSA在等溫條件下擴增,不會因溫度改變而造成時間的損失,而且受非靶序列的影響小；與PCR相比,其檢測極限更小,僅為幾個拷貝IMSA恒溫擴增方法特點v耗時短 在1 h內(nèi)可完成檢測v產(chǎn)物易檢測 核酸

9、染料，肉眼觀察v操作簡便 反應不需PCR儀和特殊試劑IMSA恒溫擴增方法特點v具有于PCR技術(shù)同等甚至超越的優(yōu)勢 有望取代PCR技術(shù)v對儀器設(shè)備要求寬松 可實現(xiàn)現(xiàn)場大量樣品的快速檢測LOGOIMSA反應條件65 反應 20至 60 min 反應結(jié)束后可用肉眼觀察是否有渾濁沉淀產(chǎn)生，沉淀為反應產(chǎn)生的焦磷酸鎂LOGO結(jié)果檢測肉眼檢測: 在IMSA的反應過程中,焦磷酸鹽和鎂離子結(jié)合生成焦磷酸鎂白色沉淀物 可以直接根據(jù)是否形成白色沉淀來定性判斷反應是否發(fā)生+-LOGO結(jié)果檢測電泳檢測：MarkPositive control Samplenegative control LOGOIMSA產(chǎn)物檢測在結(jié)果

10、檢測方面的改進 加入核酸染料，不僅提高檢測靈敏度，同時可以得到更明確的觀測結(jié)果LOGO試劑盒組成及使用試劑盒組成1、反應液2、密封液3、Bst DNA 聚合酶4、染色液Bst DNA聚合酶待測樣品核酸IMSA快速檢測流程v樣品前處理 增菌或臨床樣品的預處理過程 DNA提?。呀庖?煮沸法）LOGO反應過程6065恒溫60分鐘經(jīng)典IMSA檢測流程圖LOGO結(jié)果檢測反應完成后，振蕩反應管，混合顯色液，即可顯示明顯結(jié)果陽性：綠色陽性：綠色 陰性：橙色陰性：橙色從核酸提取到觀察結(jié)果：從核酸提取到觀察結(jié)果：60-90minLOGORT-IMSA通過加入逆轉(zhuǎn)錄酶,IMSA即能進行RNA高效擴增 使用耐熱逆

11、轉(zhuǎn)錄酶還可實現(xiàn)一步法逆轉(zhuǎn)錄IMSA反應，實現(xiàn)病毒的快速檢測LOGO原位熒光IMSA檢測副溶血弧菌1原位熒光環(huán)介導恒溫核酸擴增快速檢測方法 （專利受理號：200710030902.X）2沙門氏菌恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及方法 （專利受理號：200710030947.7）3亞歷山大藻恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及方法 （專利受理號：200710030962.1）4副溶血弧菌恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及方法 （ 專利受理號：200710030948.1）5.沙門氏菌原位熒光介導快速檢測試劑盒及其使用方法 （專利受理號： 200810030264.6）6.大腸桿菌O157恒溫核酸擴增快速檢測試劑盒及其

12、方法 （專利受理號： 200810030333.3）7.副溶血弧菌原位恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及其使用方法 （專利受理號： 200810030340.3）LOGO恒溫擴增實時熒光檢測系統(tǒng)恒溫擴增實時熒光檢測系統(tǒng)內(nèi)容簡介內(nèi)容簡介12恒溫擴增實時熒光檢測系統(tǒng)介紹恒溫擴增實時熒光檢測系統(tǒng)介紹恒溫擴增實時熒光檢測系統(tǒng)的優(yōu)勢恒溫擴增實時熒光檢測系統(tǒng)的優(yōu)勢3產(chǎn)品產(chǎn)品國內(nèi)首臺自主研發(fā)的恒溫熒光檢測儀恒溫熒光檢測儀DEAOU-308C 恒溫熒光檢測儀308C將核酸檢測帶入精確、快速、智能的新時代，該儀器是集恒溫擴增與熒光信號檢測于一體的新型檢測設(shè)備，可實現(xiàn)擴增過程的實時監(jiān)測，具有控溫精度高、靈敏度高、通量高

13、、重復性好等優(yōu)點。儀器內(nèi)置人性化操作系統(tǒng)，同時采用先進的數(shù)學模型進行數(shù)據(jù)處理和圖形繪制，可自動判讀結(jié)果。恒溫實時熒光檢測系統(tǒng)的優(yōu)勢恒溫實時熒光檢測系統(tǒng)的優(yōu)勢 快速快速D-H -1LA-320CABI7500由圖可知：對于同一份已知樣品，由圖可知：對于同一份已知樣品， D-H-1的檢測時間的檢測時間最快最快 靈敏靈敏D-H -1LA-320CABI7500由圖可知：對于濃度梯度稀釋的標準品，由圖可知：對于濃度梯度稀釋的標準品， D-H -1和和ABI7500相當，但是優(yōu)越于相當，但是優(yōu)越于LA-320C 穩(wěn)定穩(wěn)定由圖可知：對于相同濃度的標準品，由圖可知：對于相同濃度的標準品， D-H -1和和L

14、A-320C的穩(wěn)定性相當，但是同時在的穩(wěn)定性相當，但是同時在ABI7500上進行恒溫熒光擴增穩(wěn)定上進行恒溫熒光擴增穩(wěn)定性較差性較差產(chǎn)品優(yōu)勢拓展功能多拓展功能多靈巧輕便靈巧輕便操作簡單操作簡單現(xiàn)場檢測現(xiàn)場檢測 陽性陽性 陰性陰性檢測時間短檢測時間短特異性強、靈敏度高特異性強、靈敏度高陰陽性結(jié)果易區(qū)分陰陽性結(jié)果易區(qū)分操作簡單操作簡單經(jīng)濟適用經(jīng)濟適用我們的使命是不斷支持您的恒溫擴增探索研究之路。恒溫擴增實時熒光檢測系統(tǒng)體現(xiàn)了我們的承諾從項目立項到研究成果的完成，我們將為您提供所需的一切，讓您的科研更輕松、更高效。產(chǎn)品名稱產(chǎn)品名稱貨號貨號規(guī)格規(guī)格DNA擴增試劑盒（恒溫擴增法）DASR01-2424測試

15、/盒DASR01-4848測試/盒DASR01-9696測試/盒RNA擴增試劑盒（恒溫擴增法）DASR02-2424測試/盒DASR02-4848測試/盒DASR02-9696測試/盒恒溫擴增熒光指示劑（鈣黃綠素）DASR03-2424測試/管DASR03-9696測試/管配套試劑配套試劑專業(yè)引物設(shè)計軟件專業(yè)引物設(shè)計軟件恒溫熒光檢測儀快速：數(shù)分鐘內(nèi)可實現(xiàn)DNA/RNA檢測靈敏：最低可檢測數(shù)個拷貝1.恒溫檢測檢測溫度：63 -65無需熱循環(huán)，對儀器設(shè)備要求低 熱循環(huán)熱循環(huán) 恒溫恒溫核酸檢測法綜合對比核酸檢測法綜合對比熒光熒光PCR法法恒溫實時熒光恒溫實時熒光法法最低檢出量最低檢出量(個菌個菌/m

16、l)110211031102反應時間反應時間90 min30 min普及性普及性不適于基層推廣不適于基層推廣適于基層推廣應用適于基層推廣應用轉(zhuǎn)基因檢測實驗室3.試劑常溫保存實現(xiàn)常溫運輸與保存降低運輸成本方便用戶使用5.閉管+雙重檢測方式1.目視目視檢測檢測 結(jié)果結(jié)果判讀可視化判讀可視化 陰性陰性 陽性陽性2.儀器儀器檢測檢測 結(jié)果結(jié)果判讀數(shù)據(jù)化判讀數(shù)據(jù)化閉管檢測閉管檢測4.檢測時間短樣品樣品25g(ml)+225mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水氯化鈉堿性蛋白胨水361，68h增增菌菌恒溫擴增恒溫擴增結(jié)果陽性結(jié)果陽性按國家標準按國家標準GB 4789 進行確認進行確認結(jié)果陰性結(jié)果陰性報告陰性報告陰性

17、DNA提取提取6-8 h20min30min以以副溶血性弧菌檢測副溶血性弧菌檢測流程為例流程為例快速快速檢測檢測反應時間反應時間短短DNA提取DNA純化體系配制添加模板63恒溫擴增（金屬浴/水浴鍋）目視判斷實時檢測（恒溫熒光檢測儀）檢測流程特點特點 恒溫檢測：63 靈敏度高、特異性強 試劑常溫保存：試劑可常溫保存1年。 檢測時間短：檢測時間只需30min。 閉管檢測：可防止由于擴增產(chǎn)物產(chǎn)生的污染； 雙重結(jié)果判斷：目視判斷，儀器檢測，可滿足不同的客戶需求。 現(xiàn)場檢測：可現(xiàn)場檢測和移動檢測，更適合于基層推廣應用。 行業(yè)標行業(yè)標準準名稱名稱出口食品中轉(zhuǎn)基因成分出口食品中轉(zhuǎn)基因成分SN標準標準所制定所

18、制定標準標準1個初篩檢測方法和個初篩檢測方法和34個品系特異性檢測方法個品系特異性檢測方法項目牽項目牽頭單位頭單位廣東檢驗檢疫技術(shù)中心廣東檢驗檢疫技術(shù)中心合作合作單位單位中國檢驗檢疫科學研究院中國檢驗檢疫科學研究院 北京出入境檢驗檢疫局北京出入境檢驗檢疫局天津出入境檢驗檢疫局天津出入境檢驗檢疫局 上海出入境檢驗檢疫局上海出入境檢驗檢疫局 遼寧出入境檢驗檢疫局遼寧出入境檢驗檢疫局 福建出入境檢驗檢疫局福建出入境檢驗檢疫局吉林出入境檢驗檢疫局吉林出入境檢驗檢疫局 廈門出入境檢驗檢疫局廈門出入境檢驗檢疫局 黑龍江出入境檢驗檢疫局黑龍江出入境檢驗檢疫局 汕頭出入境檢驗檢疫局汕頭出入境檢驗檢疫局CaMV

19、35S核酸恒溫熒光檢測試劑盒核酸恒溫熒光檢測試劑盒食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米MON89034 及其衍及其衍生生品種品種FMV35S核酸恒溫熒光檢測試劑盒核酸恒溫熒光檢測試劑盒食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米T25及其衍生及其衍生品種品種GOX核酸恒溫熒光檢測試劑盒核酸恒溫熒光檢測試劑盒食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米3272 及其衍生及其衍生品品種種NPT核酸恒溫熒光檢測試劑盒核酸恒溫熒光檢測試劑盒

20、食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米59122及其衍生品及其衍生品種種BAR核酸恒溫熒光檢測試劑盒核酸恒溫熒光檢測試劑盒食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因大豆食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127 及其衍及其衍生生品種品種PAT核酸恒溫熒光檢測試劑盒核酸恒溫熒光檢測試劑盒食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因大豆食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因大豆MON89788 及其衍及其衍生生品種品種NOS核酸恒溫熒光檢測試劑盒核酸恒溫熒光檢測試劑盒食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基

21、因大豆食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因大豆DP356043 及其衍及其衍生生品種品種大豆內(nèi)源基因大豆內(nèi)源基因Lectin核酸恒溫熒光檢測試劑盒核酸恒溫熒光檢測試劑盒食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因大豆食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2及其衍生及其衍生品種品種玉米內(nèi)源基因玉米內(nèi)源基因Zein核酸恒溫熒光檢測試劑盒核酸恒溫熒光檢測試劑盒食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因大豆食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12及其衍生及其衍生品種品種羽扇豆內(nèi)源基因羽扇豆內(nèi)源基因ITS1核酸恒溫熒光檢測試劑盒核酸恒溫熒光檢測

22、試劑盒食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因水稻食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因水稻BT63 及其衍生及其衍生品品種種小麥內(nèi)源基因小麥內(nèi)源基因ACC1核酸恒溫熒光檢測試劑盒核酸恒溫熒光檢測試劑盒食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因水稻食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因水稻Cry 1C及其衍生及其衍生品品種種水稻內(nèi)源基因水稻內(nèi)源基因PLD核酸恒溫熒光檢測試劑盒核酸恒溫熒光檢測試劑盒食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因水稻食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因水稻Cry 2A及其衍生及其衍生品品種種食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米食

23、品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米BT176 及其衍生及其衍生品種品種食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因水稻食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因水稻KF6 及其衍生及其衍生品種品種食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米MIR604 及其衍及其衍生生品種品種食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因水稻食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因水稻KF8及其衍生及其衍生品種品種食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米BT11 及其衍生及其衍生品品種種食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因水稻食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因水稻KMD 及其衍生及其衍生品品種種食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因玉米MIR162及其衍生及其衍生品種品種食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因水稻食品中轉(zhuǎn)基因成分恒溫實時熒光檢測方法：轉(zhuǎn)基因水稻LLr