生化檢測原理

1、第二部分：Spectrophotometry Principle 分光光度法檢測原理 所以：待測物濃度可以由檢測其顏色深淺得到。不同濃度，顏色深淺不一。沒有顏色？間接：通過生化反應(yīng)生成有色物質(zhì)，間接計(jì)算得到濃度。雙縮脲反應(yīng)分光光度法的原理基礎(chǔ)：Lambert-Beer Law ，I 入射光及通過樣品后的透射光強(qiáng)度；A吸光度(absorbance) ；C樣品濃度；d光程，即盛放溶液的液槽的透光厚度；k光被吸收的比例系數(shù)；T透射比，即透射光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度之比。簡而言之，光被一定濃度介質(zhì)吸收的比例與入射光的強(qiáng)度無關(guān)；在光程上每等厚層介質(zhì)吸收相同比例值的光。 Lambert-Beer Law的適用范

2、圍：(1) 入射光為平行單色光且垂直照射.(2) 吸光物質(zhì)為均勻非散射體系.(3) 吸光質(zhì)點(diǎn)之間無相互作用.(4) 輻射與物質(zhì)之間的作用僅限于光吸收,無熒光和光化學(xué)現(xiàn)象發(fā)生.(5) 待測物在一定溶度范圍之內(nèi).為什么需要平行單色光？ 在非單色光的條件下，由于待測物質(zhì)在各個波段下吸光系數(shù) K 的不同，造成相關(guān)曲線也出現(xiàn)不同程度的偏離。 實(shí)際上，理論上的單色光是不存在的，我們所做的只能是讓入射光的光譜帶寬盡可能的小，要盡可能的靠近單色光。為什么僅適用一定范圍內(nèi)？ Lambert-Beer Law在有解離、締合、生成絡(luò)合物或溶劑化等會對比爾定律產(chǎn)生偏離。 解離是偏離朗伯-比爾定律的主要化學(xué)因素，當(dāng)溶液

3、濃度（大于0.01mmol/L）改變，解離程度也會發(fā)生變化，吸光度與濃度的比例關(guān)系便發(fā)生變化，導(dǎo)致偏離朗伯-比爾定律。前分光模式1、光源燈發(fā)出全波段光線2、單色器將全波段光線分為某一波長的單色平行光3、單色平行光經(jīng)過反應(yīng)杯溶液4、光電信號接收器檢測光線強(qiáng)度后分光模式5、光電信號檢測各種光線強(qiáng)度4、衍射光柵將出射光線分為不同波長的單色光3、平行光經(jīng)過反應(yīng)杯溶液1、光源燈發(fā)出全波段光線2、光線經(jīng)凸透鏡整理成為不同波段平行光雙波長模式在雙波長模式下A=A（主波長）-A（副波長）較單波長的優(yōu)點(diǎn)：1、電壓不穩(wěn)定等環(huán)境影響下，由于主副波長都產(chǎn)生了相同程度的影響而被消除2、一些常見的干擾因素如輕度溶血，將可

4、以由于在主波長和副波長具有相同的吸光度而被間接消除3、雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響在羅氏儀器上，待測物的12個波長的吸光度都被檢測，選擇設(shè)定中的2個波長進(jìn)行計(jì)算。分光光度法的分析類型一，終點(diǎn)法1-Point End Assay2-Point End Assay二，速率法2-Point Rate AssayRate Assay1Point End：僅檢測反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度2-point end assay :檢測2個點(diǎn)的吸光度，一點(diǎn)反應(yīng)啟動前樣品空白的吸光度，另一點(diǎn)為反應(yīng)啟動后的吸光度。2-Point End Assay反應(yīng)圖

5、：2-Point Rate Assay：檢測兩個不同時間點(diǎn)之間的吸光度之差，除以時間差得到的變化率1個或多個反應(yīng)試劑檢測2個點(diǎn)吸光度用于計(jì)算通過 Abs/min來計(jì)算檢測項(xiàng)目的量2-point Rate assay反應(yīng)圖1個或多個反應(yīng)試劑通過最小二乘法計(jì)算反應(yīng)曲線，得到待測物的量或活性Rate A：一定時間連續(xù)多次測定反應(yīng)過程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物量隨時間變化的數(shù)據(jù)，間接計(jì)算檢測項(xiàng)目的量的方法。Rate A反應(yīng)圖：檢測方法檢測方法檢測物質(zhì)檢測物質(zhì)Examples Examples 校準(zhǔn)方法校準(zhǔn)方法1點(diǎn)終點(diǎn)法底物類TG, CHOL2點(diǎn)線性校準(zhǔn)2點(diǎn)終點(diǎn)法底物類TP,ALB, Glu ，TB, DB,

6、 Ca ,Pho , UA,HDL ,LDL 2點(diǎn)線性校準(zhǔn)特定蛋白類HSCRP, HbA1c多點(diǎn)非線性校準(zhǔn)速率A法酶類AST, ALT, GGT, LDH, CK2點(diǎn)線性校準(zhǔn)底物CREA Jaffe, UREA, Ammonia , TDM2點(diǎn)線性校準(zhǔn)2點(diǎn)速率法底物UREA, ACP，Urinary/CSF protin2點(diǎn)線性校準(zhǔn)光度分析校準(zhǔn)及報警Calibration quality criteriaCalibration quality criteria校準(zhǔn)限制界校準(zhǔn)限制界面面Utility Application screenUtility Application screenSD L

7、imit(SD Limit(標(biāo)準(zhǔn)差限制標(biāo)準(zhǔn)差限制) :) :實(shí)測吸光度和理論計(jì)算吸光度的差異實(shí)測吸光度和理論計(jì)算吸光度的差異Duplicate limit (Duplicate limit (重復(fù)性限制重復(fù)性限制):):重復(fù)性限制重復(fù)性限制, ,相對范圍相對范圍% %和絕對范圍和絕對范圍Sensitivity limitSensitivity limit( (靈敏度限制靈敏度限制) ) : :空白濃度和空白濃度和 c.f.a.sc.f.a.s之間的單位濃度吸光度變化之間的單位濃度吸光度變化差異的最大值和最小值差異的最大值和最小值 S1 Absorbance Limit(S1 Absorbanc

8、e Limit(空白限制空白限制) :) :試劑空白就是待測物濃度為試劑空白就是待測物濃度為0 0時的吸光度時的吸光度. .校準(zhǔn)報告校準(zhǔn)報告CHOCHOStd1,2Std1,2雙波長雙波長檢測吸光度差檢測吸光度差Std1,2Std1,2主波長主波長檢測吸光度檢測吸光度校準(zhǔn)報警校準(zhǔn)報警校準(zhǔn)結(jié)果校準(zhǔn)結(jié)果K= (CFAS -0)/ (5848-1973) x 10000=1120K= (CFAS -0)/ (5848-1973) x 10000=1120K = (CN Cb) K = (CN Cb) (AN Ab) (AN Ab)SD Limit(SD Limit(標(biāo)準(zhǔn)差限制標(biāo)準(zhǔn)差限制):):常見校

9、準(zhǔn)校準(zhǔn)失敗常見校準(zhǔn)校準(zhǔn)失敗的原因的原因1.1. 校準(zhǔn)的放置順序可能有誤（多個校準(zhǔn)的放置順序可能有誤（多個校準(zhǔn)品）校準(zhǔn)品）2.2. 單個校準(zhǔn)品自動稀釋后校準(zhǔn)單個校準(zhǔn)品自動稀釋后校準(zhǔn) 加樣精度問題加樣精度問題3.3. 比色杯或光源燈老化比色杯或光源燈老化4.4. 污染的或蒸發(fā)濃縮的校準(zhǔn)品污染的或蒸發(fā)濃縮的校準(zhǔn)品5.5. 混勻機(jī)構(gòu)問題混勻機(jī)構(gòu)問題Duplicate limit :重復(fù)性限制 檢查同一個校準(zhǔn)品的兩次吸光度差異Abs1 - Ab2 校準(zhǔn)的時候,每個校準(zhǔn)品會重復(fù)做兩次進(jìn)行計(jì)算原因：如果是新試劑，檢查試劑復(fù)溶及混勻情況檢查樣品針和試劑針.樣品或試劑上有氣泡光源燈或比色杯老化混勻不佳Sensi

10、tivity limit(Sensitivity limit(靈敏度靈敏度限制限制) ) 該數(shù)值標(biāo)識出空白和該數(shù)值標(biāo)識出空白和 c.f.a.sc.f.a.s之間的單位濃度吸光度變之間的單位濃度吸光度變化差異的最大值和最小值化差異的最大值和最小值 . . 在終點(diǎn)法的生化項(xiàng)目校準(zhǔn)中，最小吸光度變化是必須檢測在終點(diǎn)法的生化項(xiàng)目校準(zhǔn)中，最小吸光度變化是必須檢測的標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn) Sen:Sen:Sensitivity limit(Sensitivity limit(靈敏度限制靈敏度限制):):常見校準(zhǔn)校常見校準(zhǔn)校準(zhǔn)失敗的原因準(zhǔn)失敗的原因1.1. 錯誤的校準(zhǔn)品錯誤的校準(zhǔn)品 蒸發(fā)濃縮或配制錯誤蒸發(fā)濃縮或配制錯誤

11、2.2. 舊的或污染的試劑舊的或污染的試劑3.3. 污染的空白校準(zhǔn)品污染的空白校準(zhǔn)品空白和CFAS校準(zhǔn)品的測得的吸光度值過于接近校準(zhǔn)失敗校準(zhǔn)失敗校準(zhǔn)液校準(zhǔn)液（1 1）吸光度）吸光度Standard 1 Absorbance Standard 1 Absorbance S1 Abs S1 Abs 用于檢查用于檢查線性或非線性線性或非線性校準(zhǔn)。校準(zhǔn)。報警用于指示第一點(diǎn)校準(zhǔn)品吸光度是否超出范圍。報警用于指示第一點(diǎn)校準(zhǔn)品吸光度是否超出范圍。S1 AbsS1 Abs定義校準(zhǔn)品定義校準(zhǔn)品1 1水平的上限和下限。水平的上限和下限。用于檢測試劑空白用于檢測試劑空白。校準(zhǔn)報警校準(zhǔn)報警DUPSENS1 Abs L

12、imitCalib. Limit常見報警類型常見報警類型潛在原因潛在原因Duplicate LimitDuplicate Limit加樣不準(zhǔn)加樣不準(zhǔn) ( (樣本、試劑樣本、試劑) )，攪拌，攪拌 (P)(P)，反應(yīng)杯，反應(yīng)杯光源老舊，環(huán)境，光源老舊，環(huán)境， 電壓電壓Sensitivity LimitSensitivity Limit校準(zhǔn)品、水點(diǎn)污染，試劑，校準(zhǔn)品單位更改校準(zhǔn)品、水點(diǎn)污染，試劑，校準(zhǔn)品單位更改未更改數(shù)值未更改數(shù)值Calibration LimitCalibration Limitcfascfas和水空白，加樣不準(zhǔn)，系統(tǒng)水，光源燈和水空白，加樣不準(zhǔn)，系統(tǒng)水，光源燈Standard

13、Deviation Standard Deviation LimitLimit不正確的加樣順序，光路，針不正確的加樣順序，光路，針( (加樣不精確加樣不精確) )Standard 1 Absorbance Standard 1 Absorbance 水質(zhì)，試劑，光源水質(zhì)，試劑，光源Standard ErrorStandard Error儀器，反應(yīng)過程，其它校準(zhǔn)報警儀器，反應(yīng)過程，其它校準(zhǔn)報警造成生化校準(zhǔn)報警的潛在可能原因造成生化校準(zhǔn)報警的潛在可能原因校準(zhǔn)報警校準(zhǔn)報警校準(zhǔn)報警校準(zhǔn)報警校準(zhǔn)報警校準(zhǔn)報警校準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)曲線Duplicate LimitDuplicate Limit重復(fù)性限制重復(fù)性限制不

14、更新不更新Sensitivity LimitSensitivity Limit靈敏度限制靈敏度限制不更新不更新Calibration LimitCalibration Limit校準(zhǔn)限制校準(zhǔn)限制更新更新Standard Deviation Standard Deviation LimitLimit標(biāo)準(zhǔn)差限制標(biāo)準(zhǔn)差限制可能更新可能更新Standard 1 Absorbance Standard 1 Absorbance Std1Std1吸光度吸光度不更新不更新Standard ErrorStandard Error標(biāo)準(zhǔn)錯誤伴隨標(biāo)準(zhǔn)錯誤伴隨不更新不更新如果校準(zhǔn)失敗，系統(tǒng)將自動使用之前有效的校準(zhǔn)曲線

15、計(jì)算標(biāo)本濃度。如果校準(zhǔn)失敗，系統(tǒng)將自動使用之前有效的校準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本濃度。生化項(xiàng)目檢測常用顯色指示系統(tǒng)1，NAD+NADH（NADP+NADPH）指示系統(tǒng)2，p-NP（磷酸對硝基苯酚）和 p-NA（硝基苯酚）指示系統(tǒng) 3，H2O2偶聯(lián)的指示系統(tǒng) 4，抗原抗體反應(yīng)指示系統(tǒng)，免疫比濁法 5，其它顯色反應(yīng) 1，NAD+NADH（NADP+NADPH）指示系統(tǒng)：反應(yīng)原理 ： NADH 和 NADPH 在 340nm 有特征性吸收峰，而 NAD+和 NADP+在 340nm無特征性吸收峰，利用其偶聯(lián)的脫氫酶(工具酶)反應(yīng)，根據(jù) 340nm 吸光度的變化，可以測定物質(zhì)的濃度或 活性。 臨床項(xiàng)目：ALT、A

16、ST、CK、LDH、CK-MB、-HBDH 、 Glu（己糖激酶法）、UREA、NH4+ 、CO2 等 1.5.2.2. 舉例說明ALT的測定原理（IFCC） 試劑成分和反應(yīng)公式： R1： NADH 、乳酸脫氫酶（LDH）； R2： L-丙氨酸 、-酮戊二酸 。 原理：NADH 的減少，引起 340nm 吸光度的下降，下降速率與 ALT 活性成正比(酶動力學(xué)法)。2，p-NP（磷酸對硝基苯酚）和 p-NA（硝基苯酚）指示系統(tǒng) 反應(yīng)原理： p-NP 和 p-NA 在 405nm 有特征性吸收峰，根據(jù) 405nm 吸光度的變化，可以測定物質(zhì)的濃 度或活。臨床項(xiàng)目： ALP、ACP、r-GT、AMY

17、 等。 舉例說明 ：ALP的測定原理（IFCC） 試劑成分和反應(yīng)公式。R1：AMP 緩沖液，鎂離子，鋅離子，PH10.44； R2：對硝基苯磷酸，防腐劑，PH8.5 原理：在鎂離子和鋅離子的存在下，堿性磷酸酶解離對硝基苯磷酸形成磷酸鹽和對硝基苯酚， 引起 405nm 吸光度的上升，上升速率與 ALP 活性成正比（動力學(xué)法）。 3，H2O2偶聯(lián)的指示系統(tǒng) 反應(yīng)原理： H2O2在過氧化物酶的作用下，可使單一個或成對的無色的色素原氧化成有色的色素，導(dǎo)致某 一波長吸光度的增加，因此可用來測定物質(zhì)的濃度或活性。 臨床項(xiàng)目：過氧化物酶法CHOL，GLU舉例說明: GLU 過氧化物酶法的測定原理R1：4-氨

18、基安替吡啉 、抗壞血酸氧化酶 R2：葡萄糖氧化酶（GOD）、過氧化物酶（PO D）、酚 。 測定原理：醌亞胺的生成，導(dǎo)致 500nm 吸光度的增加，增加的程度與 Glu 的含量成正比。4，抗原抗體反應(yīng)指示系統(tǒng)，免疫比濁法 反應(yīng)原理：特異性抗體與抗原(待測物質(zhì))在相應(yīng)的緩沖環(huán)境下反應(yīng)生成抗原抗體復(fù)合物，形成一定的濁 度，導(dǎo)致特定波長透光率的改變。在抗體過剩的前提下，改變程度與抗原濃度成正比。 臨床項(xiàng)目： apoAI、apoB、Lp(a)、IgG、IgA、IgM、C3、 C4、CRP 等。 5，其它顯色反應(yīng)TP 的反應(yīng)原理 ：蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性溶液中能與銅離子作用產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物，導(dǎo)致 540n

19、m 吸光度的增 加，增加的程度與蛋白質(zhì)的含量成正比。 ALB 的反應(yīng)原理： 在 pH4.2 環(huán)境中，溴甲酚綠在有非離子去垢劑聚氧乙烯月桂存在時，可與白蛋白形成藍(lán)綠色復(fù)合物，導(dǎo)致 630nm 吸光度的增加，增加的程度與白蛋白的含量成正比。 其它的顯色反應(yīng)還有 Ca 和 Mg 等物質(zhì)的測量方法， c 701c 702c 502/501應(yīng)用數(shù) 光度200200200 計(jì)算檢測888 血清指數(shù)333分析通量（最大）2000 個測試/小時2000 個測試/小時600 個測試/小時反應(yīng)體積100-250 L100-250 L100-250 L反應(yīng)溫度（孵育池）37 0.1C37 0.1C37 0.1C反應(yīng)

20、杯406 池（14 區(qū)域）406 池（14 區(qū)域）160 池（8 區(qū)域）反應(yīng)時間1-分鐘步驟中 3-10 分鐘 1-分鐘步驟中 3-10 分鐘1-分鐘步驟中 3-10 分鐘移液循環(huán)1.8 s1.8 s6 s復(fù)合方法非接觸超聲混合非接觸超聲混合非接觸超聲混合表 9-3 反應(yīng)系統(tǒng)反應(yīng)系統(tǒng) c 701c 702c 502/501試劑盒類型 cobas c 大容量試劑盒 cobas c pack MULTI 大容量試劑盒 cobas c 大容量試劑盒 cobas c pack MULTI 大容量試劑盒 cobas c 中等容量試劑盒 cobas c pack MULTI 中等容量試劑盒試劑加載/卸載手

21、動自動（試劑管理站進(jìn)行） 自動試劑識別自動（RFID）試劑管理站中自動（RFID）自動（條碼） 最大量試劑盒7070 （試劑管理站中附加 10 個） 60 試劑冷卻（試劑盤中）5-155-155-12試劑緩沖轉(zhuǎn)子容量-10 個試劑盒-試劑卸載托盤容量-12 個試劑盒10 個試劑盒試劑移液時間安排（最多使用 3 個時間點(diǎn)）R1：3.6 sR2：113.4 sR3：307.8 sR1：3.6 sR2：113.4 sR3：307.8 sR1：3.2 sR2：90.2 sR3：300.2 s試劑移液量5-180 L、增加幅度為 1 L（5-19 L：+ 20 L 水）質(zhì)控品剩余試劑體積移液 LLD 與

22、自動檢測讀數(shù)移液 LLD 與自動檢測讀數(shù)表 9-4 試劑系統(tǒng)試劑系統(tǒng) c 701c 702c 502/501樣品類型 血清血漿 尿 腦脊液 上清液 其他 血清血漿 尿 腦脊液 上清液 其他 血清血漿 尿 腦脊液 上清液 全血 其他樣品移液量1.5-35L，每次增加0.1L樣品堵塞探測壓力靈敏式凝塊探測系統(tǒng)液面?zhèn)鞲衅麟娙輦鞲屑夹g(shù)表 9-5 取樣系統(tǒng)取樣系統(tǒng) c 701c 702c 502光源鹵素?zé)簦?2 V / 50W光度計(jì)多波長分光光度計(jì)波長12種波長可供選擇：340，376，415，450，480，505，546，570，600，660，700，800 nm光路長度5.6 mm光程吸光度0.0000-3.3000線性吸光度不高于2.5光模式單色光和雙色光光度測定系統(tǒng)光度測定分析的流程1清洗反應(yīng)杯啟動后，機(jī)械部件將重設(shè)并回位。儀器開始進(jìn)行反應(yīng)池沖洗。反應(yīng)盤持續(xù)旋轉(zhuǎn)。沖洗噴嘴 A 從反應(yīng)池吸取反應(yīng)混合物。數(shù)個循環(huán)后，通過沖洗噴嘴 B/C，使用去離子水對反應(yīng)池進(jìn)行清洗。下一步，使用 CellCln 1，于沖洗臂中，通過噴嘴 D/E 對反應(yīng)池進(jìn)行清洗。使用CellCln 2，于沖洗臂中，通過噴嘴 F