雙脫氧末端終止測(cè)序法原理_過程和目標(biāo)基因cDNA序列拼接和分析

1、1雙脫氧末端終止法測(cè)序的原理、雙脫氧末端終止法測(cè)序的原理、過程和目標(biāo)基因序列的分析過程和目標(biāo)基因序列的分析教教 師：程師：程 琳琳2011 年年 11 月月分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)2實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 目目 的的1、通過本實(shí)驗(yàn)了解雙脫氧鏈終止法的基本原、通過本實(shí)驗(yàn)了解雙脫氧鏈終止法的基本原理，掌握理，掌握DNA測(cè)序的基本方法；測(cè)序的基本方法；2、學(xué)會(huì)序列查詢、核酸及蛋白質(zhì)的同源性搜、學(xué)會(huì)序列查詢、核酸及蛋白質(zhì)的同源性搜索和比對(duì)。索和比對(duì)。3 DNA測(cè)序技術(shù)主要有兩種方法，都是在測(cè)序技術(shù)主要有兩種方法，都是在20世世紀(jì)紀(jì)70年代中期發(fā)明的。年代中期發(fā)明的。 A. 雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法（the

2、 chain termination method），是通過），是通過合成合成與單鏈與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷互補(bǔ)的多核苷酸鏈來讀取待測(cè)酸鏈來讀取待測(cè)DNA分子的順序分子的順序。 B. 化學(xué)降解法化學(xué)降解法（chemical degradation method），），是將雙鏈?zhǔn)菍㈦p鏈DNA分子用化學(xué)試劑處理，分子用化學(xué)試劑處理，產(chǎn)生切口產(chǎn)生切口，用同位素標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序。用同位素標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序。一、一、DNA測(cè)序的方法測(cè)序的方法41. Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序原理雙脫氧鏈終止法測(cè)序原理 利用利用DNA聚合酶和聚合酶和雙脫氧鏈終止物測(cè)定雙脫氧鏈終止物測(cè)定DNA核苷酸順序的方法，核苷酸順序的方法，

3、是由英國劍橋分子生物是由英國劍橋分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的生物化學(xué)家學(xué)實(shí)驗(yàn)室的生物化學(xué)家F. Sanger等人于等人于1977年年發(fā)明的。發(fā)明的。5基本原理：基本原理： 聚丙烯酰胺凝膠電泳可以聚丙烯酰胺凝膠電泳可以區(qū)分長度只差一個(gè)核苷酸的區(qū)分長度只差一個(gè)核苷酸的DNA分子；分子； 利用利用DNA聚合酶不能夠區(qū)聚合酶不能夠區(qū)分分dNTP和和ddNTP的特性，的特性，使使ddNTP參入到寡核苷酸鏈參入到寡核苷酸鏈的的3-末端。因?yàn)槟┒?。因?yàn)閐dNTP 3不不是是-OH，不能與下一個(gè)核苷，不能與下一個(gè)核苷酸聚合延伸，從而終止酸聚合延伸，從而終止DNA鏈的增長。鏈的增長。672、具體操作：具體操作： 測(cè)序時(shí)分

4、成四個(gè)反應(yīng)測(cè)序時(shí)分成四個(gè)反應(yīng), 每個(gè)反應(yīng)除上述成分外每個(gè)反應(yīng)除上述成分外分別加入分別加入2,3-雙脫氧的雙脫氧的A, C, G, T核苷三磷酸（稱核苷三磷酸（稱為為ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后進(jìn)行聚然后進(jìn)行聚合反應(yīng)。在第一個(gè)反應(yīng)中合反應(yīng)。在第一個(gè)反應(yīng)中, ddATP會(huì)隨機(jī)地代替會(huì)隨機(jī)地代替dATP參加反應(yīng)，一旦參加反應(yīng)，一旦ddATP加入了新合成的加入了新合成的DNA鏈，由于其第鏈，由于其第3位的位的-OH變成了變成了-H, 所以不能所以不能繼續(xù)延伸繼續(xù)延伸,于是第一個(gè)反應(yīng)中所產(chǎn)生的于是第一個(gè)反應(yīng)中所產(chǎn)生的DNA鏈都是鏈都是到到A就終止了。就終止了。8 同理第二

5、個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生的都是以同理第二個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生的都是以C結(jié)結(jié)尾的尾的; 第三個(gè)反應(yīng)的都以第三個(gè)反應(yīng)的都以G結(jié)尾結(jié)尾, 第四個(gè)第四個(gè)反應(yīng)的都以反應(yīng)的都以T結(jié)尾結(jié)尾, 電泳后就可以讀出序電泳后就可以讀出序列了列了.9 假如有一個(gè)假如有一個(gè)DNA, DNA, 互補(bǔ)序列是互補(bǔ)序列是GATCCGAT, GATCCGAT, 我們?cè)囍鲆幌挛覀冊(cè)囍鲆幌? : 在第一個(gè)反應(yīng)中由于含有在第一個(gè)反應(yīng)中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到所以遇到G, T, C三個(gè)堿基時(shí)沒什么問題三個(gè)堿基時(shí)沒什么問題, 但遇到但遇到A時(shí)時(shí), 摻入的可能是摻入的可能是dATP或或ddATP, 比如已合成到比如已合成到G, 下一個(gè)如果參

6、與反應(yīng)的是下一個(gè)如果參與反應(yīng)的是ddATP則終則終止止, 產(chǎn)生一個(gè)僅有產(chǎn)生一個(gè)僅有2個(gè)核苷酸的序列個(gè)核苷酸的序列: GA, 否則繼續(xù)延伸否則繼續(xù)延伸, 可以可以產(chǎn)生序列產(chǎn)生序列GATCCG, 又到了下一個(gè)又到了下一個(gè)A了了. 同樣有兩種情況同樣有兩種情況, 如果如果是是ddATP摻入摻入, 則產(chǎn)生的序列是則產(chǎn)生的序列是GATCCGA, 延伸終止延伸終止, 否則可否則可以繼續(xù)延伸以繼續(xù)延伸, 產(chǎn)生產(chǎn)生GATCCGAT. 將得到如下結(jié)果：將得到如下結(jié)果：1產(chǎn)生的都是以產(chǎn)生的都是以A A結(jié)尾的片段結(jié)尾的片段: GA,GATCCGA: GA,GATCCGA。234產(chǎn)生的都是以產(chǎn)生的都是以C C結(jié)尾的片

7、段結(jié)尾的片段: GATC, GATCC: GATC, GATCC產(chǎn)生的都是以產(chǎn)生的都是以G G結(jié)尾的片段結(jié)尾的片段: G, GATCCG: G, GATCCG 產(chǎn)生的都是以產(chǎn)生的都是以T T結(jié)尾的片段結(jié)尾的片段: GAT, GATCCGAT: GAT, GATCCGAT10 制得的四組混合制得的四組混合物全部平行地點(diǎn)加在物全部平行地點(diǎn)加在變性聚丙烯酸受凝膠變性聚丙烯酸受凝膠電泳板上進(jìn)行電泳，電泳板上進(jìn)行電泳，每組制品中的各個(gè)組每組制品中的各個(gè)組分將按其鏈長的不同分將按其鏈長的不同得到分離，從而制得得到分離，從而制得相應(yīng)的放射性自顯影相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即圖譜。從所得圖譜即可直接讀

8、得可直接讀得DNADNA的堿的堿基序列?；蛄?。 即可得到測(cè)序結(jié)果：為即可得到測(cè)序結(jié)果：為GATCCGAT11制備單鏈模板制備單鏈模板 將單鏈模板與一小段引物退火將單鏈模板與一小段引物退火 加入加入DNA多聚酶多聚酶4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸分別加入少量分別加入少量4種雙脫氧核苷酸種雙脫氧核苷酸 將將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳條泳道電泳 根據(jù)根據(jù)4個(gè)堿基在個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列條泳道的終止位置讀出基因序列 3、技術(shù)路線：技術(shù)路線：124、 高通量自動(dòng)化測(cè)序高通量自動(dòng)化測(cè)序 DNA 序列分析自動(dòng)化包括兩個(gè)方面的內(nèi)容，一序列分析自動(dòng)化包括兩個(gè)方面的內(nèi)容，一方面是

9、指方面是指“分析反應(yīng)分析反應(yīng)”的自動(dòng)化，另一方面是指的自動(dòng)化，另一方面是指“讀片過程讀片過程”的自動(dòng)化。的自動(dòng)化。 自動(dòng)化的自動(dòng)化的DNA 序列分析，也是根據(jù)序列分析，也是根據(jù)Sanger 雙雙脫氧鏈終止脫氧鏈終止DNA測(cè)序法的基本原理發(fā)展起來的。測(cè)序法的基本原理發(fā)展起來的。13自動(dòng)化測(cè)序原理自動(dòng)化測(cè)序原理 自動(dòng)化測(cè)序類似于自動(dòng)化測(cè)序類似于PCR反應(yīng)，反應(yīng)，但只用一條引物，反應(yīng)混合物中但只用一條引物，反應(yīng)混合物中含有不同熒光標(biāo)記的含有不同熒光標(biāo)記的ddNTP與與4種種dNTP。由于每種。由于每種ddNTP帶有帶有各自特定的熒光顏色各自特定的熒光顏色,而簡(jiǎn)化為而簡(jiǎn)化為由由1個(gè)泳道同時(shí)判讀個(gè)泳道同

10、時(shí)判讀4種堿基。產(chǎn)種堿基。產(chǎn)物條帶經(jīng)過檢測(cè)儀時(shí)給出特定信物條帶經(jīng)過檢測(cè)儀時(shí)給出特定信號(hào)，由計(jì)算機(jī)判讀并記錄。號(hào)，由計(jì)算機(jī)判讀并記錄。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) ：可用雙鏈：可用雙鏈DNA做模板；做模板；模板用量少，不必克?。豢蓪?shí)現(xiàn)模板用量少，不必克??；可實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化。高通量自動(dòng)化。14高速自動(dòng)高速自動(dòng)DNA測(cè)序儀的結(jié)構(gòu)及工作原理測(cè)序儀的結(jié)構(gòu)及工作原理 由激光發(fā)射器產(chǎn)生的激由激光發(fā)射器產(chǎn)生的激光束，通過精密的光學(xué)系統(tǒng)光束，通過精密的光學(xué)系統(tǒng)后被導(dǎo)向凝膠表面的檢測(cè)區(qū)。后被導(dǎo)向凝膠表面的檢測(cè)區(qū)。在此，激光束垂直射向凝膠，在此，激光束垂直射向凝膠，同經(jīng)過檢測(cè)孔的同經(jīng)過檢測(cè)孔的DNA片段片段發(fā)生作用，并提供能量激發(fā)

11、發(fā)生作用，并提供能量激發(fā)熒光發(fā)色基團(tuán)發(fā)射出具特異熒光發(fā)色基團(tuán)發(fā)射出具特異性波長的熒光。這些熒光通性波長的熒光。這些熒光通過聚焦鏡集中后傳給濾光鏡過聚焦鏡集中后傳給濾光鏡/棱鏡組件，以便四種堿基棱鏡組件，以便四種堿基產(chǎn)生的不同標(biāo)記波長區(qū)別開產(chǎn)生的不同標(biāo)記波長區(qū)別開來。經(jīng)成像透像最后由高靈來。經(jīng)成像透像最后由高靈敏度的相機(jī)分段收集信號(hào)，敏度的相機(jī)分段收集信號(hào)，傳送給計(jì)算所分析處理。傳送給計(jì)算所分析處理。15 熒光化合物標(biāo)記熒光化合物標(biāo)記鏈終止法以熒光顏色鏈終止法以熒光顏色為標(biāo)記信號(hào)，每種為標(biāo)記信號(hào)，每種ddNTP各有各有1種代表種代表顏色；整個(gè)反應(yīng)在一顏色；整個(gè)反應(yīng)在一個(gè)試管中進(jìn)行；當(dāng)新個(gè)試管中進(jìn)

12、行；當(dāng)新合成的終止單鏈通過合成的終止單鏈通過熒光監(jiān)測(cè)儀時(shí)，可由熒光監(jiān)測(cè)儀時(shí)，可由光信號(hào)讀出末端核苷光信號(hào)讀出末端核苷酸并由電腦記錄。酸并由電腦記錄。1617Sanger雙脫氧鏈終止雙脫氧鏈終止DNA測(cè)序法的測(cè)序能力：測(cè)序法的測(cè)序能力： 手工測(cè)序：最大約手工測(cè)序：最大約300 bp； 自動(dòng)測(cè)序：最大約自動(dòng)測(cè)序：最大約1200 bp。18二、序列比對(duì)分析二、序列比對(duì)分析1. 相似性與同源性相似性與同源性 相似性相似性(similarity)： 是指一種很直接的是指一種很直接的數(shù)量關(guān)系數(shù)量關(guān)系，比如部分相同或，比如部分相同或相似的百分比或其它一些合適的度量。比如說，相似的百分比或其它一些合適的度量。

13、比如說，A序列和序列和B序列的相似性是序列的相似性是80，或者，或者4/5。這是個(gè)量。這是個(gè)量化的關(guān)系。當(dāng)然可進(jìn)行自身局部比較?；年P(guān)系。當(dāng)然可進(jìn)行自身局部比較。19同源性同源性(homology)： 指從一些數(shù)據(jù)中推斷出的兩個(gè)基因或蛋白指從一些數(shù)據(jù)中推斷出的兩個(gè)基因或蛋白質(zhì)序列具而共同祖先的結(jié)論，屬于質(zhì)序列具而共同祖先的結(jié)論，屬于質(zhì)的判斷質(zhì)的判斷。就是說就是說A和和B的關(guān)系上，只有是同源序列，或的關(guān)系上，只有是同源序列，或者非同源序列兩種關(guān)系。而說者非同源序列兩種關(guān)系。而說A和和B的同源性的同源性為為80都是不科學(xué)的。都是不科學(xué)的。20 序列的相似性和序列的同源性有一定的關(guān)系，序列的相似性和

14、序列的同源性有一定的關(guān)系，一般來說一般來說序列間的相似性越高的話，它們是同源序序列間的相似性越高的話，它們是同源序列的可能性就更高列的可能性就更高，所以經(jīng)常可以通過序列的相似，所以經(jīng)?？梢酝ㄟ^序列的相似性來推測(cè)序列是否同源。性來推測(cè)序列是否同源。 正因?yàn)榇嬖谶@樣的關(guān)系，很多時(shí)候?qū)π蛄械南嗾驗(yàn)榇嬖谶@樣的關(guān)系，很多時(shí)候?qū)π蛄械南嗨菩院屯葱跃蜎]有做很明顯的區(qū)分，造成經(jīng)常等似性和同源性就沒有做很明顯的區(qū)分，造成經(jīng)常等價(jià)混用兩個(gè)名詞。所以有出現(xiàn)價(jià)混用兩個(gè)名詞。所以有出現(xiàn)A序列和序列和B序列的同源序列的同源性為性為80一說。一說。21 序列相似性比較：序列相似性比較： 就是將待研究序列與就是將待研究序

15、列與DNA或蛋白質(zhì)序列庫或蛋白質(zhì)序列庫進(jìn)行比較，用于確定該序列的生物屬性，也就進(jìn)行比較，用于確定該序列的生物屬性，也就是找出與此序列相似的已知序列是什么。完成是找出與此序列相似的已知序列是什么。完成這一工作只需要使用兩兩序列比較算法。常用這一工作只需要使用兩兩序列比較算法。常用的程序包有的程序包有BLAST、FASTA等；等；22 序列同源性分析：序列同源性分析： 是將待研究序列加入到一組與之同源，是將待研究序列加入到一組與之同源，但來自不同物種的序列中進(jìn)行多序列同時(shí)比但來自不同物種的序列中進(jìn)行多序列同時(shí)比較，以確定該序列與其它序列間的同源性大較，以確定該序列與其它序列間的同源性大小。這是理論

16、分析方法中最關(guān)鍵的一步。完小。這是理論分析方法中最關(guān)鍵的一步。完成這一工作必須使用多序列比較算法。常用成這一工作必須使用多序列比較算法。常用的程序包有的程序包有CLUSTAL等；等；232. Blast簡(jiǎn)介及應(yīng)用簡(jiǎn)介及應(yīng)用（1）Blast簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介 BLAST 是由美國國立生物技術(shù)信息中心是由美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）開發(fā)的一個(gè)基于）開發(fā)的一個(gè)基于序列相似性序列相似性的數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)庫搜索程序。搜索程序。 BLAST是是“局部相似性基本查詢工局部相似性基本查詢工 具具”（Basic Local Alignment Search Tool）的縮）的縮寫。寫。24 Blast 是一個(gè)序列相似

17、性搜索的程序包，其是一個(gè)序列相似性搜索的程序包，其中包含了很多個(gè)獨(dú)立的程序，這些程序是根據(jù)中包含了很多個(gè)獨(dú)立的程序，這些程序是根據(jù)查詢的對(duì)象和數(shù)據(jù)庫的不同來定義的。比如說查詢的對(duì)象和數(shù)據(jù)庫的不同來定義的。比如說查詢的序列為核酸，查詢數(shù)據(jù)庫亦為核酸序列查詢的序列為核酸，查詢數(shù)據(jù)庫亦為核酸序列數(shù)據(jù)庫，那么就應(yīng)該選擇數(shù)據(jù)庫，那么就應(yīng)該選擇blastn程序。程序。 下表列出了主要的下表列出了主要的blast程序：程序：25主要的主要的blast程序程序程序名程序名查詢序列查詢序列數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫搜索方法搜索方法Blastn核酸核酸核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸數(shù)據(jù)庫中的序列核酸序列搜索逐一核酸數(shù)據(jù)庫中的序列

18、Blastp蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)序列搜索逐一蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列搜索逐一蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列序列Blastx核酸核酸蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)核酸序列核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列后和蛋白框翻譯成蛋白質(zhì)序列后和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列逐一搜索。質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列逐一搜索。Tblastn蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)核酸核酸蛋白質(zhì)序列和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列蛋白質(zhì)序列和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列6框翻譯后的蛋白質(zhì)序列逐一比對(duì)?？蚍g后的蛋白質(zhì)序列逐一比對(duì)。TBlastx核酸核酸核酸核酸核酸序列核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列，再和核框翻譯成蛋白質(zhì)序列，再和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列6框翻譯成的蛋白框翻譯成的蛋白

19、質(zhì)序列逐一進(jìn)行比對(duì)。質(zhì)序列逐一進(jìn)行比對(duì)。26（2） Blast資源資源1、NCBI主站點(diǎn)：主站點(diǎn)：/BLAST/（網(wǎng)絡(luò)版）（網(wǎng)絡(luò)版）/blast/ （單機(jī)版）（單機(jī)版）2、其他站點(diǎn)：、其他站點(diǎn)：http:/ /blast/（果蠅）（果蠅） 27 Blast結(jié)果會(huì)列出跟查詢序列相似性比較高，符合結(jié)果會(huì)列出跟查詢序列相似性比較高，符合限定要求的序列結(jié)果，根據(jù)這些結(jié)果可以獲取以下一限定要求的序列結(jié)果，根據(jù)這些結(jié)果可以獲取以下一些信息：些信息： 1.查詢序列

20、可能具有某種功能；查詢序列可能具有某種功能； 2.查詢序列可能是來源于某個(gè)物種；查詢序列可能是來源于某個(gè)物種； 3.查詢序列可能是某種功能基因的同源基因；查詢序列可能是某種功能基因的同源基因； 這些信息都可以應(yīng)用到后續(xù)分析中。這些信息都可以應(yīng)用到后續(xù)分析中。 28（3）Blast應(yīng)用應(yīng)用登陸登陸ncbi的的blast主頁主頁核酸序列核酸序列蛋白序列蛋白序列翻譯序列翻譯序列底下有其他一些針對(duì)特底下有其他一些針對(duì)特殊數(shù)據(jù)庫的和查看以往殊數(shù)據(jù)庫的和查看以往的比對(duì)結(jié)果等的比對(duì)結(jié)果等29Blast任務(wù)提交表單任務(wù)提交表單11.序列信息部分序列信息部分填入查詢（填入查詢（query）的序列）的序列序列范圍

21、序列范圍（默認(rèn)全部）（默認(rèn)全部）選擇搜索數(shù)據(jù)庫選擇搜索數(shù)據(jù)庫如果接受其他參數(shù)默認(rèn)如果接受其他參數(shù)默認(rèn)設(shè)置，點(diǎn)擊開始搜索設(shè)置，點(diǎn)擊開始搜索30Blast任務(wù)提交表單任務(wù)提交表單2設(shè)置搜索的范圍，設(shè)置搜索的范圍，entrez關(guān)鍵關(guān)鍵詞，或者選擇特定物種詞，或者選擇特定物種2.設(shè)置各種參數(shù)部分設(shè)置各種參數(shù)部分一些過濾選項(xiàng)，包括簡(jiǎn)一些過濾選項(xiàng)，包括簡(jiǎn)單重復(fù)序列，人類基因單重復(fù)序列，人類基因組中的重復(fù)序列組中的重復(fù)序列E值上限值上限窗口大小窗口大小如果你對(duì)如果你對(duì)blast的命令行選項(xiàng)熟悉的話，可以在這里加入更多的參數(shù)的命令行選項(xiàng)熟悉的話，可以在這里加入更多的參數(shù)31Blast任務(wù)提交表單任務(wù)提交表單3

22、3.設(shè)置結(jié)果輸出顯示格式設(shè)置結(jié)果輸出顯示格式選擇需要顯示的選項(xiàng)選擇需要顯示的選項(xiàng)以及顯示的文件格式以及顯示的文件格式顯示數(shù)目顯示數(shù)目Alignment的的顯示方式顯示方式篩選結(jié)果篩選結(jié)果E值范圍值范圍其他一些顯示格式參數(shù)其他一些顯示格式參數(shù)點(diǎn)擊開始搜索點(diǎn)擊開始搜索32提交任務(wù)提交任務(wù)返回查詢號(hào)（返回查詢號(hào)（requestid）可以修改顯示結(jié)果格式可以修改顯示結(jié)果格式修改完顯示格式后修改完顯示格式后點(diǎn)擊進(jìn)入結(jié)果界面點(diǎn)擊進(jìn)入結(jié)果界面33結(jié)結(jié)果頁面果頁面1圖形示意結(jié)果圖形示意結(jié)果34結(jié)果頁面結(jié)果頁面2目標(biāo)序列描述部分目標(biāo)序列描述部分帶有帶有g(shù)enbank的鏈接，點(diǎn)擊可以進(jìn)的鏈接，點(diǎn)擊可以進(jìn)入相應(yīng)的入

23、相應(yīng)的genbank序列序列匹配情況，分值，匹配情況，分值，e值值35結(jié)果頁面結(jié)果頁面3詳細(xì)的比對(duì)上的序列的排列情況詳細(xì)的比對(duì)上的序列的排列情況36（4）一個(gè)例子）一個(gè)例子假設(shè)以下為一未知蛋白序列假設(shè)以下為一未知蛋白序列query_seq MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASAD