實驗二微生物基因組DNA提取和鑒定

1、1實驗二實驗二 微生物基因組微生物基因組DNA的提取和鑒定的提取和鑒定2 學(xué)習(xí)并掌握從微生物中提取基因組學(xué)習(xí)并掌握從微生物中提取基因組DNA方方法及其原理。法及其原理。一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康亩?、實驗原理二、實驗原理?）微生物破碎細(xì)胞方法：溶菌酶、）微生物破碎細(xì)胞方法：溶菌酶、SDS裂解裂解。（2）破碎抽提核酸除去雜質(zhì)：）破碎抽提核酸除去雜質(zhì)： 首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與 其它成分分離；其它成分分離； 使核酸與蛋白質(zhì)分離；使核酸與蛋白質(zhì)分離； 除去脂類；除去脂類； 多糖的除去。多糖的除去。 在在EDTA和和SDS等去污劑存在下，用

2、蛋白酶等去污劑存在下，用蛋白酶K消化細(xì)胞，消化細(xì)胞，隨后用氯仿隨后用氯仿/異戊醇抽提，可以得到微生物基因組異戊醇抽提，可以得到微生物基因組DNA。4三、儀器和試劑三、儀器和試劑1、儀器、儀器： 低速離心機、高速冷凍離心機、恒溫?fù)u床、穩(wěn)壓電低速離心機、高速冷凍離心機、恒溫?fù)u床、穩(wěn)壓電源、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)。源、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)。2、材料與試劑、材料與試劑： 過夜培養(yǎng)的大腸桿菌過夜培養(yǎng)的大腸桿菌DH5、TE緩沖液、緩沖液、100g/LSDS、2mg/mL蛋白酶蛋白酶K、5mol/L NaCl、50g/LCTAB-0.5 mol/L NaCl、氯仿、氯仿/異戊醇異戊醇=24:1（V/V

3、）、異丙醇、）、異丙醇、1TAE、瓊脂糖、上樣緩沖液。瓊脂糖、上樣緩沖液。5四、實驗步驟四、實驗步驟1、DNA的提取的提?。?）將）將10mL過夜培養(yǎng)的過夜培養(yǎng)的大腸桿菌大腸桿菌DH5裝入裝入15mL離心管中，離心管中，4000r/min離心離心15min，棄上清。，棄上清。（2）加入）加入560L TE緩沖液緩沖液，將菌體重懸后轉(zhuǎn)移至，將菌體重懸后轉(zhuǎn)移至1.5mL離離心管中。心管中。（3）加入）加入30L 100g/LSDS溶液溶液和和30L 2mg/mL蛋白酶蛋白酶K溶溶液液，混勻后，混勻后，37水浴放置水浴放置30min。（4）加入）加入100L 5mol/LNaCl溶液溶液，充分混勻。

4、，充分混勻。（5）加入）加入80L 50g/LCTAB-0.5mol/LNaCl溶液溶液，混勻后，混勻后，65水浴放置水浴放置10min。6四、實驗步驟四、實驗步驟1、DNA的提取的提?。?）加入）加入600L 氯仿氯仿/異戊醇異戊醇，上下顛倒混勻后，上下顛倒混勻后，12000r/min離心離心5min，將上清吸入新離心管中。，將上清吸入新離心管中。（7）加入預(yù)冷的）加入預(yù)冷的異丙醇異丙醇，上下顛倒混勻后，上下顛倒混勻后，-20沉淀沉淀30min。（8）12000r/min離心離心10min，棄上清，棄上清。（9）加入）加入1mL 75%乙醇溶液乙醇溶液，充分混勻。，充分混勻。（10）1200

5、0r/min離心離心10min，棄上清。，棄上清。（11）加入）加入20L TE緩沖液緩沖液，混勻后，即為，混勻后，即為DNA溶液。溶液。7四、實驗步驟四、實驗步驟2、DNA電泳檢測電泳檢測（1）1%瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖凝膠：稱取0.2g瓊脂糖，加入瓊脂糖，加入20mL 1TAE緩沖液，在微波爐中加熱，反復(fù)加熱、振蕩緩沖液，在微波爐中加熱，反復(fù)加熱、振蕩2-3次，使瓊次，使瓊脂糖充分融化。待凝膠冷卻至脂糖充分融化。待凝膠冷卻至60左右，倒入插入梳子的左右，倒入插入梳子的凝膠板中（避免產(chǎn)生氣泡），讓凝膠自然凝固。凝膠板中（避免產(chǎn)生氣泡），讓凝膠自然凝固。（2）待凝膠凝固后，小心拔出梳子，避免前

6、后左右搖晃，）待凝膠凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右搖晃，以免破壞膠面及加樣孔，小心將凝膠和膠床放入電泳槽中，以免破壞膠面及加樣孔，小心將凝膠和膠床放入電泳槽中，加樣孔靠近陰極的一端。加樣孔靠近陰極的一端。8四、實驗步驟四、實驗步驟2、DNA電泳檢測電泳檢測（3）上樣電泳：將）上樣電泳：將20LDNA樣品溶液和樣品溶液和5L上樣緩沖液混上樣緩沖液混勻后，上樣，勻后，上樣，100V穩(wěn)壓電泳檢查，根據(jù)指示劑遷移的位置，穩(wěn)壓電泳檢查，根據(jù)指示劑遷移的位置，判斷是否中止電泳。切斷電源后，再取出凝膠。判斷是否中止電泳。切斷電源后，再取出凝膠。（4）照膠、拍照：將凝膠泡在）照膠、拍照：將凝膠泡在EB溶液（溶液（注意：注意：EB溶液為劇溶液為劇毒物，需帶上一次性手套拿取凝膠毒物，需帶上一次性手套拿取凝膠）中）中10min左右，進(jìn)入暗左右，進(jìn)