測(cè)序分析常見(jiàn)問(wèn)題整理學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1測(cè)序分析測(cè)序分析(fnx)常見(jiàn)問(wèn)題整理常見(jiàn)問(wèn)題整理第一頁(yè)，共31頁(yè)。四色圖譜四色圖譜(tp)：每一種顏色對(duì)應(yīng)一：每一種顏色對(duì)應(yīng)一種堿基種堿基ATCG第1頁(yè)/共31頁(yè)第二頁(yè)，共31頁(yè)。 影響影響(yngxing)(yngxing)測(cè)序質(zhì)量的主要測(cè)序質(zhì)量的主要因素因素第2頁(yè)/共31頁(yè)第三頁(yè)，共31頁(yè)。 一、引物對(duì)測(cè)序結(jié)果一、引物對(duì)測(cè)序結(jié)果(ji gu)(ji gu)的影響的影響第3頁(yè)/共31頁(yè)第四頁(yè)，共31頁(yè)。合成時(shí)部分引物合成時(shí)部分引物多多一個(gè)堿基一個(gè)堿基合成時(shí)部分引物合成時(shí)部分引物少少一個(gè)堿基一個(gè)堿基 現(xiàn)象：每個(gè)峰后面有個(gè)同樣熒光信號(hào)的小“尾巴”。 原因：合成(hchng)時(shí)引物多一個(gè)

2、堿基。 對(duì)策：重新合成(hchng)引物 現(xiàn)象：每個(gè)峰前面有個(gè)同樣熒光信號(hào)的小“尾巴”。 原因(yunyn)：合成時(shí)引物多一個(gè)堿基。 對(duì)策：重新合成引物第4頁(yè)/共31頁(yè)第五頁(yè)，共31頁(yè)。引物（模板引物（模板(mbn)）不純）不純 現(xiàn)象：整個(gè)峰圖噪音都比較高。（區(qū)別與小片段的干擾） 原因(yunyn)：引物（模板）純度太低，含有較多雜質(zhì) 對(duì)策：建議使用HPLC（柱子純化）或PAGE 純化的測(cè)序引物。脫鹽純化的引物純度較低，適合做普通PCR，但不建議用來(lái)測(cè)序。第5頁(yè)/共31頁(yè)第六頁(yè)，共31頁(yè)。模板模板(mbn)上沒(méi)有引物結(jié)合位點(diǎn)上沒(méi)有引物結(jié)合位點(diǎn) 現(xiàn)象：沒(méi)有特異性的測(cè)序峰圖 原因：引物無(wú)法結(jié)合模板

3、 對(duì)策重新(chngxn)設(shè)計(jì)引物第6頁(yè)/共31頁(yè)第七頁(yè)，共31頁(yè)。引物二聚體引物二聚體 現(xiàn)象：前面100多bp噪音高，后面(hu mian)正常（引物二聚體片段小大在100bp左右） 原因：引物二聚體未去除干凈 對(duì)策：割膠純化第7頁(yè)/共31頁(yè)第八頁(yè)，共31頁(yè)。雙引物結(jié)合雙引物結(jié)合(jih) 現(xiàn)象：從一開(kāi)始（區(qū)別于非單克?。┚统霈F(xiàn)兩套峰 原因(yunyn)：模板有兩個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)和兩個(gè)引物結(jié)合 對(duì)策：重新設(shè)計(jì)單個(gè)引物第8頁(yè)/共31頁(yè)第九頁(yè)，共31頁(yè)。 二、模板二、模板(mbn)(mbn)對(duì)測(cè)序結(jié)果的對(duì)測(cè)序結(jié)果的影響影響第9頁(yè)/共31頁(yè)第十頁(yè)，共31頁(yè)。噪音信號(hào)高噪音信號(hào)高終止峰PCR正常

4、終止后面的噪音峰PCR正常終止正常模板正常模板(mbn)與噪音與噪音第10頁(yè)/共31頁(yè)第十一頁(yè)，共31頁(yè)。模板模板(mbn)不純（非特異性不純（非特異性PCR產(chǎn)物）產(chǎn)物） 現(xiàn)象(xinxing)：每個(gè)峰下面都有其它顏色 原因：PCR主帶與雜帶混在一起測(cè)序 對(duì)策：凝膠電泳回收主帶，重新測(cè)序割膠割膠(gjio)純化純化第11頁(yè)/共31頁(yè)第十二頁(yè)，共31頁(yè)。點(diǎn)突變點(diǎn)突變(tbin)（SNP）突變突變(tbin)點(diǎn)點(diǎn)如果模板如果模板(mbn)有單核苷酸（堿基）突變（有單核苷酸（堿基）突變（SNP），測(cè)序圖形中其他的位點(diǎn)一般都是單一的），測(cè)序圖形中其他的位點(diǎn)一般都是單一的峰形，然后突然在某一個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)重

5、疊峰峰形，然后突然在某一個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)重疊峰(如圖中箭頭所示如圖中箭頭所示)。 第12頁(yè)/共31頁(yè)第十三頁(yè)，共31頁(yè)。移碼突變移碼突變(tbin)在450bp處因點(diǎn)突變導(dǎo)致(dozh)移碼，在528bp處又因點(diǎn)突變恢復(fù)第13頁(yè)/共31頁(yè)第十四頁(yè)，共31頁(yè)。雜合子雜合子(hz)雜合雜合(z h)變點(diǎn)變點(diǎn)雜合信號(hào)處的套峰強(qiáng)度(qingd)大小相等，都相當(dāng)于正常峰值的一半。第14頁(yè)/共31頁(yè)第十五頁(yè)，共31頁(yè)。非單克隆非單克隆特征：左邊清晰，右邊全部特征：左邊清晰，右邊全部(qunb)像雜合子像雜合子原因：挑克隆時(shí)兩個(gè)質(zhì)?；煸谝黄鹪颍禾艨寺r(shí)兩個(gè)質(zhì)?；煸谝黄饘?duì)策：新挑克隆，重新制對(duì)策：新挑克隆，重新制

6、DNA第15頁(yè)/共31頁(yè)第十六頁(yè)，共31頁(yè)。 三、純化三、純化(chn hu)(chn hu)對(duì)測(cè)序結(jié)果對(duì)測(cè)序結(jié)果的影響的影響第16頁(yè)/共31頁(yè)第十七頁(yè)，共31頁(yè)。染料染料(rnlio)峰峰特征：染料峰位于(wiy)序列的前100bp左右，是殘余的A、T、C、G、4個(gè)BigDye峰，其不影響其它序列的可靠性。第17頁(yè)/共31頁(yè)第十八頁(yè)，共31頁(yè)。酒精酒精(jijng)峰峰特征：酒精峰位于序列(xli)的200bp-300bp堿基之間，圖譜被“透明”抬高，其同樣不影響其它序列(xli)的可靠性。第18頁(yè)/共31頁(yè)第十九頁(yè)，共31頁(yè)。熒光熒光(ynggung)物質(zhì)污染物質(zhì)污染 現(xiàn)象：紅色峰異常高。

7、 原因：未知大分子熒光物質(zhì)污染，恰好是紅色，被軟件誤認(rèn)為紅色峰。 對(duì)策：依次(yc)更換水、緩沖液、甲酰胺、測(cè)序膠、毛細(xì)管；清洗或更換膠引導(dǎo)塊、針筒。第19頁(yè)/共31頁(yè)第二十頁(yè)，共31頁(yè)?！搬斪俞斪?dng zi)”峰峰 現(xiàn)象：四色并存突然拔起的尖峰(jin fn)，峰形銳利。 原因：毛細(xì)管內(nèi)有氣泡、灰塵、尿素結(jié)晶等，對(duì)激光全反射。 對(duì)策 灌膠時(shí)，避免氣泡產(chǎn)生； 上樣前，樣品先離心； 毛細(xì)管、檢測(cè)窗口保持清潔； 膠內(nèi)有尿素結(jié)晶時(shí)，注意不要吸進(jìn)注射器； 樣品純化干凈。第20頁(yè)/共31頁(yè)第二十一頁(yè)，共31頁(yè)。有機(jī)物污染有機(jī)物污染(wrn)（瀑布效應(yīng)）（瀑布效應(yīng)） 現(xiàn)象：基線從高處突然下降。 原因：

8、有機(jī)物進(jìn)入毛細(xì)管，受激發(fā)產(chǎn)生一定波長(zhǎng)(bchng)的熒光，抬高基線。 對(duì)策：依次更換水、緩沖液、甲酰胺、測(cè)序膠、毛細(xì)管；清洗或更換膠引導(dǎo)塊、針筒。第21頁(yè)/共31頁(yè)第二十二頁(yè)，共31頁(yè)。 四、困難四、困難(kn nn)(kn nn)模板對(duì)測(cè)序結(jié)模板對(duì)測(cè)序結(jié)果的影響果的影響第22頁(yè)/共31頁(yè)第二十三頁(yè)，共31頁(yè)。特殊特殊(tsh)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)第23頁(yè)/共31頁(yè)第二十四頁(yè)，共31頁(yè)。Poly結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)(jigu)Poly在序列(xli)的前端對(duì)信號(hào)影響較小, Poly在序列(xli)的后端對(duì)信號(hào)影響較大。Poly-G/poly-C 很容易導(dǎo)致信號(hào)(xnho)中斷和信號(hào)(xnho)亂。第24頁(yè)/共31頁(yè)第

9、二十五頁(yè)，共31頁(yè)。高高GCPoly-G/poly-C 是高是高GC的一種，很容易的一種，很容易(rngy)導(dǎo)致信號(hào)衰減。導(dǎo)致信號(hào)衰減。局部高局部高GC一般會(huì)導(dǎo)致信號(hào)一般會(huì)導(dǎo)致信號(hào)(xnho)中斷和亂峰。中斷和亂峰。第25頁(yè)/共31頁(yè)第二十六頁(yè)，共31頁(yè)。重復(fù)重復(fù)(chngf)序列序列GT 重復(fù)導(dǎo)致重復(fù)導(dǎo)致(dozh)信號(hào)衰減信號(hào)衰減A/G重復(fù)重復(fù)(chngf)導(dǎo)致信號(hào)衰減導(dǎo)致信號(hào)衰減或信號(hào)亂或信號(hào)亂第26頁(yè)/共31頁(yè)第二十七頁(yè)，共31頁(yè)?；匚慕Y(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)其他其他(qt)復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)導(dǎo)致衰減復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)導(dǎo)致衰減第27頁(yè)/共31頁(yè)第二十八頁(yè)，共31頁(yè)。 四、機(jī)器因素四、機(jī)器因素(yn s