萊克多巴胺檢測標準

1、浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布2005-03-17實施2005-02-17發(fā)布飼料中萊克多巴胺的測定Determination of ractopamine in feedstuffsDB33/T 5392005DB33浙江省地方標準ICS 65.120B 46備案號：前 言本標準是在參閱了國內(nèi)外文獻的基礎(chǔ)上，根據(jù)我國技術(shù)發(fā)展水平研究制定的，采用了酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜熒光檢測法和氣相色譜-質(zhì)譜法。本標準由浙江省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標準由浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心、浙江省疾病預(yù)防控制中心負責(zé)起草，浙江一星集團飼料有限責(zé)任公司參與起草。 本標準主要起草人：陳慧華、吳平谷、應(yīng)永飛、任玉琴、屈健、周文

2、海、陳勇、浦琴華。飼料中萊克多巴胺的測定1 范圍本標準規(guī)定了以酶聯(lián)免疫（ELISA）法、高效液相色譜（HPLC）法和氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）法檢測飼料中萊克多巴胺的方法，規(guī)定GCMS法為仲裁法。本標準適用于飼料和飼料添加劑中萊克多巴胺的測定。酶聯(lián)免疫（ELISA）法為篩選方法，檢測限為0.01mg/kg，高效液相色譜（HPLC）法和氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）法為定量方法，定量限HPLC法為0.1mg/kg、GCMS法為0.05mg/kg。線性范圍：酶聯(lián)免疫（ELISA）法為0.005ng-0.05ng，高效液相色譜（HPLC）法為2.5ng-10ng，氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）法為0.05ng-1

3、.0ng。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T 14699.1 飼料采樣方法3 試樣制備按GB/T 14699.1抽取有代表性的飼料樣品，用四分法縮減取約200g，粉碎至過0.45mm孔徑的分析篩，混勻，裝入磨口瓶中備用。第一法 酶聯(lián)免疫法4 原理與方法4.1 原理本測定方法是酶聯(lián)免疫法中的競爭性測定法，其

4、主要原理是：吸附在孔內(nèi)的萊克多巴胺與標準或樣品中的萊克多巴胺競爭性地與萊克多巴胺抗體相結(jié)合，與標準品或樣品相結(jié)合的萊克多巴胺抗體被洗滌去除后，只剩下與微孔內(nèi)藥物相結(jié)合的抗體，其再與加入的酶標記的第二抗體相結(jié)合，酶底物在酶作用下產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，吸光度的高低與樣品中萊克多巴胺的含量成反比。4.2 方法采用萊克多巴胺酶聯(lián)免疫試劑盒或類似產(chǎn)品，按試劑盒的使用說明操作。5 試劑和溶液5.1 除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T 6682二級水的規(guī)定。5.2 PBS緩沖液：用水10倍稀釋廠商提供的濃縮PBS緩沖液。5.3 工作洗液：用水20倍稀釋廠商提供的濃縮洗液。5.4 乙酸乙

5、酯。5.5 碳酸鹽緩沖液：稱取4.3g碳酸鈉（Na2CO310H2O），2.9g碳酸氫鈉（NaHCO3），加水至1000mL，搖勻，調(diào)節(jié)pH值至9.5。5.6 提取液：取10mL甲醇，加90mLPBS緩沖液，搖勻。5.7 甲醇。5.8 第二抗體工作液：用第二抗體稀釋液2500倍稀釋第二抗體。6 儀器與設(shè)備6.1 微孔板酶標儀(帶450nm濾光片)。6.2 振蕩器。6.3 冷凍離心機。6.4 微量加樣器及配套吸頭：20L, 50L, 100L, 200L 。6.5 冰箱。6.6 洗板機。6.7 生化培養(yǎng)箱。6.8 氮吹儀。6.9 分析天平：感量0.01g。7 測定步驟7.1 注意事項不同品牌的試

6、劑盒其操作步驟可能略有差別，具體操作步驟可根據(jù)試劑盒使用說明書略作調(diào)整。7.2 試樣處理取3g試樣于50mL離心管中，加入6mL提取液（5.5），上下手搖數(shù)次，加入6mL碳酸鹽緩沖液（5.4），再加入8mL乙酸乙酯（5.3），振蕩30min；以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，移取2.0mL上層有機相至另一新試管中，氮吹至干。加入50L甲醇（5.6）溶解殘余物后，再加入450L PBS緩沖液（5.1），即為供試溶液，取50L進行ELISA測定。7.3 測試程序7.3.1 根據(jù)所測定樣品及標準數(shù)，計算出所需微孔條數(shù)，將微孔條插入微孔架，標準和樣品做兩個孔的平行重復(fù)，記錄標準和樣品的位置。7.3.

7、2 加入50L的標準品和處理好的樣品到各自的微孔中，標準和樣品做兩個平行重復(fù)。7.3.3 加入100L第一抗體溶液到每一個微孔中，在37孵育30分鐘后倒出孔中的液體，將微孔架倒置在洗水紙上拍打（每輪拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，再加入工作洗液（5.2）250L，重復(fù)操作兩遍。最后用吸水紙吸干。7.3.4 加入150L稀釋的酶標記的第二抗體（5.7）37孵育30分鐘后倒出孔中的液體，將微孔架倒置在洗水紙上拍打（每輪拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，再加入工作洗液（5.2）250L，重復(fù)操作兩遍。最后用吸水紙吸干。7.3.5 加入100L酶底物液到微孔中，充分混合并在室溫孵育5-10min

8、。7.3.6 加入50L反應(yīng)終止液到微孔中，混合后在450nm處測量吸光度值。8 結(jié)果計算以空白（濃度為0的標準溶液）吸光度值為100%計算，折算出各標準和樣品的相對吸光度值。標準的吸光度值(或樣品) 相對吸光度值（%） = 100 空白的吸光度值計算出的標準相對吸光度值繪成為一個對應(yīng)濃度(ng/L)的半對數(shù)坐標系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在200-2000ng/L范圍內(nèi)應(yīng)當成為線性。相對應(yīng)每一個樣品的濃度(ng/L)可以從校正曲線上讀出。第二法 高效液相色譜法9 方法原理用2氨/甲醇溶液提取試樣中的萊克多巴胺，經(jīng)固相萃取柱凈化，濃縮后用2乙酸溶液定容，用高效液相色譜熒光檢測法分離測定。 10 試劑和

9、溶液10.1 除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T 6682二級水的規(guī)定。10.2 乙腈：色譜純。10.3 甲醇。10.4 乙腈。10.5 乙酸乙酯。10.6 冰醋酸。10.7 無水硫酸鈉。10.8 戊烷磺酸鈉：色譜級。10.9 正己烷。10.10 氨水。10.11 50乙腈/乙酸乙酯溶液：取250mL乙腈加乙酸乙酯至500mL，混勻。10.12 50甲醇/乙酸乙酯溶液：取250mL甲醇加乙酸乙酯至500mL，混勻。10.13 2乙酸溶液：取5mL冰醋酸加水至250mL，混勻。10.14 固相萃取柱固相萃取柱的填充料為聚苯乙烯。）：每根柱填料量為500mg，柱體積5

10、mL。10.15 2氨/甲醇溶液：取20mL氨水加甲醇至1000mL，混勻。10.16 戊烷磺酸鈉溶液：取800mL水，加20mL冰醋酸和0.87g戊烷磺酸鈉（C5H11O3SNaH2O），混勻。10.17 萊克多巴胺標準溶液10.17.1 萊克多巴胺貯備液（250g/mL） 精密稱取萊克多巴胺對照品25mg，置100mL容量瓶中，用甲醇（10.2）溶解并定容至刻度，置-20冰箱中，可保存3個月。10.17.2 萊克多巴胺稀釋液 (5g/mL) 精密量取1mL萊克多巴胺貯備液（10.16.1），置50mL棕色容量瓶中，用甲醇（10.2）稀釋并定容至刻度，為萊克多巴胺工作液。10.17.3 萊克

11、多巴胺工作溶液 分別準確吸取一定量的標準稀釋液（10.16.2），用2乙酸溶液（10.12）稀釋、定容，配制成濃度為0.10g/mL、0.20g/mL、0.50g/mL、1.0g/mL、2.0g/mL、5.0g/mL的標準溶液。11 儀器設(shè)備11.1 高效液相色譜儀（配熒光檢測器）。11.2 冷凍離心機 能達到5000rpm。11.3 振蕩器。11.4 離心管 50mL，10mL。11.5 微孔濾膜 0.45m。11.6 渦旋混合器。11.7 分析天平 精度0.0001g。11.8 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。11.9 雞心瓶 50mL。11.10 氮吹儀。12 測定步驟12.1 試樣提取稱取試樣3.0g，準

12、確加入2氨/甲醇溶液（10.14）25mL，渦旋振蕩1min，超聲振蕩10min，5000rpm離心5min，取上清液10 mL 至雞心瓶中，50旋轉(zhuǎn)蒸干。12.2 試樣凈化用2mL甲醇（10.2）和2mL正己烷（10.8）溶解雞心瓶中的殘余物，重復(fù)一次，棄去上層；再加入2mL正己烷（10.8），重復(fù)一次，分出甲醇至10mL離心管中，45下氮氣吹干。用5mL乙酸乙酯（10.4）溶解，加少量無水硫酸鈉（10.6），5000rpm離心3min。洗滌液過固相萃取柱（10.13），先經(jīng)5mL乙酸乙酯潤洗）用3mL50乙腈/乙酸乙酯溶液（10.10）洗滌柱子，然后用5mL50甲醇/乙酸乙酯溶液（10.1

13、1）洗脫收集，氮吹至干。12.3 定容用2乙酸溶液（10.12）定容到1mL，過膜，上機。12.4 測定12.4.1 高效液相色譜條件色譜柱：C18柱，長250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒度5m，或相當者。保護柱：C18柱，長20mm，內(nèi)徑3.9mm，粒徑5m，或相當者。流動相：戊烷磺酸鈉溶液（10.15）：乙腈（10.1）80：20，使用前脫氣。流速：1.0mL/min。激發(fā)波長：226nm。發(fā)射波長：306nm。進樣量：50L。12.4.2 上機測定萊克多巴胺對照溶液和試液分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積進行計算。13 結(jié)果計算試樣中萊克多巴胺的含量按下式計算： nAiCsVs

14、 X AsM式中：n樣品稀釋倍數(shù)；Ai樣品峰面積；As對照溶液峰面積；Vs定容體積（mL）；Cs對照溶液濃度（g/ mL）；M樣品重量（g）；X試樣中萊克多巴胺的含量（mg/kg）；測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字。14 精密度14.1 重復(fù)性 實驗室內(nèi)平行測定間的相對偏差不大于10。14.2 再現(xiàn)性 實驗室間測定的相對偏差不大于15。第三法 氣相色譜-質(zhì)譜法15 方法原理試樣中萊克多巴胺先用2氨/甲醇溶液提取，甲醇和正己烷分配脫脂，然后用柱凈化，BSTFA（雙三甲基硅基三氟乙酰胺）+TMCS（三甲基氯硅烷）衍生，最后用GCMS法進行定性定量分析。16 儀器與試劑16.1

15、氣-質(zhì)聯(lián)用儀。 16.2 烘箱。16.3 BSTFA（雙三甲基硅基三氟乙酰胺）+1%TMCS （三甲基氯硅烷）。16.4 萊克多巴胺標準貯備溶液（5mg/mL）：準確稱取50mg 萊克多巴胺于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，存放在冰箱中備用。16.5 萊克多巴胺標準工作溶液：取萊克多巴胺標準貯備溶液，用甲醇稀釋至所需濃度。16.6 甲苯。16.7 其它儀器，同11。16.8 其它試劑，同10。17 測定步驟17.1 試樣提取同HPLC法12.1。17.2 試樣凈化同HPLC法12.2。17.3 試樣衍生 蒸發(fā)剩余物加0.1 mL BSTFA+1%TMCS（16.3），加蓋后于旋渦混

16、合器上震蕩，在80的烘箱中加熱1.0 h，氮氣吹干，加0.2mL甲苯（16.5）溶解。取適量的萊克多巴胺標準工作溶液（16.4），氮氣吹干，與試樣同法進行衍生化。17.4 色譜條件 色譜柱：5%苯基甲基聚硅氧烷彈性石英毛細管柱(30 m0.25 mm0.25m)，或相當者。進樣口溫度：300。柱溫程序：初溫150，保持3 min，然后以10min升至230，保持10min，再以20min升至280保持10min。 載氣：高純氦氣（99.999%）。流速：1.0mL/min，不分流進樣。進樣量：1.0L。17.5 質(zhì)譜條件 EI源：源溫230。 電子能量：70eV。接口溫度：280。 電子倍增器電壓：1506V。 質(zhì)量掃描范圍：30550U。 選擇離子監(jiān)測方式（SIM）。監(jiān)測離子（m/z）：267、