微生物綜合實驗設(shè)計方案

1、微生物綜合實驗設(shè)計方案第八小組（曹婉儀 蔡楚萍 貝錦濤 張韻紅）1、 取樣取三個經(jīng)高壓蒸汽滅菌的錐形瓶，于華師校園內(nèi)湖中取水樣。為使取樣具有代表性和全面性，分別選取三個取樣點，取樣點1：湖的東面，取樣點2：中間湖邊，取樣點3：湖的西面，分別編號1.2.3，于水面以下10cm，取水各100mL，蓋好瓶塞。器具：三角瓶*3個二、測水體pH值為了大致地確定水體微生物的生長適宜pH（個人感覺這說法有點奇怪，好像暗示測出來的pH就是適宜生長的pH似的，至少改為：為了了解華師湖水的pH吧，或者改為其他更好的說法）話說，我們就是大概要測一下它們大致的破H呀這是我們的目的呀，取好水樣后，分別用pH計測量三個水

2、樣的值，每個水樣各測量三次，取平均值。將三個水樣混合均勻，得到混合水樣，用pH計測量pH三次，取平均值。器具：pH計3、 分離提純2種微生物1、材料：混合水樣2、方法操作名稱具體步驟試劑和材料器具（經(jīng)高壓蒸汽滅菌）配置牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基400mL1、配置牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基400mL，分裝于兩個三角瓶2、高壓蒸汽滅菌（滅菌材料：250ml三角瓶*5，培養(yǎng)皿*1616個，分別是：稀釋涂布8個，兩次劃線各4個，試管*11，1ml移液管*5,10mll量筒*1）覺得量筒沒有必要滅菌的3、倒16個平板 4支試管斜面（按原來寫的也要13個平板，我不是很懂怎么會有13個呢？怎么會是10個，而且還沒有

3、設(shè)置對照的平板；如果要作×10000覺得沒有必要做*10000的太大了吧a/如果還是怕菌太多了那就少加一點水樣不就得了，還要更多平板。我覺得做1520個平板比較好。NaCl 2g蛋白胨4g牛肉膏1.2g 400mL水1mol/LNaOH1mol/L HCI(pH77.6)高壓蒸汽滅菌鍋天平玻璃棒500ml大燒杯*1個250ml三角瓶*2個封口膜*2張繩子*2條培養(yǎng)皿16套試管*4個膠塞/棉塞*4個報紙多張稀釋涂布分離微生物1、取0.2ml混合水樣進行稀釋，設(shè)置四個梯度：原液、×10、×100、×1000，分別裝于4個試管中，標明稀釋度，每種稀釋度5ml2

4、、涂布8個平板3、37恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h混合水樣蒸餾水空白平板*8個恒溫培養(yǎng)箱1ml移液管*5個10ml量筒試管*4個酒精燈酒精棉球涂布器標簽紙平板劃線分離微生物1、選取稀釋涂布平板操作中分離程度較好的兩種微生物涂布分離之后，我們針對的對象就是細菌所以，只用一種培養(yǎng)基培養(yǎng)時間也不用變化的的平板菌落，進行平板劃線，各劃線2個平板2、37恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h涂布分離的平板空白平板*4個恒溫培養(yǎng)箱酒精燈酒精棉球接種環(huán)標簽紙平板劃線分離微生物1、兩種微生物均選取劃線操作效果好的菌落，進行第二次平板劃線操作，各劃線2個平板2、 37恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h第一次劃線分離的不同菌種的平板*

5、2個空白平板*4個恒溫培養(yǎng)箱酒精燈酒精棉球接種環(huán)標簽紙平板菌種接種到試管保藏1、用接種環(huán)把菌種接種到試管斜面，每個菌種接種2個斜面2、37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h3、待菌種在固體斜面培養(yǎng)基上生長豐滿后，注明菌類或菌種名、保藏日期、保藏人，然后置于48的冰箱中保存第二次劃線分離的不同菌種的平板*2個空白斜面培養(yǎng)基*4個恒溫培養(yǎng)箱冰箱酒精燈酒精棉球接種環(huán)標簽紙四、革蘭氏染色覺得可以寫成列表的形式這樣看起來好像整潔一點哦·所以我把它改成了這樣子細菌的革蘭氏染色1.實驗材料1.1材料 第二次劃線分離的不同菌種的平板*2個1.2試劑： 無菌水、結(jié)晶紫、碘液、95%乙醇、番紅1.3器具 載玻片、接

6、種環(huán)、酒精燈2.實驗方法步驟序號操作名稱操作方法1制片涂片：滴1滴無菌水于載玻片，挑取少許菌體與水滴均勻混合干燥：火焰上方略加溫固定：用加熱法，通過火焰3次2染色結(jié)晶紫初染1min，水洗；碘液媒染1min，水洗；95%乙醇脫色2030s，水洗；番紅復(fù)染1min，水洗3鏡檢顯微鏡油鏡觀察五、觀察細菌的形態(tài)特征在高倍鏡和油鏡下觀察細菌形態(tài)，拍下照片，畫圖，描述形態(tài)特征器具覺得寫成“工具”好一點吧：顯微鏡六、生理生化試驗（淀粉水解、糖酵解）（1）淀粉水解實驗還是覺得列表的形式好點的操作名稱實驗方法接種以無菌操作技術(shù)，把兩個菌種接種到同一個平板上，劃成“+”字形，平板的一邊接一個種培養(yǎng)在平皿用“培養(yǎng)皿

7、”正規(guī)點吧底部做好記號，蓋上蓋，37恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h檢驗感覺用“檢驗”不是很好平皿蓋打開，滴加盧卡氏碘液于接種處記錄結(jié)果有水解圈：淀粉水解實驗陽性，用+表示；無水解圈：淀粉水解實驗陰性，用-表示(2)糖酵解實驗同樣的把它也調(diào)整成列表格的形式1 實驗材料 1.1實驗材料 第二次劃線分離的不同菌種的平板*2個、空白平白*1個、試管*5個 1.2實驗試劑盧卡氏碘液, 葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試劑蛋白胨0.1g,NaCl 0.25g,K2HPO4 0.01g,水 50ml,溴麝香草酚藍（1%水溶液） 0.15ml，葡萄糖 0.5g 1.3實驗器具 恒溫培養(yǎng)箱、酒精燈、酒精棉球、接種環(huán)、標簽紙2 實驗

8、方法 操作名稱操作方法配置糖發(fā)酵培養(yǎng)基 配置葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基50ml,分裝5支試管中，高壓蒸汽滅菌接種取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3支，分別接入兩種菌種，用標簽紙標明菌類或菌名、發(fā)酵培養(yǎng)基名稱，第3支不接種，作為對照。接種后，輕搖試管，使混合均勻培養(yǎng)37恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24h觀察記錄結(jié)果：黃色、有氣泡：產(chǎn)酸產(chǎn) 氣，用0表示 黃色、無氣泡：產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，用+表示 紫色、無氣泡：不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，用-表示配置糖發(fā)酵培養(yǎng)基：分別稱取蛋白胨和NaCl溶于熱水中，調(diào)pH至7.4，再加入溴麝香草酚藍（先用少量95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液），加入糖類，分裝試管，裝量45cm高，并倒放入一德漢氏小管（管口向

9、下，管內(nèi)充滿培養(yǎng)液）。115濕熱滅菌20min。滅菌時注意適當延長煮沸時間，盡量把冷空氣排盡，以使德漢氏小管內(nèi)不存在氣泡。常用的糖類：如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖等（后兩種糖的用量常加大為1.5%）七、配置菌懸液八、探究pH對細菌生長的影響1）第一次測量分光光度值(1)材料：上述菌懸液(2)試劑:1mol/L NaOH 或1mol/L HCL調(diào)至pH分別為3、4、5、6、7、8、9牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，無菌生理鹽水自來水（需要熱水溶解牛肉膏）。(3)250ml三角瓶7個，試管7支，配置牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基7個，pH計，大燒杯（是否需要校準），恒溫搖床。(4)步驟: 操作試劑

10、或用具配置牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基NaCl 8g 蛋白胨16g 牛肉膏4.8g無菌生理鹽水1600ml 7個250ml三角瓶 試管7支 ，每個三角瓶中倒入200ml液體培養(yǎng)基，其余分裝試管（約25ml/支）調(diào)pH值1mol/l NaCl或 HCI溶液 pH計包扎培養(yǎng)基并且滅菌高壓滅菌鍋121攝氏度20min接種（無菌操作）：移液管移取20.5ml菌懸液于不同pH的三角瓶中移液管 吸氣球 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基置于37度恒溫箱中培養(yǎng)24h恒溫搖床測分光光度值分光光度計OD600記錄數(shù)據(jù)并且描繪關(guān)系圖2）第二次測量分光光度值(1)材料：重新配置的菌懸液(2)試劑:1mol/L NaOH 或1mol/

11、L HCL調(diào)至pH分別為6、6.4、6.8、7.2、7.6、8(假設(shè)1)中最適pH為7)牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，無菌生理鹽水自來水（需要熱水溶解牛肉膏）。(3)250ml三角瓶5個，試管5支，配置牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基5個，pH計，大燒杯（是否需要校準），恒溫搖床。(4)步驟: 操作試劑或用具配置牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基NaCl 5.5g 蛋白胨11g 牛肉膏3.3g 無菌生理鹽水1100ml 5個250ml三角瓶 試管5支 ，每個三角瓶中倒入200ml液體培養(yǎng)基，其余分裝試管（約20ml/支）調(diào)pH值1mol/l NaCl或 HCI溶液 pH計包扎培養(yǎng)基并且滅菌高壓滅菌鍋121攝氏度20min接種（無菌操作）：移液管移取20.5ml菌懸液于不同pH的三角瓶中移液管 吸氣球 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基置于37度恒溫箱中培養(yǎng)24h恒溫搖床測分光光度值分光光度計OD600記錄數(shù)據(jù)并且描繪關(guān)系圖附：（1） 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH77.6（2） 淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸餾水1000ml，瓊脂1520g，121攝氏度滅菌20min。（3） 糖發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.2g，N