基因組學(xué)基礎(chǔ)

1、第1講基因組學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)遺傳標(biāo)記nTo use DNA you need a roadmapn一、遺傳標(biāo)記的發(fā)展n二、分子遺傳標(biāo)記n三、分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用一、遺傳標(biāo)記的發(fā)展n1、形態(tài)學(xué)標(biāo)記n2、細(xì)胞遺傳標(biāo)記n3、生化與免疫遺傳標(biāo)記n4、分子遺傳標(biāo)記1、形態(tài)學(xué)標(biāo)記n形態(tài)學(xué)標(biāo)記(morphological marker)能夠用肉眼識(shí)別和觀察、明確顯示遺傳多樣性的外觀性狀。n特點(diǎn)簡(jiǎn)單直觀，但標(biāo)記數(shù)目少，多態(tài)性低，易受外界條件的影響；依據(jù)它進(jìn)行選擇的準(zhǔn)確性差，所需時(shí)間較長(zhǎng)，選擇效率也較低。古代形態(tài)學(xué)標(biāo)記n公元前4000年，伊拉克的古代巴比倫石刻上記載了馬頭部性狀在個(gè)世代的遺傳。伯樂相馬按圖索驥2、細(xì)胞

2、遺傳標(biāo)記n細(xì)胞遺傳標(biāo)記(cytological genetic marker)主要是指染色體核型（染色體數(shù)目、大小、隨體、著絲粒位置、核仁組織區(qū)等）、帶型（Q、G、C、R帶型）和數(shù)量特征的變異等，它們分別反映了染色體在結(jié)構(gòu)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性。家豬X、Y染色體G帶示意圖細(xì)胞遺傳標(biāo)記的特點(diǎn)n不易環(huán)境影響，呈孟德爾方式遺傳。n多態(tài)性集中表現(xiàn)在染色體高度重復(fù)DNA結(jié)構(gòu)的異染色質(zhì)所在的部位。n細(xì)胞遺傳標(biāo)記經(jīng)常伴有對(duì)生物有害的表型效應(yīng)，難以獲得相應(yīng)的標(biāo)記材料，或者觀測(cè)和鑒定比較困難，從而限制了細(xì)胞遺傳標(biāo)記的應(yīng)用。3、生化與免疫遺傳標(biāo)記n免疫遺傳學(xué)標(biāo)記(immunogenetical marker)n以

3、動(dòng)物的免疫學(xué)特性為標(biāo)記，包括紅細(xì)胞抗原多態(tài)性和白細(xì)胞抗原多態(tài)性。n生化遺傳標(biāo)記(biochemical genetic marker)n主要是指在同一動(dòng)物個(gè)體中具有相同功能的蛋白質(zhì)存在兩種以上的變異體。同工酶與等位酶同工酶與等位酶n同工酶同工酶(isozyme)：電泳可區(qū)分的同一種電泳可區(qū)分的同一種酶（系統(tǒng)）的不同變化酶（系統(tǒng)）的不同變化n等位酶等位酶(allozyme)：由一個(gè)位點(diǎn)的不同由一個(gè)位點(diǎn)的不同等位基因編碼的同種酶的不同類型，其等位基因編碼的同種酶的不同類型，其功能相同但氨基酸序列不同功能相同但氨基酸序列不同等位酶分析的過程材料的采集材料的采集研磨和酶的提取研磨和酶的提取酶的保存酶的

4、保存淀粉凝膠制備淀粉凝膠制備電泳電泳凝膠切片凝膠切片酶的組織化學(xué)染色酶的組織化學(xué)染色酶譜的記錄與分析酶譜的記錄與分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析生化與免疫遺傳標(biāo)記的特點(diǎn)n與形態(tài)學(xué)標(biāo)識(shí)和細(xì)胞遺傳標(biāo)記相比，數(shù)量更豐富，受環(huán)境影響更小，檢測(cè)手段簡(jiǎn)便，是一種較好的遺傳標(biāo)記。n血液型和蛋白質(zhì)型都是基因表達(dá)的產(chǎn)物，局限于反映基因組編碼區(qū)的遺傳信息，且標(biāo)記的數(shù)量還比較有限，不能很好地覆蓋整個(gè)基因組。4、分子遺傳標(biāo)記n分子遺傳標(biāo)記(molecular genetic marker)n是一種新的以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記.n隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，相繼建立了RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等多種分子遺傳標(biāo)記

5、檢測(cè)技術(shù)，開創(chuàng)了遺傳標(biāo)記研究的新階段。分子遺傳標(biāo)記的特點(diǎn)n無表型效應(yīng)n不受環(huán)境的限制和影響n普遍存在于所有生物n數(shù)量豐富等特殊優(yōu)勢(shì)5、理想的分子遺傳標(biāo)記應(yīng)具備的特點(diǎn)n遺傳多態(tài)性高;n檢測(cè)手段簡(jiǎn)單快捷，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化;n遺傳共顯性，即在分離群中能夠分離出等位基因的3種基因型。n標(biāo)記遍布整個(gè)基因組； n準(zhǔn)確性，能正確反映動(dòng)物的真實(shí)遺傳，即標(biāo)記是經(jīng)濟(jì)性狀基因，還是與影響重要性的性狀連鎖。 n實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好（便于數(shù)據(jù)交換）； n開發(fā)成本和使用成本盡量低廉； 二、分子遺傳標(biāo)記n1、RFLP：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 n2、TRS：串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記n3、SNP：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性1、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 nRFLP

6、nrestriction fragment length polymorphismn最早應(yīng)用于動(dòng)植物遺傳學(xué)研究的分子標(biāo)記技術(shù)RFLP的原理n利用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，形成大小不等、數(shù)量不同的分子片段，n經(jīng)電泳分離，n通過Southern印跡將DNA片段轉(zhuǎn)移至支持膜 (尼龍膜或硝酸纖維素膜)上，n然后用放射性同位素(32P)或非同位素 (如地高辛，熒光素)標(biāo)記的探針與支持膜上的DNA片段進(jìn)行雜交。n不同基因組DNA酶切位點(diǎn)的改變，會(huì)使得RFLP譜帶表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性.RFLP示意圖限制性片段的制備限制性片段的制備電泳電泳Southern 印印 跡跡與放射性探針雜交與放射性探針雜交放射

7、性自顯影放射性自顯影RFLP的特點(diǎn)n呈共顯性遺傳、無表型效應(yīng)、不受年齡性別的影響等優(yōu)點(diǎn)。n分析一次只能檢測(cè)1個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)信息含量較低，而且操作復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力，成本高，并且對(duì)模板DNA需求量大。PCRRFLPn將PCR技術(shù)用于RFLP分析，即PCR-RFLP。n該技術(shù)先用1對(duì)引物特異性擴(kuò)增基因組的某一高變區(qū)，然后用限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，電泳檢測(cè)多態(tài)性。nPCR-RFLP分析省去了探針的制備、分子雜交等繁瑣的過程，DNA需求量也少，大大簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的RFLP技術(shù)。PCRRFLP的應(yīng)用 CCT GAG GAG CCT G G GAG CCT GAG GAG CCT GAG GAG CCT G G

8、 GAG CCT G G GAG Mst酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)Mst酶切位點(diǎn)消失酶切位點(diǎn)消失PCR-RFLPPro Val GluPro Glu Glu1 2 3正常雜合異常正常雜合異常 2、串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記ntandem repeated sequence,TRSn真核生物基因組中的可變串聯(lián)重復(fù)序列 （variable number tandem repeated sequence, VNTR）有兩類:小衛(wèi)星和微衛(wèi)星，兩者具有高度的變異性。(1) 小衛(wèi)星 (minisatellite DNA)n小衛(wèi)星重復(fù)單位的核心序列為15一76bpn近緣物種和個(gè)體間的小衛(wèi)星核心序列有著一定的同源性，在一定的條件

9、下可以相互雜交。DNA指紋圖譜原理n選擇在VNTR特異序列上沒有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶將動(dòng)物總基因組DNA切成不同長(zhǎng)度的片段n以VNTR中特異序列作為探針，進(jìn)行Southern雜交，n由于不同個(gè)體的串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)目和位置不同，形成的雜交譜帶具有個(gè)體的特異性，人們稱為DNA指紋圖譜 (DNA fingerprinting, DFP)VNTR示意圖1 2 3ABC123VNTR變異的原理示意圖DFP的特點(diǎn)n多態(tài)性檢測(cè)率高，n位點(diǎn)呈共顯性遺傳n個(gè)體具有高度特異性n技術(shù)復(fù)雜、成本高，有時(shí)譜帶過于復(fù)雜微衛(wèi)星（microsatellite DNA, MS)n又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequenc

10、e repeat,SSR)n是高度重復(fù)序列，廣泛存在于真核生物基因組，重復(fù)單位的核心序列為26bp。微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記的原理n以微衛(wèi)星DNA標(biāo)記兩側(cè)特異性序列設(shè)計(jì)專一引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，不同個(gè)體間因核心序列的重復(fù)次數(shù)不同而產(chǎn)生DNA多態(tài)性。微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記示意圖ABPCR擴(kuò)增擴(kuò)增凝膠電泳凝膠電泳1 2 3 AA AB BB微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記示意圖的特點(diǎn)n分布廣泛均勻n多態(tài)信息含量豐富n呈共顯性遺傳n穩(wěn)定性好，可比性強(qiáng)n分析技術(shù)易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化n開發(fā)成本高微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用領(lǐng)域n遺傳圖譜的構(gòu)建n連鎖分析特殊的基因（如致病基因）n姻親分析樣品鑒定（如父本分析

11、、血緣分析、等號(hào)樣品分析、雜種分析）n物種和居群的遺傳多樣性n群體遺傳學(xué)分析（如有效群體大小、群體遺傳結(jié)構(gòu)、群體分化、遷移與基因流動(dòng)）n保護(hù)生物學(xué)nHuntingtons disease Huntingtin gene of unknown (!) function Repeats #: 6-35: normal; 36-120: diseaseFriedrich ataxia disease GAA repeat in non-coding (intron) region Repeats #: 7-34: normal; 35 up: disease Repeat expansion red

12、uces expression of frataxin geneMicrosatellites and disease3、單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)nsingle nucleotide polymorphismn是指染色體上的某個(gè)存在單個(gè)堿基的變化，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入及缺失等。nSNPs in human populationSNP標(biāo)記的特點(diǎn)n高密度SNP是基因組中最普遍、頻率最高的遺傳標(biāo)記。單個(gè)SNP雖然只有兩個(gè)等位基因，多態(tài)信息含量不如微衛(wèi)星位點(diǎn)，但其高密度彌補(bǔ)了其不足。n代表性某些位于基因表達(dá)序列內(nèi)的SNP(coding SNP,cSNP)，有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平

13、，鑒別cSNP對(duì)于復(fù)雜表型性狀與基因變異之間的關(guān)聯(lián)分析具有重要意義。n易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析雙等位標(biāo)記，檢測(cè)時(shí)只需“有或無”表示。DNA芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)了SNP分析的高通量、微型化和自動(dòng)化。第二節(jié)基因組學(xué)n一、產(chǎn)生背景及概念n二、基因組學(xué)分類n三、結(jié)構(gòu)基因組學(xué)n四、功能基因組學(xué)n五、比較基因組學(xué)一、產(chǎn)生背景及概念n 1. 背景：1985年提出人類基因組計(jì)劃（HGP），隨著HGP的提出和實(shí)施，產(chǎn)生的基因組學(xué)。 2. 概念n以分子生物學(xué)技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)和信息網(wǎng)絡(luò)技術(shù)為研究手段，n以生物體內(nèi)全部基因?yàn)檠芯繉?duì)象，n在全基因背景下和整體水平上探索生命活動(dòng)的內(nèi)在規(guī)律及其內(nèi)外環(huán)境影響機(jī)制的科學(xué)。Genome size

14、s 3、基因組學(xué)的發(fā)展歷程n流感嗜血桿菌( haemophilus influenzae)1995 年7 月第一個(gè)細(xì)菌基因組全序列發(fā)表,大小為1.8 Mb。含1703 個(gè)基因或開放讀碼框。這是微生物乃至整個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)里程碑.(Science)n1997 年9 月,大腸桿菌的完整基因圖譜已繪制成功, 基因組全序列完成, 全長(zhǎng)為5Mb ,共有4 288 個(gè)基因,同時(shí)也搞清了所有基因產(chǎn)物的氨基酸序列.n啤酒酵母，1997年，第一個(gè)真核生物基因組圖譜公布。n秀麗線蟲( caenorhabditis elegans) n1998 年12 月完成了基因組測(cè)序?；蚪M大小100 Mb ,分布于6 條染

15、色體,預(yù)測(cè)有19，099 個(gè)基因。n果蠅nCelera公司2000 年3 月宣布了基因組全序列為180 Mb。有13 601 個(gè)基因,其中一半的基因功能還沒有搞清楚,有1 600 個(gè)堿基跨度區(qū)仍未能完全測(cè)序。n2000 年12 月,第一個(gè)植物基因組擬南芥基因組被全部測(cè)序,遺傳圖譜、物理圖譜建立,序列大小為125 Mb?；蚪M測(cè)序區(qū)段覆蓋了全基因組的115.4 Mb ,分析共含有25 498 個(gè)基因, 編碼蛋白來自11 000 個(gè)家族。n2001年2月中旬，Nature與Science分別發(fā)表了人類基因組工作框架圖,報(bào)告人類基因組共有30 億個(gè)堿基對(duì), 預(yù)測(cè)編碼基因31 000個(gè),比最初預(yù)測(cè)的1

16、0 萬個(gè)編碼基因數(shù)大大減少。n2002年4月，水稻基因組圖譜公布。n2002年小鼠、瘧原蟲和按蚊基因組測(cè)序完成鼠基因組共有約27億個(gè)堿基對(duì)，比人類少15，但其包含的基因數(shù)目約在3萬個(gè)左右，與對(duì)人類基因數(shù)的最新估計(jì)非常接近。n2003年人類基因組計(jì)劃宣布，人類基因組序列圖繪制成功，人類基因組計(jì)劃的所有目標(biāo)全部實(shí)現(xiàn)n人類遺傳變異圖譜研究以及黑猩猩基因組測(cè)序計(jì)劃開始n2003年11月，世界上首個(gè)復(fù)雜生物體的蛋白圖譜果蠅蛋白圖譜公布，從而實(shí)現(xiàn)了只顯示遺傳密碼的基因圖譜到揭示遺傳密碼功能的蛋白圖譜的飛躍。n這個(gè)果蠅（Drosophila melanogaster）蛋白圖譜發(fā)表在科學(xué)雜志的網(wǎng)絡(luò)版上n這篇研

17、究發(fā)布的這個(gè)含有7,000多個(gè)果蠅蛋白的圖譜含蓋了這些蛋白之間超過20,000種不同的互作。n這些果蠅蛋白有許多與人類蛋白類似，適于作為研制小分子藥物如用于治療癌癥、心臟病和糖尿病的口服藥片等的靶點(diǎn)n2004年月日n多國科學(xué)家組成的兩個(gè)研究小組宣布繪制出雞的基因序列草圖和遺傳差異圖譜。n 科學(xué)家選取了家雞的遠(yuǎn)祖紅原雞為測(cè)繪對(duì)象，繪制出了草圖中約10億個(gè)堿基對(duì)，相當(dāng)于人類的三分之一。n科學(xué)家在日出版的Nature雜志上載文說，分析發(fā)現(xiàn)，紅原雞約有萬到2.3萬個(gè)遺傳基因，與人類數(shù)量基本持平，其中有60與人類相同。n雞基因組的分析還僅僅是開始，不過已經(jīng)得出了一些出人意料的結(jié)果。n科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，控制雞

18、生成角蛋白的基因與預(yù)想的不同。n角蛋白構(gòu)成人類的頭發(fā)、指甲，以及鳥類的喙和羽毛，科學(xué)家一直認(rèn)為哺乳動(dòng)物和鳥類的角蛋白來源相同。但圖譜顯示，雞的角蛋白基因與哺乳動(dòng)物的區(qū)別很大。n科學(xué)家由此推測(cè)，角蛋白可能獨(dú)立進(jìn)化出了兩次。意外的發(fā)現(xiàn)n另外，此前科學(xué)界一致認(rèn)為雞沒有嗅覺，但是分析結(jié)果表明雞具有大量的嗅覺基因，味覺基因卻很缺乏。n分析還發(fā)現(xiàn)，雞缺乏人類所具有的產(chǎn)生乳汁、唾液和牙齒的基因。意外的發(fā)現(xiàn)雞基因組研究的意義n雞是研究低等脊椎動(dòng)物和人類等哺乳動(dòng)物的一種比較理想的中介。n將人類基因組與雞等其他生物的基因組進(jìn)行比較，有助于更深入理解人類基因的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而開發(fā)治療疾病的新手段，對(duì)于培育優(yōu)質(zhì)雞種、

19、改善食品安全、控制禽流感病毒的蔓延也有重要意義。n雞是種常見的家禽，長(zhǎng)期受到進(jìn)化生物學(xué)家的青睞。它的基因序列也有助于科學(xué)家了解農(nóng)業(yè)和進(jìn)化學(xué)上重要特性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。雞的進(jìn)化研究轉(zhuǎn)基因小雞n對(duì)雞和人類的基因組進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)約七千萬個(gè)堿基對(duì)是共有的。n這暗示著在大約三億一千萬年前二個(gè)物種從共同祖先分化出來的時(shí)候，遺傳物質(zhì)具有守恒性。雞和所有的哺乳動(dòng)物多起源于恐龍鳥類的祖先始祖鳥“分道揚(yáng)鑣”在鳥類和哺乳動(dòng)物分離的時(shí)候，雞獲得了生成羽毛和喙的蛋白質(zhì)的基因，而哺乳動(dòng)物獲得了毛皮蛋白質(zhì)的基因，喪失了與蛋清和蛋黃有關(guān)的基因。雞的基因組比哺乳動(dòng)物的緊湊的多，它擁有2.0萬到2.3萬個(gè)基因，但僅有十億個(gè)DNA堿基

20、，而同樣多的基因人類需要三十億個(gè)堿基。雞的基因數(shù)量與哺乳動(dòng)物的相當(dāng)，但它的基因組含有重復(fù)的“垃圾”DNA的數(shù)量很少。我國科學(xué)家在雞基因組學(xué)研究上的重大突破中國科學(xué)院北京基因組研究所在國際合作的框架下參與和主持完成的原雞基因組和家雞基因組多態(tài)性研究并于2004年12月9日發(fā)表在自然雜志上以主題科學(xué)論文的形式發(fā)表。Science發(fā)表論文 我國家蠶基因組研究獲國際認(rèn)可2004年12月10日西南農(nóng)業(yè)大學(xué)家蠶基因組研究群體的研究論文家蠶基因組框架圖，于12月10日在國際頂尖科研雜志Science上發(fā)表，這標(biāo)志著重慶市家蠶基因組研究成果已得到國際學(xué)術(shù)界的認(rèn)可。絲腺是合成繭絲蛋白質(zhì)的生物器官，是蠶絲產(chǎn)業(yè)的生

21、物學(xué)基礎(chǔ)。科學(xué)家通過分析家蠶基因組和基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了1874個(gè)家蠶絲腺特異基因，其中97為新發(fā)現(xiàn)；發(fā)現(xiàn)了絲腺中激素活動(dòng)的證據(jù)；科學(xué)家甚至比較了家蠶與被稱為“生物鋼”的蜘蛛絲的生產(chǎn)者蜘蛛的基因構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)了它們共同擁有的個(gè)基因。這些功能基因的獲得和功能分析的深入開展，將徹底突破繭絲蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因克隆和研究的瓶頸。而隨著家蠶絲腺特異基因研究的深入，中國將很快在改造絲蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，克服絲綢天然加工弱點(diǎn)等重要產(chǎn)業(yè)技術(shù)的研發(fā)方面取得突破。二、基因組學(xué)分類n1、根據(jù)研究對(duì)象分：動(dòng)物基因組學(xué)、植物基因組學(xué)、腫瘤基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)、環(huán)境基因組學(xué)等。n2、 根據(jù)研究的重點(diǎn)分：結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、比

22、較基因組學(xué)三、結(jié)構(gòu)基因組學(xué)n（一） 概念和目的n（二） 基因圖譜n（三） 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究常用方法（一）概念和目的（一）概念和目的n以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的基因結(jié)構(gòu)研究，弄清基因組中全部基因的位置和結(jié)構(gòu)，為基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。n其目的是建立高分辨的遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜和序列圖譜。（二）（二） 基因圖譜基因圖譜n1. 遺傳圖譜（連鎖圖譜）n2. 物理圖譜n3. 轉(zhuǎn)錄圖譜（表達(dá)圖譜）n4. 序列圖譜（分子水平的物理圖譜）1. 遺傳圖譜（連鎖圖譜）遺傳圖譜（連鎖圖譜）n概念：指基因或分子標(biāo)記在染色體上的相對(duì)位置與遺傳距離，用厘摩（cM）表示。n1cM的遺傳距離表示在100個(gè)配子中有1個(gè)重組子。在哺乳動(dòng)物中，遺傳圖譜上1cM的距離大約相當(dāng)于物理圖譜上1 000 000bp。n通過該圖譜可分清各基因或分子標(biāo)記之間的相對(duì)距離與方向，如靠近著絲?；蚨肆?。n該圖譜的構(gòu)建是以位于同一染色體相鄰的2個(gè)基因或遺傳標(biāo)記的重組率為基礎(chǔ)，因而需要有參考家系和分子遺傳標(biāo)記或基因作為研究基礎(chǔ)。2. 物理圖譜物理圖譜n指DNA序列上兩點(diǎn)間的實(shí)際距離。n用于確定各遺傳標(biāo)記間的物理距離有兩種物理圖譜：n（1）以已定位的DNA序列標(biāo)記位點(diǎn)（STS）為位標(biāo)，以DNA實(shí)際長(zhǎng)度為圖譜距離的基因組圖譜。n（2）由YAC和/或細(xì)菌人工染色體（BAC）連續(xù)克隆重疊群組成的物理圖譜。