研究生分子生物學(xué)知識點(diǎn)

1、百度文庫止每個人平等地提升自我分子生物學(xué)知識點(diǎn)總結(jié)1 . 蛋白質(zhì)組（proteome） ： proteins expressed by a genome,即基因組表達(dá)的 全套蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)（Protemics）則是以蛋白質(zhì)組為研究對象，從整體 角度，分析細(xì)胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)構(gòu)成的動態(tài)變化和活動規(guī)律的科學(xué)。（相互作 用網(wǎng)絡(luò)PPI）2 .表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本流程：蛋白樣品的制備及定量-總蛋白的雙向凝 膠電泳（染色）-凝膠分析軟件分析-膠內(nèi)酶解（胰肽酶）-質(zhì)譜分析（肽質(zhì)量 指紋圖譜）-數(shù)據(jù)庫搜索鑒定蛋白性質(zhì)3 .雙向凝膠電泳：相互垂直的兩個方向上，分別基于蛋白質(zhì)不同的等電點(diǎn)和分 子量，先經(jīng)等電

2、聚焦電泳（isoelectric focusing, IEF）,再經(jīng)變性聚丙烯 酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）把復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分分離。4 .比較蛋白質(zhì)組學(xué)：通過比較同一個體腫瘤細(xì)胞（組織）與正常細(xì)胞（組織） 之間蛋白質(zhì)在表達(dá)數(shù)量、表達(dá)位置和修飾狀態(tài)上的差異，發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)病或 者發(fā)展有關(guān)的分子標(biāo)記，用來作為腫瘤診斷的腫瘤相關(guān)蛋白。5 .軟電離：所謂“軟電離”是指樣品分子電離時保留整個分子的完整性，不會 形成碎片離子。6 .腫瘤血清蛋白質(zhì)分析方法（tumor serologic proteome analysis, SERPA）： 是從腫瘤免疫學(xué)觀點(diǎn)出發(fā)建立的一種蛋白質(zhì)組學(xué)和腫瘤免疫學(xué)相結(jié)合的方

3、 法。SERPA其實(shí)驗(yàn)過程如下：雙向電泳分離腫瘤組織（細(xì)胞）總蛋白質(zhì)；轉(zhuǎn)膜；建立western blotting蛋白質(zhì)印跡反應(yīng)圖譜（與患者或正常人血清反應(yīng)）; 軟件分析確定差異反應(yīng)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)；質(zhì)譜鑒定和生物信息對腫瘤組織平行膠（replica gel）中相應(yīng)的差異蛋白 質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定，篩選出腫瘤分子標(biāo)志物；用ELISA、免疫組化等方法對該分子標(biāo)志物進(jìn)行原位驗(yàn)證，或者進(jìn)一步分 析該蛋白功能，研究其在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮的作用。7 .蛋白質(zhì)芯片：是將大量蛋白質(zhì)分子按預(yù)先設(shè)置的排列固定于一種載體表面, 形成微陣列，根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，構(gòu)建微流體生物化學(xué)分 析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對生物分子的準(zhǔn)確、快速

4、、大信息量的檢測。8 .功能蛋白質(zhì)組學(xué):是指對蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與DNA/RNA間的相互作用的研究。 以細(xì)胞內(nèi)與某個功能有關(guān)或某種條件下的一群蛋白質(zhì)為主要研究內(nèi)容，由此 建立細(xì)胞內(nèi)外信號傳遞的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。研究方法主要有：蛋白質(zhì)芯片技術(shù)目前常用蛋白質(zhì)芯片有：1 . SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片2 .抗體芯片3 .靶蛋白質(zhì)芯片4 ,液相蛋白質(zhì)芯片 噬菌體展示技術(shù) 酵母雙雜交系統(tǒng) 免疫共沉淀9 .免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗體和抗原之間的專一性作用 為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì) 胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。10 . SD

5、S-聚丙烯酰胺凝膠電泳基本原理：根據(jù)蛋白質(zhì)分子量不同分離復(fù)雜蛋白質(zhì) 成分。L制備凝膠試劑：丙烯酰胺（單體）；亞甲雙丙烯酰胺（膠聯(lián)劑）二者 比例29 ： 1；母液濃度30%；過硫酸鍍（引發(fā)劑引發(fā)交聯(lián)）；N,N,N, ' N'- 四甲基乙二胺（TEMED）（加速劑）十二烷基磺酸鈉（SDS）（陰離子變性劑） 2.蛋白上樣緩沖液3.電泳緩沖液4.考馬斯克藍(lán)R250染色液5.脫色液11 . Western blotting基本原理:將SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維 膜（nitrocellulose membrane） ±,在膜上進(jìn)行同相免疫化學(xué)染色，原位顯示 蛋白質(zhì)

6、帶,從而在已知分子量的基礎(chǔ)上對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析。12 . Southwestern blotting基本原理:細(xì)胞核蛋白提取物經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移 至NCM上,然后用標(biāo)記的DNA探針檢測轉(zhuǎn)移至膜上的蛋白質(zhì)。細(xì)胞死亡形式表現(xiàn)Cell death細(xì)胞生命現(xiàn)彖不可逆的停止細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的不可逆喪失。細(xì)胞死亡并非與機(jī)體死亡同步。正常組 織中也發(fā)生細(xì)胞死亡,它是維持組織機(jī)能和形態(tài)所必需的。細(xì)胞壞死細(xì)胞受到外來的急性的強(qiáng)力的致病因素作用下.細(xì)胞正常代謝活動被強(qiáng)行中斷而引起的“意外” 的、被動性死亡過程；只見病理情況下。細(xì)胞腫脹,線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫張。核染色質(zhì)班機(jī)降解呈 紫狀，蛋白介成誠少。細(xì)胞

7、膜、溶的體破裂，細(xì)胞內(nèi)容物流出，引起周用炎癥Apoptosis指在一定的生理和病理?xiàng)l件下,多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定.由基因控制并遵 循一定程序的細(xì)胞主動性死亡過程.乂程序性細(xì)胞死亡（progr皿ed cell death, PCD）.凋亡小體： 胞膜皺縮內(nèi)陷、反折,包用凝集斷裂的染色質(zhì)、胞質(zhì)、細(xì)胞器等形成芽狀、泡狀突起并分離脫落. 形成一線行膜包被,內(nèi)涵物不外溢的小塊.稱凋亡小體tapoptotic body）。PCD:多細(xì)胞生物體在生長發(fā)育過程中，細(xì)胞在基因調(diào)控下,按照一定時空順序發(fā)生的受到嚴(yán)格程序控制的 生理性死亡?！碧厥獾亩〞r自殺”PCDApoptosis功能性概念發(fā)育

8、學(xué)概念形態(tài)學(xué)概念僅存在于發(fā)育細(xì)胞可存在于發(fā)育和成體細(xì)胞大部分凋亡是PCD. PCD的最終結(jié)果是凋亡某些凋亡是非程殍性。如細(xì)胞毒物誘導(dǎo)的凋亡13 .凋亡的生物學(xué)意義1、確保正常生長發(fā)育、2、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、3、防御功能14 .細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征:細(xì)胞皺縮:2.細(xì)胞質(zhì)濃縮:3.染色質(zhì)邊集核膜下.呈塊狀、新月形,4.凋亡小體形成；5.調(diào) 亡小體內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器.細(xì)胞if身亡的4化特什：染色質(zhì)DXA片段化內(nèi)源性核酸內(nèi)切的活化.將核小體間的連接DXA降弱.形成長度為ISOYOObp整倍數(shù)的寡聚核甘酸片段。在瓊脂糖凝膠電泳中呈特征性的“梯狀”條帶DXA ladder：細(xì)胞凋亡時 DYA在核小體間斷裂

9、（DXA Erawntation ）形成一些DNA片斷，經(jīng)過提取和純化后在凝股電泳上產(chǎn)生n條 梯狀條帶，故稱之為DNA Ladder,是判斷DMA損傷的重要標(biāo)準(zhǔn)）啟動H亡與斯|視亡中期,亡M15. Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一組對底物的天冬氨酸部位 有特異水解作用的，活性中心富含半胱氨酸的蛋白水解酶。Caspase功能：1.細(xì)胞骨架蛋白和核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞解體成凋亡小體2 激活 DNA 酶(Caspase-activated DNase, CAD)。CAD:Caspase 激活的 DNA 酶正常情況下CAD與其抑制劑ICAD結(jié)合，在胞質(zhì)內(nèi)，無活性。凋亡時Caspase

10、 水解ICAD,游離的CAD有活性，進(jìn)入胞核，切割DA。3滅活凋亡抑制物：如Bcl-2、ICAD4水解與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)如聚 ADP 核糖多聚酶(poly-ADP-ribose polymerase, PARP)16 .死亡受體途徑-外源性途徑：死亡受體TNFRl、Fas、CARl、GFR、DR3、DR4、 DR5等是一類通過與相應(yīng)配體結(jié)合，傳遞細(xì)胞凋亡信號的細(xì)胞膜蛋白。通路(pathway)死亡配體(細(xì)胞外)-死亡受體(細(xì)胞膜)一相關(guān)蛋白(中介蛋 白，細(xì)胞質(zhì)內(nèi))一激活Caspase8激活Caspase3 細(xì)胞凋亡17 .線粒體損傷途徑-內(nèi)源性途徑：線粒體是細(xì)胞生命活動的控制中心

11、，它不僅 是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心。釋放細(xì)胞色素C (Cyt.c )釋放凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor, AIF)和限制性核酸內(nèi)切酶細(xì)胞周期:1. G1 期(first從到前的一段時期，乂G (Endo G)釋放 Smac/Diablo (the second mitochondria-derived activator of caspase, Smac) (direct IAP bingding protein, Diablo) ® 釋放活性氧 ROS稱合成前期，此期主要合成RNA和。該期特點(diǎn)是活躍，迅速合成RNA和

12、蛋白質(zhì)，細(xì)胞體 !/ 曲二 積顯著增大。這一期的主要意義在于為下階 (：；V、黑黑北段S期的DNA復(fù)制作好物質(zhì)和能量的準(zhǔn)備。Z；h 力2. S期(synthesis) 即DNA合成期，在此 必期，除了合成DNA外，同時還要合成。DA復(fù)制所需要的酶都在這-時期合成。、3. G2期(second gap)期為DNA合成后期，是有絲分裂的準(zhǔn)備期。在這一時 期，DA合成終止，大量合成RNA及蛋白質(zhì)，包括和等。4. M期:細(xì)胞分裂期。19. 細(xì)胞周期蛋白或周期素(Cyclins)： 一類結(jié)構(gòu)類似、能結(jié)合并調(diào)節(jié)CDK活性 的蛋白家族，哺乳動物至少有10種，14個成員(cyclin A、Bl-2、C、Dl-

13、 3、E、F、Gl-2、H、I、K)o cyclins-CDKs-CKIs 系統(tǒng)20. HIF-la：幾乎參與了對糖酵解每一步的調(diào)控；PI3K/Akt途徑；Myc； P53等HIF-1a轉(zhuǎn)錄活化PDKO抑制線粒體右氧呼吸常我情況下：通過腫搦抑制蛋白VHL介導(dǎo)的泛素 蛋白的途徑降解乏氧情況下：降解受損 n HIF-1a大量累積0蒞為下邛結(jié)合一形成HIF-1轉(zhuǎn)錄史合物=與共激活較螞子CBP/P300結(jié)合至HRE 一激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄21. Cyclin：周期素/周期蛋白，是CDK (周期素依賴的蛋白激酶)的調(diào)節(jié)亞基,分別在細(xì)胞周期的不同時期積累，激活CDK,使其具有催化關(guān)鍵底物的磷酸 化修飾并調(diào)節(jié)

14、其活性。參與細(xì)胞周期中不同時相的調(diào)節(jié)。22. Gi/S檢驗(yàn)點(diǎn):在酵母中稱start點(diǎn)，在哺乳動物中稱R點(diǎn)（restriction point）, 控制細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)的G進(jìn)入DNA合成期，相關(guān)的事件包括:DA是否損傷？ 細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？23. cyclin box：各類周期蛋白均含有一段約100個氨基酸的保守序列,稱為周 期蛋白盒（cyclin box）,是與CDK相互作用的活性區(qū)域。24. RNA F擾（RNA interference , RXAi ）是將雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)引起特異基 因的mRNA降解的一種細(xì)胞反應(yīng)過程。屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默的一種。25. 試述CDK1

15、活性的調(diào)控機(jī)制？CDK的催化活性受到激活因素與抑制因素兩方面的調(diào)節(jié)。激活因素中，目前 認(rèn)為CDK與周期素的結(jié)合以及保守的蘇氨酸殘基的磷酸化是較為重要的兩種 調(diào)節(jié)因素。抑制因素中，CDK的N-端氨基酸殘基的抑制性磷酸化以及抑制蛋 白的結(jié)合是主要的調(diào)節(jié)因素。磷酸化修飾的激活作用：CDK的激活還必須依 賴于其保守的蘇氨酸殘基的磷酸化，如在人CDK1 （p34cdc2）的Thrl61和 CDK2的Thrl60的磷酸化，就與這兩個酶的激活相關(guān)。催化CDK1和CDK2磷 酸化的酶是 CAK（CDK activiting kinase）,是另一種蛋白激酶 CDK7-Cyclin H復(fù)合物。當(dāng)磷酸酶-1將此位

16、點(diǎn)的磷酸水解，P34cde2 乂失去激酶活性。磷 酸化修飾的抑制作用在人的CDK1和CDK2中，Thrl4和Tyrl5殘基的磷酸化 可抑制CDK的催化活性。催化Thrl4和Tyrl5磷酸化的是兩種不同的蛋白激酶，使Thrl4磷酸化的為蛋白激酶Mytl ,使Tyrl5磷酸化的是蛋白激酶 Weel/Miklo催化Thrl4和Tyrl5脫磷酸化的是蛋白磷酸酶CDC25。26. DA損傷乂稱基因突變：是DNA復(fù)制過程中發(fā)生的DNA核甘酸序列的改變， 從分子水平看是DNA分子堿基順序或數(shù)目的改變。突變的形式包括：替換、 插入、缺失、重排。27. 突變形式：（一）點(diǎn)突變：指DNA分子上一個堿基對的變異，堿

17、基替換包括： 轉(zhuǎn)換（同型）、顛換（異型）典型疾?。虹牭缎图?xì)胞貧血，堿基顛換AT-TA；（二）插入和缺失-框移突變（frame-shift mutation）:缺失和插入引起的 三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸種類、排列順序發(fā)生改變。 （地中海貧血）（三）重排：指DNA分子內(nèi)發(fā)生較大片段的交換，也稱重組。移位的DNA片 段可在新位點(diǎn)顛倒方向反置（倒位），也可在染色體之間發(fā)生交換重組。突變的意義：產(chǎn)生新基因，出現(xiàn)新性狀，為生物進(jìn)化提供了最原始、最根本 的的材料，是進(jìn)化的分子基礎(chǔ)28. DA損傷的修復(fù)：指針對已發(fā)生的缺陷而進(jìn)行的補(bǔ)救機(jī)制。直接修復(fù)：修復(fù)酶識別出損傷部位直接修復(fù)，不用切除DN

18、A或切除堿基。包括L 光修復(fù)、2.鏈斷裂的直接重接、3.堿基的直接插入、4.轉(zhuǎn)甲基作用切除修復(fù)（excission repair）：在DNA內(nèi)切酶、外切酶、DNA聚合酶、DNA連接 酶等多種酶的共同作用下，先將DNA受損的單鏈部位切除，然后以另一條鏈為模 板，合成一段正確配對的堿基序列來修補(bǔ)缺口。DNA損傷最普遍的修復(fù)形式。 切除修復(fù)的特點(diǎn)：（1）切除修復(fù)利用的是化學(xué)能ATP,也叫暗修復(fù)。（2）修復(fù) 發(fā)生在復(fù)制前。（3）修復(fù)的對象是親代DA。0sM公尖x不修的ante.ME飲心 1 1til 1 kiiiiNT二 Hf * tRJ iiiiiiiiiiiiviii a i i 1 iiii7i

19、£4 一i r f t八 151 1 1 1 1 1切開ttTTTL5開lAaier'm，1-n ii I t ' i 廠1-A 1 1 t a j切僚.mA核外夕卜5電心伙iVAP位右極 f 2g 小與eONATTlillllltillllll口）除|核a?加劭b減基缺陷或錯配的修復(fù) 核 什二酸損傷的修復(fù)：22信配DZA根價IW-rTT!TT! 口!'！ I ! rnTTFr.重組修復(fù)：當(dāng)DA損傷較大、較嚴(yán)重，無法及時修復(fù)或缺乏切除修復(fù)酶系統(tǒng), 可跳躍損傷部位復(fù)制，子鏈形成缺口，復(fù)制結(jié)束后，在重組基因rec編碼的酶 （Rec蛋白）、DNA聚合酶、DA連接酶等

20、的作用下，將無損母鏈的DNA片段移 到子鏈缺口，進(jìn)行重組修復(fù)。發(fā)生在復(fù)制后，故乂稱“復(fù)制后修復(fù)”DNA損傷重組修復(fù)的過程及特點(diǎn)：過程：（1）復(fù)制：損傷母鏈復(fù)制時，越過損 傷部位，子鏈對應(yīng)位點(diǎn)留下空缺；無損母鏈復(fù)制成完整雙鏈。（2）重組：空缺誘導(dǎo)產(chǎn)生重組酶（Rec蛋白），RecA與空缺區(qū)結(jié)合，并催化子鏈 空缺與無損母鏈相應(yīng)片段重組交換（RecBCD蛋白）；有缺子鏈與無損母鏈重組, 空缺轉(zhuǎn)移到無損母鏈，有缺子鏈完整，損傷母鏈仍然保留。（3）再合成：轉(zhuǎn)移后的母鏈空缺以新的互補(bǔ)子鏈為模板，在DNA聚合酶和連接 酶的催化下，重新修復(fù)缺口；DNA鏈的損傷并未除去，隨著復(fù)制的繼續(xù)，損傷DN A鏈將在群體中逐

21、步“稀 釋” o修復(fù)發(fā)生在復(fù)制后，對象是子代DNA.SOS修復(fù)：DNA嚴(yán)重?fù)p傷難以復(fù)制或DNA復(fù)制系統(tǒng)受抑制的緊急情況下，為了保 證DA鏈的完整性，應(yīng)急產(chǎn)生校對功能低的修復(fù)酶，采用填補(bǔ)任意堿基的修復(fù)方 式。這是具有差錯的修復(fù)，是對極為不利的外界環(huán)境的應(yīng)急反應(yīng)，故稱SOS修復(fù)，也 稱差錯傾向修復(fù)。SOS反應(yīng)廣泛存在于原核生物和真核生物。細(xì)胞能存活，但變 異率高，DNA保留錯誤較多，會引起廣泛、長期的突變。自然界也因此而變得生 物種類繁多。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路29.受體：是細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)可以特異地識別與結(jié)合化學(xué)信號物質(zhì)（配體）并 能激發(fā)靶細(xì)胞產(chǎn)生特異生物效應(yīng)的特殊蛋白質(zhì)分子。G蛋白：廣義的G蛋白是指所有

22、能與GTP或GDP結(jié)合的蛋白質(zhì)。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中 扮演重要角色的G蛋白主要有兩類：異三聚體G蛋白（與膜受體偶聯(lián)，位于細(xì)胞膜 內(nèi)側(cè)，由三個亞基組成，一般稱為經(jīng)典G蛋白或大G蛋白°）、單體G蛋白（存在于不 同的細(xì)胞部位的小分子量G蛋白，也稱為“小G蛋白”，是單亞基蛋白。Ras是第一個 被發(fā)現(xiàn)的小G蛋白。）SH2結(jié)構(gòu)域：由約100個氨基酸殘基組成，中心為反向平行的B片層結(jié)構(gòu)，兩側(cè)為a螺旋。 SH2介導(dǎo)信號分子與含磷酸酪氨酸蛋白分廣的結(jié)合，并與磷酸化酪氨酸的磷酸基團(tuán)結(jié)合。這種結(jié) 合依賴于酪氨酸殘基的磷酸化及其周圍的氨基酸殘基所構(gòu)成的模體（motif1不同的蛋白質(zhì)分廣 含有結(jié)構(gòu)相似但并不相同的S

23、H2結(jié)構(gòu)域，因此對于含有磷酸化酪氨酸殘基的不同模體具有選擇性。SH3結(jié)構(gòu)域：由55-75個氨基酸殘基組成,形成一個扭曲B桶狀結(jié)構(gòu)。SH3結(jié)構(gòu)域介導(dǎo) 信號分子與富含肺氨酸的蛋白分子的結(jié)合，其親和力與脯氨酸殘基及鄰近氨基酸殘基所 構(gòu)成的模體序列相關(guān)。30. L簡述細(xì)胞膜受體的類型及其特征：特性離子通道受體G蛋白偶聯(lián)受體酶偶聯(lián)受體內(nèi)源性配體神經(jīng)遞質(zhì)神經(jīng)遞質(zhì).激空. 趨化因子.外源 激（氣味、光）生長因子細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)寡聚體形成的孔道單體具有或不具有催化 活性的單體跨膜區(qū)段數(shù)目多個7個1個功能離子通道激活G蛋白激活Tyr蛋白激旃 等細(xì)胞應(yīng)答去極化與超極化去極化與超極化 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能 和表達(dá)水平調(diào)節(jié)蛋白

24、的功能和 表達(dá)水平，調(diào)節(jié)細(xì) 胞分化和增殖2 .舉例說明cAMP-PKA信號傳遞途徑。cAMP對肌細(xì)胞中糖原分解合成的調(diào)節(jié)作用腎上廉素一 （CAMP） f A生成cAMP t , cAMP通過激活PKA （依賴cAMP的蛋白激酶）行使功能，PKA*3 .試述RTK-Ras-MAPK信號傳遞途徑。該途徑的信號分子：生長因子類EGF、PDGF、IGF. FGF、VGEF等RTK：受體酪氨酸激酶（與配體結(jié)合及受體二聚化/寡聚化使酶激活）Ras蛋白：Ras蛋白是細(xì)胞內(nèi)的一種小分子單體GTPase,像其它單體GTPase和G 蛋白三聚體一樣，非活化狀態(tài)時結(jié)合GDP,在外源信號的作用下釋放GDP,結(jié)合 GT

25、P,本身即被激活，Ras蛋白亦具有GTPase活性，將GTP水解成GDP, Ras蛋 白本身乂回到非活化狀態(tài)。但Ras蛋白水解GTP的速度比G,q至少慢100倍。MAPK：有絲分裂原活化蛋白激酶或微管相關(guān)蛋白激酶，屬Ser/Thr激酶，是接受 膜受體轉(zhuǎn)換與傳遞的信號并將其帶入細(xì)胞核內(nèi)的一類重要分子，在多種受體信號 傳遞途徑中具有關(guān)鍵性作用。生長產(chǎn)子除氨酸激酹受體（RTK）I接頭蛋白（含 SH2/SH3 ）（GRB2）ISos （GEF 活性）IGDPyGTPRas GDP,、Ras GTP（無活性）、（有活性） Raf（絲/蘇氨酸激旃） I MEK （MAPKK） I MA沙（絲/蘇氨酸激旃）

26、其它胞漿蛋白其它激的 核轉(zhuǎn)求因子9百度文庫止每個人平等地提升自我31. 抑癌基因(tumor suppressor gene)：又稱為抗癌基因(antioncogene) 是一類在正常情況下對細(xì)胞增殖有負(fù)調(diào)控作用，而在兩個等位基因都缺失 或失活時可促進(jìn)腫瘤形成的基因。常見的有的3、Rb、VHL、APC32. p53的功能:(1)抑制cyclin A的表達(dá)；(2)抑制DNA聚合酶與DNA復(fù)制 起始復(fù)合物的靖合；(3)激活抑制細(xì)胞分裂的基因;(4)抑制癌基因?qū)?xì) 胞的轉(zhuǎn)化。33. 基因診斷:采用分子生物學(xué)的技術(shù)方法來分析受檢者的某一特定基因的結(jié)構(gòu) (DA水平)或功能(RNA水平)是否異常，以此來對

27、相應(yīng)的疾病進(jìn)行診斷。是 病因的診斷。分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)34. PCRTFIR多聚解鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析,靶基因PCR擴(kuò)增、 擴(kuò)增的DNA片段限制性酶切圖譜(長度多態(tài)性)。主要用于核酸變異性分析 與比較。35. PCR-SSCP (診斷有無突變)：聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(single strand conformation polymorphism)的簡稱，原理是將經(jīng)擴(kuò)增的DA片段 經(jīng)過變性處理，形成單鏈，由于序列不同，單鏈構(gòu)象就有差異在中性聚丙烯 酰胺凝膠中電泳的遷移率不同，通過與標(biāo)準(zhǔn)物的對比，即可檢測出有無突變。 廣泛應(yīng)用于檢測各種病原體基因的點(diǎn)突變及缺失突變.基因的

28、多態(tài)性分析等。 并不能鑒別所有的突變。36. PCR-southern blot或Dot blot技術(shù)：是將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜 或尼 龍膜上，再與標(biāo)記的特異性探針進(jìn)行雜交，然后放射自顯影，來檢測有 無特定的擴(kuò)增片段及相對含量，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于癌基因、遺傳特異基因、病 原體特異基因等方面的研究及檢測。37. 核酸分/雜交：按照堿基互補(bǔ)配對原則，將不同來源的序列互補(bǔ)單鏈的 DNA/DNA, RNA/RNA,互補(bǔ)配對成雙鏈雜交分子，這一過程叫核酸分子雜交。38. 原位雜交：用核甘酸探針對特殊的核甘酸順序在其原位進(jìn)行(in situ hybridization)雜交，叫原位雜交?？捎糜贒NA

29、、RNA定位研究。39. DXA印跡技術(shù)(Southern blotting) ： Southern印跡雜交常用于探測DNA 的限制性內(nèi)切酶圖譜。通過檢測某個體特定基因及旁側(cè)區(qū)域限制性內(nèi)切酶 圖譜的變化，可判斷是否發(fā)生了明顯的DNA突變?；蚪MDNA限制防陂解及電泳分離限制酬酹解及電泳分離回收含已知基因的DNA片展轉(zhuǎn)移到硝孽纖維膜或尼龍臏標(biāo)記的探針放射自顯影圖用Southern印跡雜交方法進(jìn)行基因診斷的基木步驟PCR過程及原理乂叫體外基因擴(kuò)增技術(shù)。利用人工合成的一對引物，在被擴(kuò) 增DNA模板鏈的兩端形成雙鏈，山DNA聚合酶催化一對引物之間的聚合反應(yīng)。 組成體系：template DNA. at

30、 least a couple of primer （長度：20bp 左右； 堿基分布:均勻隨機(jī)，G+C含量:40-60%;引物自身不存在發(fā)卡結(jié)構(gòu)；兩個引物間 不能互補(bǔ)；引物與非特異靶區(qū)段同源性不能超過70%； 5 '端可修飾（酶切位 點(diǎn)）一方便基因隆）Taq酶；四種底物dNTPs； buffer （包括Mg2+）。過程： 變性：將雙鏈DNA加熱（95C。）使之變性，DNA雙鏈變成單鏈 退火：降低溫度至56使引物與模板DNA單鏈結(jié)合 延伸：將溫度升至72C,在DNA聚合酶作用下，在引物3'端進(jìn)行延伸， 使原模板DNA的一條鏈變成兩條鏈。Taq酶的特性： a）耐熱 b）缺士版正活

31、性（3' -5外切酶活性），相對容易錯誤摻入 c）合成速度:1200bp/min d）在新鏈3' -端額外加上一個A e）有5' -3'外切酶活性，可以real time PCR40. DA芯片技術(shù)：是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地 緊密排列固定于單位面積的支持物上。41. .基因轉(zhuǎn)移的方法：1 .逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（生物學(xué)）；2.脂質(zhì)體；3.直接注射；4. 受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)；5.磷酸鈣共沉淀法；6.電穿孔法；7.基因槍法；8. 顯微注射法。42. RNAi （RNA interference）：是指在生物體細(xì)胞內(nèi)，短雙鏈RNA （ds

32、RNA）引 起同源mRNA的特異性降解，因而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的過程。一種轉(zhuǎn)錄后水 平的同源靶基因沉默，RNAi能達(dá)到基因敲除的效果。43. SiRA制備方法比較合成方法特點(diǎn)適用不適用化學(xué)合成價格高已找到最有效 siRNA,大量篩選體外轉(zhuǎn)錄毒性小，穩(wěn)定 性好,效率高，一大量潴耍.特定 的，長期用RNaselH消化 長片段節(jié)省快速而經(jīng)濟(jì)的研 究某癌因缺失表 型不宜K期，特定 的siRNA研究及 基因治療siRNA表達(dá)載體價格似高，常用特定siRNA,穩(wěn) 定篩選siRNA衣達(dá)框架表達(dá)穩(wěn)定,測序困難篩選長期研究44. 基因工程一般步驟：L分離目的基因（化學(xué)合成、制備DNA文庫、制備基因 組文庫、PCR

33、）； 2.DNA切割（限制性內(nèi)切酶vector和目的基因片段）;3.連 接;4.轉(zhuǎn)化:b） E.Coli細(xì)胞轉(zhuǎn)化CaCI2法制備感受態(tài)細(xì)菌a）真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化：b） micro-injection （微注射）（細(xì)胞核大）C）磷酸鈣共沉淀法（貼壁細(xì)胞）d） electroporation （電穿孔，電激，電擊）（懸浮細(xì)胞）e）基因槍（貼壁細(xì)胞/組織塊）f） liposome （脂質(zhì)體）5.篩選重組體：藍(lán)白篩選（Q-互補(bǔ)法）；營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)法；抗生素抗性互補(bǔ)。gene manipulationTranscription termination sequenceGene encoding represso

34、r that binds O and regulates PBacterial promoter (r) and operator (O) sequencesP 0/RibosomebindingsitePolylinker with unique sites for several restriction endonucleases (ie, cloning sites) .Selectable genetic marker (e.g., antibiotic resistance)45 . Expression vector:就是在克隆栽體的骨 架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)原件,如啟動子、目的 基因

35、、終止子、標(biāo)記基因，使目的基因能夠 表達(dá)的載體。46 . Plasmid：質(zhì)粒，指一種小環(huán)狀DNA分子， 存在與細(xì)胞染色體外，能夠自主復(fù)制產(chǎn)生 特定的功能。47 . LncRNA：長鏈非編碼RNA,由基因組編碼產(chǎn) 生，長度大于200個核昔酸，沒有編碼蛋 白的能力。48 . Palindrome：回文序列，也叫作反向重復(fù)序 列,指核酸序列的5'-3'方向與其另一條鏈 相同。49 . CRISPR：是一種來自細(xì)菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機(jī)制， Cas9蛋白有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割DNA的兩條單鏈。Cas9先與crRNA 及tracrRNA結(jié)合成復(fù)合物，然后

36、通過PAN序列結(jié)合并侵入DNA,形成RNA-DNA復(fù) 合結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對目的DNA雙鏈的切割，使DNA雙鏈斷裂。50 .基因工程常用的醉：限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA polymerase51 .請設(shè)計一個QRT-PCR實(shí)驗(yàn)，簡述其原理，過程。（可以結(jié)合文獻(xiàn)，舉例說明）。qRT-PCR：（熒光定量PCR）在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí) 時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程中每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積數(shù)量，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板 進(jìn)行定量分析的方法。逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)，提取組織或細(xì)胞中的總RNA,以其中的mRXA作為模板，采 用Olig。（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄前反轉(zhuǎn)錄成cDNA.

37、cDNA 模板2plSYBRP/vmix by Taq (2X)12.5plForward primeri，AclF (1 (hnM )1plReverse princr2/Act-R (lOmM)IplROX Rcfcrcncc Dye (50X)0.5jd無菌超純水9Pl總體枳25Pl反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq：含有 TaKaRa Ex Taq, dNTP mixture, Mg2+, SYBR Green I 等。52 .請設(shè)計一個載體，在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)一個目的基因(舉例說明)。Recombinant DNA TechnologyProcess of clonin

38、g ：1. Isolation of target gene (分離目的基因)百度文蚱-讓每個人平等地提升自我2. Selection and construction of vectors （載體的選擇和構(gòu)建）3. Ligation of target DNA and vector （載體與目的基因結(jié)合）提取質(zhì)粒，限制酶切割質(zhì)粒，用限制酶從其他組織切割目的基因暴露粘性末端。載 體與目的基因結(jié)合得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒導(dǎo)入E. coli中4. Transformat ion of target gene into receptor cell （目的基因?qū)胧荏w細(xì) 胞）Introduction：

39、transformation （E.coli）transfect ion （Tumor cells）infection （Virus）o5. Screening for recombinant plasmids （重組質(zhì)粒的篩選）6. Expressing a cloned gene （克隆基因的表達(dá)）53 .內(nèi)含子：真核生物細(xì)胞DNA中的間插序列。含調(diào)控序列，參與基因表達(dá)。54 .外顯子：為蛋白質(zhì)氨基酸編碼的DNA序列。55 .基因組：一個細(xì)胞或者生物體所攜帶的一套完整的單倍體序列，包括全套基因和間 隔序列。56 .真核細(xì)胞基因組的特征 DNA量大、斷裂基因/含有內(nèi)含子和外顯子、重復(fù)序列（出

40、現(xiàn)原因：基因的多拷 貝、與染色質(zhì)的構(gòu)象著絲點(diǎn)的形成有關(guān)、參與表達(dá)調(diào)控，染色質(zhì)DNA的“區(qū)間 性”）、不存在操縱子結(jié)構(gòu)、57 .微衛(wèi)星（microsatellite）:遍布于人類基因組的短小重復(fù)序列，每一重復(fù)序列為lbp 6bp,重復(fù)次數(shù)不超過60次，片段長度小于350 bpo58 .操縱f（operon）：由功能相關(guān)的一組結(jié)構(gòu)基因（structural genes）串聯(lián)在一起, 包括上游的調(diào)控區(qū)共同構(gòu)成。59 .試述轉(zhuǎn)錄前水平的表達(dá)調(diào)控的方式：基因丟失（體細(xì)胞分化過程中，必須將某些基 因永久性關(guān)閉。最簡單有效的方式是將這些基因丟失。將要分化為生殖細(xì)胞的細(xì)胞 則一直保留著整套基因組）、擴(kuò)增（發(fā)育分化、環(huán)境條件的改變，對某些基因產(chǎn)物的