副溶血性弧菌快速檢測研究進展概要

1、作者單位：第一軍醫(yī)大學熱帶軍隊衛(wèi)生學系微生物學教研室，廣東廣州510515?綜述？副溶血性弧菌快速檢測研究進展譚翰清，萬成松中圖分類號:Q939.1文獻標識碼:A文章編號:1671-5039（200401-0021-03副溶血性弧菌（vibrioparahaemolyticus,Vp是一種嗜鹽性細菌，屬弧菌科（Vibrio弧菌屬，主要存在于近海岸的海水、海底沉積物和魚類、蝦類、貝類、牡蠣等海產品中。人多因食用被本菌污染而又未煮熟的海產品而引起中毒，在細菌性食物中毒中，比例高、危害大。目前，我國常規(guī)檢測方法大多要經過前增菌、選擇性增菌、選擇性培養(yǎng)、生化鑒定、神奈川現(xiàn)象和血清學反應等過程，時56d

2、，檢出率低，疫、,近年來世界發(fā)病率呈上升趨勢1。因此，建立Vp快速、準確、特異、靈敏的檢測診斷方法是十分必要的。下面對副溶血性弧菌快速檢測方法的研究進展進行綜述。1KP溶血試驗副溶血性弧菌臨床分離株絕大部分都能產生耐熱直接溶血毒素（thermostabledirecthemolysin,TDH,并能在我萋血平板上產生一種特殊的溶血現(xiàn)象，叫做神奈川現(xiàn)象（kanawagaphenomenen,KP®該試驗需經過前增菌、選擇性增菌、選擇性培養(yǎng)后，挑取可疑菌落接種到我萋血平板上，置于37C孵箱中過夜，如菌苔周圍出現(xiàn)透明溶血環(huán)，即為KP陽性，據此診斷樣本中含有Vp。該試驗是檢測副溶血性弧菌最基

3、本的方法，能把絕大部分副溶血性弧菌檢測出來，但操作繁瑣、所需時間長（約4d,而且存在部分TDH-株，易漏檢，給人們健康帶來危害。2免疫學方法免疫學方法特異性強、靈敏度高、易于觀察、應用廣泛。血清學反應是最基本的免疫學反應，主要用于細菌分型。目前，通過血清學反應，Vp可分為13種O血清型、71種K血清型3。正確的分型為流行病學調查和臨床用藥提供依據。但此反應只能大概區(qū)分不同地區(qū)和來源的菌株，而且由于抗原位點受環(huán)境等因素的影響易發(fā)生突變，出現(xiàn)新的血清型時4,以現(xiàn)有的血清檢測就會漏檢。目前,應用最廣泛的免疫學方法是酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELIS

4、A。該,特異性好，靈敏Vp臨床分離株大多為TDH+株，TRH(ther2mostablerelatedhemolysin陽性株只占10%15%,少數(shù)為TDH和TRH雙陽性，環(huán)境分離株幾乎無TDH+5,6,所以大多研究者主要選擇TDH、TRH為抗原，制備相應的抗體進行檢測。ELISA抗體的包被與固定是關鍵，影響檢測的靈敏度和特異性。Honda等7設計了一種新的固定方法，用HCl、聚乙烯(polythylenceimine,PEI、甲基乙烯基馬來酸酊聚合醴(malwicanhydridemethylvinylethercopolymer,MAMEC等化學試劑處理尼龍膜,接著固定包被TDH和TRH的

5、單克隆抗體，然后與Vp培養(yǎng)肉湯中TDH或TRH反應15min,洗滌后，與抗TDH、TRH的兔血清多克隆抗體37C反應15min,再與堿性磷酸酶標記的抗兔抗體IgG反應，最后底物顯色。結果顯示，經過緊密相連的三次抗原抗體反應，特異性100%,靈敏度9515%,并且通過肉眼觀察就能區(qū)分TDH和TRH株。同時，該尼龍膜也可以直接用于檢測糞便標本，特異性達8819%,靈敏度達92%,并能在1h內完成檢測。此固定方法減少非特異性吸附，增強抗體結合度，從而增強了特異性，提高了靈敏度。但是，這種方法涉及到抗體包被、固定、抗體的標記、顯色等步驟，操作繁瑣，技術要求高，而且尼龍膜不能長期保存，不能進行大規(guī)模臨床

6、檢測。同時，直接檢測時，抗原量可能不足，抗原位點也容易改變，導致出現(xiàn)新的血清型，如近年來出現(xiàn)新的O3:K6血清型8,最終造成漏檢。？123核酸雜交免疫學方法是在蛋白水平檢測Vp,而核酸雜交則是在基因水平進行檢測,結果更為特異、準確、可靠。用于檢測Vp的核酸雜交方法主要有斑點雜交、Southern雜交、夾心法雜交。311斑點雜交1992年,Yamamoto等9針對tdh和trh101125bp的基因設計探針,對Vp進行斑點雜交檢測，其中tdh探針基因序列為5'2ccccggttctgaXgagatattgtt23',trh探針基因序列為:5'2tccaggttcggaga

7、gctactatt23為dUTP,用于標記堿性磷酸酶。他們將Vp臨床分離株的克隆基因片段點到尼龍膜，與探針在50C雜交10min,洗滌，最后底物顯色。結果顯示，tdh探針特異性為100%、靈敏度為93%;trh探針特異性為93%、靈敏度為86%。但是，tdh探針把部分弧菌科的其他細菌也檢測出來，造成一定的假陽性，而且膜上核酸片段易脫落，不能長期保存。312Southern雜交1998年,Suthienkul等6株進行SKYEcoRI片段，長pKY298的EcoRI片段，長334bp,dUTP都標記上地高辛。他們將菌株的DNA片段Hindm酶切、電泳、尼龍膜轉移后，與tdh、trh探針雜交，然后

8、與堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體反應，最后底物顯色。結果顯示，tdh和trh探針特異性好，把tdh十株（共127株和trh十株（共37株全部檢測出來。313夾心然而，這種方法操作繁瑣、時間長，不適合臨床實驗室的快速檢測法雜交2003年,Lee等10采用夾心雜交法檢測海產品中Vp的tl基因。他們對微孔板進行NH修飾,然后與tl基因捕獲探針的磷酸基團共價結合,接著把PCR變性產物、標記生物素的信號探針加到微孔板中進行雜交反應，洗滌后，與酶標鏈親和素結合，最后底物顯色并在405nm紫外燈下檢測。結果顯示，該方法檢測信噪比在14114312之間，特異性好，靈敏度高，能把每克牡蠣組織里10個Vp檢測出來。

9、該方法易于制成試劑盒，目前，美國市場上已有銷售。由于試劑盒已經把捕獲探針固定在微孔板上，檢測時只需把PCR產物加到微孔板中雜交就行了，操作簡單，重復性好，靈敏度高，特異性好，能進行臨床大規(guī)模的快速檢測，并且易于在普通實驗室推廣。4PCR近年來，隨著微生物基因組學的發(fā)展，微生物基因檢測迎來了新的機遇。2000年,Makino等11已經完成Vp的基因組測序,Vp毒力基因及特異的基因序列得到進一步確定。根據Vp特異基因序列，設計引物，進行PCR檢測，是現(xiàn)階段檢測Vp的最快速準確的方法。目前應用于檢測Vp的PCR方法主要有任意引物PCR(abritrarilyprimedPCR,Ap2PCR、針對任意

10、引物PCR、多重PCR(multiplex2PCR、實時PCR(real2timePCR。411任意引物PCRMatsumoto等12采用任意引物PCR對Vp進行檢測。他們針對Vp的tdh和trh基因一段特異的序歹！J,設計兩條引物，引物1:5'2ggtgcgggaa23引物2:5'2gtttcgctcc23對'19771998年所收集的227株Vp進行PCR。通過電泳分析發(fā)現(xiàn)，19961998年收集的22株血清型為03：K6菌株與1996年以前收集的03：K6,為03：K6血清型新出現(xiàn)的變異株，。這。1993tdh基因，因此絕大部分研究者都根據tdh設計引物進行特異擴

11、增年,Lee等13根據tdh基因設計引物，對36株TDH+株、89株TDH-株以及46株其他弧菌和腸道菌進行PCR檢測。結果顯示，36株TDH+株全部特異擴增出來，其余菌株都沒有擴增；而檢測靈敏度高，最低檢測量可至40pgDNA,并可直接檢測糞便標本，無需分離培養(yǎng)，方便快速。2gtcttctgacgoagttg1999年，Kim等14選擇toxR基因序列設計兩對引物，523'和5'2atacgagtggttgctgtcatg23寸14株'Vp、14株其他弧菌進行PCR。結果顯示，14株Vp都得到一條368bp的特異擴增亮帶，而其他菌株沒有特異擴增。此外，Venkates

12、waran等15選擇gyrB基因設計引物對Vp進行PCR、Cordova等16選擇pR72H基因設計引物進行PCR，特異性、靈敏度都很好。413多重PCR由于不是全部副溶血性弧菌都含tdh或trh基因，所以只針對tdh或trh的單一PCR，有時會漏檢。多重PCR(multiplex2PCR能全方面高效率地檢測Vp。1994年,Bej等5針對tl、tdh、trh設計不同的引物對，在同一PCR反應體系內同時擴增tl、tdh、trh。結果顯示，所有的Vp都擴增出tl基因,tl基因是Vp特異的；54%的Vp擴增出tdh基因；只有38173%的Vp擴增出trh基因；該法靈敏度高能把10g牡蠣培養(yǎng)肉湯里1

13、0100個Vp檢測出來。與其他常規(guī)生化方法相比，多重PCR更快速、僅8h就能完成檢?22?測，結果更為準確、可靠，而且還可改進成定量競爭PCR，對標本中靶序列進行定量0414實時PCR常規(guī)PCR檢測，需要從反應體系中吸取產物做電泳或Southern雜交等實驗進行鑒定，轉移過程中易污染，造成假陽性,而且耗費時間。1996年,Tyagi開創(chuàng)了一種實時PCR(real2timePCR。實時PCR是在PCR反應體系中加入標記有報告基團和猝滅基團的線性Taqman探針或莖環(huán)型熒光分子信標探針，在基因擴增過程中，與產物雜交，此時，報告基團和猝滅基團距離分開，根據能量共振轉移現(xiàn)象，報告基團發(fā)出熒光而被檢測。

14、這種方法操作簡單，閉管檢測，減少污染，靈敏度高，并且可以在PCR結束或PCR過程進行同步定性或定量檢測，而且可以進行臨床大規(guī)?？焖贆z測。2003年舊lackstone等17針對tdh設計熒光分子信標探針，對從牡蠣中富集的13個不同種類的菌株進行實時PCR檢測。結果顯示，只有含tdh的Vp才被檢測出來，特異性好，靈敏度高，體系的1個CFU檢測出來確，探針，PCR自1996展，相信隨著經濟的發(fā)展、技術的進步、實時熒光檢測儀的普及，將會得到更為廣泛的應用。5展望隨著微生物基因組學、現(xiàn)代分子生物學理論與技術的發(fā)展以及新儀器研發(fā)，副溶血性弧菌的檢測方法必將向快速、準確、靈敏、特異的方向發(fā)展，特別是PCR

15、、核酸雜交、ELISA這三大現(xiàn)代分子生物學技術的聯(lián)用以及實時PCR的進一步完善，將會實現(xiàn)副溶血弧菌快速、準確、靈敏、特異、大規(guī)模的檢測診斷，大大提高食品檢驗檢疫和臨床診斷的檢測質量和效率。參考文獻：1 GoochJA,DepaolarA,KaysmerCAetal.Evaluationoftwodirecplat2ingmethodsusingnonoradioactiveprobesforenumerationofvibrioparahaemolyticusinoystersJ.ApplandEnvironMicrobiol,2001,67(2:721-724.2 OkudaJ,Nishib

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