植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)

1、第第七章七章 植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)主要內(nèi)容1、植物基因轉(zhuǎn)化受體的條件；2、植物基因轉(zhuǎn)化受體的類型及其特性；3、植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立；4、受體系統(tǒng)常見(jiàn)的問(wèn)題及其解決途徑。 我國(guó)科學(xué)工作者，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以轉(zhuǎn)變矮牽?；ǖ幕ㄉ?，使矮牽牛花的花色更加豐富多彩。 轉(zhuǎn)基因牽?；ㄞD(zhuǎn)基因牽牛花 轉(zhuǎn)基因油菜 油菜是人們食用油的主要來(lái)源之一。一般油菜籽的含油量約為40左右。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育出來(lái)的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的純度質(zhì)量更好轉(zhuǎn)基因小麥 從植物體中分離出合成賴氨酸的基因，把這基因轉(zhuǎn)入小麥植株中，培育出轉(zhuǎn)基因小麥。用這種轉(zhuǎn)基因小麥制造出來(lái)的面粉，更適合用來(lái)烤面包

2、，而且面粉中賴氨酸含量高，這種面包的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。 第一節(jié) 植物基因轉(zhuǎn)化受體的條件植物基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)：一般是指通過(guò)組織培養(yǎng)途徑或其他非鉆石培養(yǎng)途徑，能夠高效、溫度地再生無(wú)性系，并能接受外源基因的整合，對(duì)用于轉(zhuǎn)化選擇的抗生素敏感的再生系統(tǒng)高效穩(wěn)定的再生能力具有較高的再生頻率；具有良好的實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性和重復(fù)性。較高的遺傳穩(wěn)定性植物周倜系統(tǒng)接受外源基因后不影響吱聲非改造遺傳體系又能外源基因遺傳給后代，保持其遺傳的穩(wěn)定性同時(shí)選材時(shí)注意盡量減小受體系統(tǒng)體細(xì)胞變異的發(fā)生具有溫度的外植體來(lái)源由于基因轉(zhuǎn)化頻率低，實(shí)驗(yàn)重復(fù)較多，因此需要穩(wěn)定的外植體來(lái)源；常用轉(zhuǎn)化外植體：種子，無(wú)菌實(shí)生苗的胚軸、子夜或幼葉，一些植物

3、的試管苗，以及可較高頻率誘導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)變態(tài)器官?？股孛舾行詾榱吮阌谵D(zhuǎn)化子的篩選需要使用標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因等）選擇性抗生素需滿足的條件：（1）植物受體材料對(duì)所選用的抗生素具有一定的敏感性；（2）抗生素對(duì)受體植物沒(méi)有劇烈的毒性，不會(huì)很快殺死植物細(xì)胞對(duì)抗生素過(guò)度敏感或過(guò)度鈍化的植物材料都不適合于構(gòu)建植物轉(zhuǎn)基因的受體系統(tǒng)農(nóng)桿菌敏感性農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化由于具有轉(zhuǎn)化效率高、多為單拷貝插入等優(yōu)點(diǎn)，是常用的植物基因轉(zhuǎn)化方法；使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，需要植物受體對(duì)農(nóng)桿菌敏感在選擇農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)前，必需測(cè)試受體系統(tǒng)對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性第二節(jié) 植物基因轉(zhuǎn)化受體的類型及其特性由于眾多類型的植物離體培養(yǎng)技術(shù)的完善

4、，使轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)有了很大的選擇范圍不同的受體類型具有不同的缺點(diǎn)，適合的轉(zhuǎn)化方法也不同實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)受體的特性，基因轉(zhuǎn)化方法，選擇適宜的受體系統(tǒng)特點(diǎn)外植體來(lái)源廣泛擴(kuò)繁量大，可獲得較多的轉(zhuǎn)化植株使用的植物范圍廣從愈傷組織分化的不定芽的多細(xì)胞起源特點(diǎn)，形成嵌合體較多再生植株無(wú)性系變異較大，轉(zhuǎn)化的外源基因遺傳穩(wěn)定性較差注意問(wèn)題直接使用外植體組織進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染時(shí)，應(yīng)注意從活躍生長(zhǎng)的植物部位取材用愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，應(yīng)在愈傷組織細(xì)胞處于分省細(xì)胞狀態(tài)時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，此時(shí)易于接受外援基因，轉(zhuǎn)化效率高愈傷組織必需保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，繼代周期不能太長(zhǎng)不經(jīng)過(guò)愈傷組織的受體系統(tǒng)不經(jīng)過(guò)愈傷組織的受體系統(tǒng)也稱為直接分化再生

5、系統(tǒng)，是指外植體細(xì)胞越過(guò)脫分化階段，直接分化出不定芽，從而獲得再生植株的受體系統(tǒng)；研究顯示，采用葉片、幼莖、子葉、胚軸以及一些營(yíng)養(yǎng)變態(tài)器官為外植體時(shí)，在適宜的培養(yǎng)技術(shù)控制下，均可直接分化出芽特點(diǎn)獲得再生知足周期短，操作簡(jiǎn)單體細(xì)胞無(wú)性系變異相對(duì)較小，可較好的維持受體植株的遺傳特性轉(zhuǎn)化的外源基因能穩(wěn)定遺傳（特別是莖尖）同樣可能出現(xiàn)較多的嵌合體外植體直接分化出芽較難，轉(zhuǎn)化細(xì)胞直接分化成植株難度更大注意問(wèn)題直接分化受體系統(tǒng)比較適合于無(wú)性繁殖植物選材：從組織類型上講，子葉、葉片、胚軸和某些營(yíng)養(yǎng)變態(tài)器官通常比較容易誘導(dǎo)；從細(xì)胞狀態(tài)上講。薄壁細(xì)胞狀態(tài)外植體較容易誘導(dǎo)原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體由于除去了細(xì)胞壁的

6、屏障，能夠直接高效的攝取外源DNA或遺傳物質(zhì)，甚至細(xì)胞核適合于現(xiàn)在建立的所有轉(zhuǎn)化方法特點(diǎn)原生質(zhì)體受體系統(tǒng)利于準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)化和鑒定轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體獲得的轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少但由于目前許多的原生質(zhì)培養(yǎng)體系還不成熟，受原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)的限制，轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的重復(fù)性較差原生質(zhì)體培養(yǎng)周期長(zhǎng)，受體細(xì)胞本身的體細(xì)胞變異頻率高，遺傳穩(wěn)定性差細(xì)胞系及其體細(xì)胞胚受體系統(tǒng)經(jīng)過(guò)篩選和優(yōu)化的植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞系，具有較好的遺傳和生理一致性，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)，可形成體細(xì)胞胚培養(yǎng)技術(shù)相對(duì)于原生質(zhì)體培養(yǎng)來(lái)說(shuō)要容易的多，轉(zhuǎn)化效率優(yōu)于其他組織培養(yǎng)系統(tǒng)被認(rèn)為是最為理想的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)特點(diǎn)胚性細(xì)胞繁殖量大，同步性好，具有較強(qiáng)的接受外源DNA的能

7、力，轉(zhuǎn)化率高轉(zhuǎn)化后胚性細(xì)胞可通過(guò)體細(xì)胞胚途徑發(fā)育成完整植株，嵌合體少體細(xì)胞胚具有雙極性，減少了不定芽發(fā)育途徑中的生根培養(yǎng)過(guò)程來(lái)自同一體細(xì)胞胚的后代個(gè)體間遺傳背景一致，無(wú)性系變異小生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)以生殖細(xì)胞如花粉粒和卵細(xì)胞為周倜細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)稱為生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)，也叫種質(zhì)系統(tǒng)。途徑：（1）利用小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)，誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞或愈傷組織細(xì)胞，建立單倍體的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；（2）直接利用劃分和卵細(xì)胞受精過(guò)程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管通道法，花粉粒浸泡法和子房微注射法。特點(diǎn)：具有更強(qiáng)的接受外源DNA的潛能轉(zhuǎn)化的基因無(wú)顯隱性的影響，利于性狀的選育，加倍后可迅速獲得純合二倍體新品種花粉管通道

8、法將現(xiàn)代的分子育種與常規(guī)育種緊密結(jié)合，是十分有潛力的受體系統(tǒng)在花粉或小孢子培養(yǎng)系統(tǒng)作為受體系統(tǒng)更為理想第三節(jié) 植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立建立一個(gè)好的受體系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的先決條件受體系統(tǒng)的建立主要依賴于植物組織培養(yǎng)技術(shù)，而且要求比一般的組織培養(yǎng)技術(shù)要高一、高頻再生系統(tǒng)的建立高頻再生系統(tǒng)必須滿足4個(gè)條件：（1）外植體的組織細(xì)胞具有誘導(dǎo)愈傷組織和再生完整植株的能力，并且最好是外植體能直接分化出芽（2）芽的分化率要高（3）易于離體培養(yǎng)，具有高度可重復(fù)性（4）體細(xì)胞無(wú)性系變異小外植體的選擇外植體的生理年齡外植體細(xì)胞的生理狀態(tài)外植體的遺傳背景外植體的選擇與受體系統(tǒng)類型匹配培養(yǎng)基的選擇植物的營(yíng)養(yǎng)特性選擇

9、原則急速的選擇二、抗生素敏感性受體系統(tǒng)建立你時(shí)，需要對(duì)相關(guān)的抗生素種類及其濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抗生素種類和濃度的篩選要考慮植物種類和農(nóng)桿菌株系兩個(gè)方面對(duì)植物細(xì)胞無(wú)毒，不顯著抑制植物細(xì)胞生臟濃度以能夠抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)而不妨礙植物生長(zhǎng)的濃度為宜用于轉(zhuǎn)化子篩選的抗生素濃度的確定三、農(nóng)桿菌敏感性試驗(yàn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化是目前植物基因轉(zhuǎn)化中使用較廣、技術(shù)較成熟的實(shí)驗(yàn)體系選擇農(nóng)桿菌敏感性較高的受體植物及其適宜的組織細(xì)胞類型是成功轉(zhuǎn)化的重要因素轉(zhuǎn)化前可用野生型農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染試驗(yàn)，篩選敏感性材料第四節(jié) 受體系統(tǒng)常見(jiàn)的問(wèn)題及其解決途徑再生能力及其遺傳穩(wěn)定性愈傷組織褐化再生植株玻璃化影響受體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化效率

10、的因素農(nóng)桿菌菌株Vir基因活化的誘導(dǎo)外植體的類型和生理狀態(tài)外植體的預(yù)培養(yǎng)外植體的接種及共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化植株再生1、以原生質(zhì)體或細(xì)胞為周倜的直接基因轉(zhuǎn)移2、載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化3、種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化1、以原生質(zhì)體或細(xì)胞為受體的直接基因轉(zhuǎn)移聚乙二醇法電激法脂質(zhì)體法磷酸鈣-DNA共沉淀法顯微注射法基因槍法超聲波法PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化 利用化學(xué)試劑，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、多聚-L-鳥(niǎo)氨酸(pLO)和磷酸鈣等，誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子，進(jìn)入原生質(zhì)體的外源DNA分子就有可能通過(guò)某種機(jī)制整合到基因組中，完成遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程。 第一例成功的轉(zhuǎn)基因煙草就使用該轉(zhuǎn)化方法獲得的

11、。 脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 利用脂類化學(xué)物質(zhì)包裹外源DNA成球體，通過(guò)植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。 特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高；操作繁瑣；技術(shù)性更高。電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上“電激穿孔” ，形成可逆的瞬間通道,從而促進(jìn)外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體。 特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高；操作簡(jiǎn)便 ；特別適于瞬時(shí)表達(dá)的研究；容易造成原生質(zhì)體損傷。顯微注射介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化 利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。 特點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化率高；適用于各種植物和材料，無(wú)局限性；對(duì)受體細(xì)胞無(wú)毒害。激光微束介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化 將激光引入光學(xué)顯微鏡聚焦

12、成微米級(jí)的微束照射培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入細(xì)胞培養(yǎng)基里的外源DNA流入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便；工作效率高；適應(yīng)于各種動(dòng)植物；受體的類型廣泛；用于細(xì)胞器的基因轉(zhuǎn)化?；驑尫?particle gun) 將外源DNA包被在微小的金?；蜴u粒表面，然后在高壓的作用下將微粒高速射入受體細(xì)胞或組織，微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物染色體上并得到表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化。根據(jù)基因槍的動(dòng)力系統(tǒng)，分為3種類型火藥爆炸力為加速動(dòng)力，采用塑料子彈和阻擋板。塑料子彈前端載放著DNA包裹的鎢/金粉。高壓氣體作為動(dòng)力，如氦氣、氫氣、氮?dú)獾?。把載有DNA的鎢/金粉鋪灑在一

13、張微粒載片上，在壓縮空氣的沖擊下，驅(qū)動(dòng)載片，當(dāng)載片受阻于金屬篩網(wǎng)時(shí)，載有DNA的鎢/金粉繼續(xù)向下沖擊射入細(xì)胞。高壓放電為驅(qū)動(dòng)力，可以無(wú)級(jí)調(diào)速，通過(guò)變化工作電壓，使載有DNA的鎢/金粉粒子能達(dá)到目的細(xì)胞層。PDS-1000/He系統(tǒng)系統(tǒng)基因槍的操作步驟a)DNA微彈的制備：金粉或鎢粉50100mg、DNA、CaCl2、PEG4000和亞精胺b)靶外植體材料準(zhǔn)備c)DNA微彈轟擊d)轟擊后外植體的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化率及其影響因素a)金屬微粒的影響b)DNA沉淀輔助劑的影響c)DNA的純度及濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響d)微彈速度的影響e)植物材料的內(nèi)在因素的影響2、載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化病毒介導(dǎo)的基因

14、轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法植物冠癭瘤植物的一種癌癥冠癭瘤的起因：由根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)屬根瘤菌科(Rhizobiaceat)對(duì)植物的侵染而引起冠癭瘤的侵染過(guò)程：細(xì)菌通過(guò)傷口進(jìn)入植物，在基因水平上轉(zhuǎn)化植物。細(xì)菌DNA中的編碼基因在植物細(xì)胞中表達(dá)，刺激植物細(xì)胞不受控制的分裂，形成瘤。冠癭瘤冠癭瘤Ti質(zhì)粒(Tumor inducing plasmid)Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子，其分子量為95156 106D，約有200kb。Ti質(zhì)粒的類型： 根據(jù)冠癭瘤合成的冠癭堿種類不同分為：a)章魚(yú)堿型 (octopine) b)胭

15、脂堿型 (nopaline)c)農(nóng)桿堿型 (agropine) Ti質(zhì)粒的基因結(jié)構(gòu)：T-DNA區(qū)、Vir區(qū)、Con區(qū)和Ori區(qū)共4個(gè)區(qū)段。 Ti質(zhì)粒的遺傳特性I.T-DNA區(qū) (transfer DNA region) Ti質(zhì)粒中的一部分DNA片段，進(jìn)入寄主細(xì)胞并插入基因組中，能夠利用植物的酶系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，其表達(dá)產(chǎn)物可誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)特征：a)左右兩端邊界各有一個(gè)25bp長(zhǎng)的正向重復(fù)序列(Lb和Rb) ，具有高度保守性。b)右邊界突變和缺失導(dǎo)致轉(zhuǎn)移能力降低或喪失。c)T-DNA以單拷貝或多拷貝的形式隨機(jī)整合到植物染色體DNA上。胭脂堿T-DNA (23kb) pTiC5

16、8章魚(yú)堿T-DNA (13.6kb) pTiAch5NOSNOS：胭脂堿合成胭脂堿合成酶基因酶基因 ocsocs：章魚(yú)堿合章魚(yú)堿合成酶基因；成酶基因；tmrtmr：根性腫瘤根性腫瘤基因基因tmstms：芽性腫瘤芽性腫瘤基因；基因；tmltml：大腫瘤基大腫瘤基因因II.Vir區(qū)(毒性區(qū))在Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)的上游的一組基因。表達(dá)產(chǎn)物激活T-DNA向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移，使植物引發(fā)腫瘤。III. Con區(qū)含有農(nóng)桿菌之間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因(tra)IV.Ori區(qū)(復(fù)制起始區(qū))調(diào)控Ti質(zhì)粒自我復(fù)制。取代型Ti質(zhì)?？寺≥d體 用E.coli質(zhì)?？寺≥d體取代野生型Ti質(zhì)粒的全部或部分T-DNA核苷酸序列，構(gòu)建的

17、載體。 onc-Ti質(zhì)?？寺≥d體 T-DNA上Onc基因被取代；保留T-DNA的兩端邊界序列和nos基因。 onc+Ti質(zhì)?？寺≥d體 T-DNA上的部分序列被pBR322所取代，仍保留Onc基因。進(jìn)入植物細(xì)胞后，可誘發(fā)冠癭瘤，如pGV3850和pMPG1。 pGV3850從胭脂堿Ti質(zhì)粒pTiC58衍生而來(lái)含有T-DNA邊緣區(qū)，以及除T-DNA以外全部的DNA序列臨近右側(cè)邊緣區(qū)(RB)編碼胭脂堿合成酶的nos基因，供作鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的記號(hào)缺失的T-DNA核心區(qū)由pBR322序列取代 IQM1pBI121-P35S:IQM1-Hm35S35S啟動(dòng)子是植物基因工程中常用的組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)子是植物基因工程中常用的組成型啟動(dòng)子中間質(zhì)?？寺≥d體 T-DNA的部分序列插入大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體，承載外源基因后，須先在輔助質(zhì)粒推動(dòng)下進(jìn)入農(nóng)桿菌，再在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下送入植物細(xì)胞。共整合克隆載體系統(tǒng)利用體內(nèi)重組技術(shù)