微生物檢驗員培訓資料

1、一. 基礎知識（一） 微生物基礎知識1. 培養(yǎng)基培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質的要求也各不相同，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。 瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質，是應用最廣的凝固劑。加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98100下融化，于45以下凝固。但多次反復融化，其凝固性降低。 任何一種培養(yǎng)基一經制成就應及時徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培養(yǎng)基

2、的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。（二） 消毒與滅菌知識5.2滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學滅菌法兩大類。本實驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。 加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內蛋白質凝固變性，從而達到殺菌目的。蛋白質的凝固變性與其自身含水量有關，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質易于凝固；同時濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。 （三） 潔凈室行為規(guī)范（四） 實驗室安全知識二. 基本操作（一）培養(yǎng)基配制、滅菌、使用和保藏1. 配制1.1 按照培養(yǎng)基瓶簽所示，準確稱

3、量一定培養(yǎng)基干粉于合適的容器，加純化水溶解。1.2 根據培養(yǎng)基對pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調至所需pH。1.3 如需分裝，應先加熱攪拌，待培養(yǎng)基完全溶解并均一后進行。分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。 1.4 培養(yǎng)基經滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。 2. 滅菌2.1 按照培養(yǎng)基瓶簽所示的滅菌條件

4、（溫度和時間）對配制好的培養(yǎng)基進行高壓滅菌。配制好的培養(yǎng)基應在2小時內進行滅菌。3. 保藏和使用3.1 液體培養(yǎng)基管置專用不銹鋼筒內， 225避光保存，3周內使用。在不銹鋼筒貼標簽，標明培養(yǎng)基名稱、培養(yǎng)基配制日期、高壓滅菌編號等信息。不同批次培養(yǎng)基不得置于同一不銹鋼筒內。3.2 平板和接觸皿置專用不銹鋼筒，標明培養(yǎng)基名稱、制備日期、培養(yǎng)基的滅菌編號，用保鮮膜密封筒口后，225避光保存，3周內使用。不同批次平板和接觸皿不得置于同一容器內。3.3 培養(yǎng)基使用之前應預培養(yǎng)，合格后方可使用。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：25-35，預培養(yǎng)3天。硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基：25-35，預培養(yǎng)2天?；⒓t瓊脂培養(yǎng)基和改良馬丁培

5、養(yǎng)基：23-28，預培養(yǎng)3天。（二） 消毒劑配制和使用1. 0.1%新潔爾滅溶液的配制和使用1.1基準處方：5%新潔爾滅溶液20ml 注射用水980ml1.2 作為手部和衣服浸泡消毒，設備、操作臺面和潔凈室六面擦洗消毒以及地漏消毒用，有效期為3個月。2. 75%酒精的配制與使用2.1 基準處方：95%乙醇790 ml 純化水210 ml2.2 作為消毒雙手（手套），擦洗設備、操作臺等表面消毒劑，有效期為14天。3. 2%來蘇兒（甲酚皂）溶液的配制和使用3.1 基準處方：50%來蘇兒（甲酚皂）溶液40 ml 純化水960 ml3.2 拖擦地面用，臨用前配制。4. 甲醛熏蒸作為環(huán)境空氣和表面消毒劑

6、。操作步驟：關閉風機無關人員撤出消毒區(qū)，操作人員戴防護手套和防毒面具將設備及器具暴露于空氣中將盛有甲醛溶液的不銹鋼飯盒置不銹鋼臺面上層飯盒倒入需要體積的甲醛（10ml/m3，每只飯盒不得多于250ml），下層飯盒倒入300ml 95%或無水乙醇點燃下層飯盒內乙醇，操作人員迅速離開保留被消毒空間的甲醛氣體至少8小時消毒結束后，開啟風機，直至消毒空間無甲醛刺激性氣味，方可進入工作。5. 臭氧消毒5.1 作為環(huán)境空氣和表面消毒劑。5.2 操作步驟：關閉風機無關人員撤出消毒區(qū)，操作人員戴防護手套和防毒面具將設備及器具暴露于空氣中設定消毒時間，開啟臭氧法生器面操作人員迅速離開保留被消毒空間的臭氧氣體至少

7、8小時消毒結束后，開啟風機，直至消毒空間無臭氧氣味，方可進入工作。6. 消毒劑交替使用6.1 隔周交替使用0.1%新潔爾滅溶液和75%酒精進行手部消毒。6.2 隔周交替使用0.1%新潔爾滅溶液和2%來蘇爾溶液拖擦地面。6.3 潔凈區(qū)每月對空氣消毒一次，甲醛消毒6個月一次，其余時間采用臭氧消毒。（三） 微生物室設備與設施1. 高壓滅菌器1.1原理：高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸汽,待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100的溫度

8、。導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。1.2 操作步驟：向高壓滅菌器滅菌艙內加水至排泄管口高度放入待滅菌物品，關閉滅菌器蓋開啟電源，設置滅菌溫度和時間以及排氣溫度按start鍵開始滅菌（依次經歷：升溫排氣升壓保壓降壓排氣降溫）滅菌結束后，取出滅菌物品，關閉電源清潔滅菌艙。1.3 注意事項待滅菌物品間應留適宜間隙，便于蒸汽穿透。當溫度在80以上時，蓋將不會被打開；當溫度低于60時，即可開蓋。每次滅菌前應保持滅菌艙內水位在規(guī)定線以上。 干熱滅菌法常用于空玻璃器皿、金屬器具的滅菌。凡帶有膠皮的物品，液體及固體培養(yǎng)基等都不能用此法滅菌。 .2干燥箱滅菌 將包扎好的物品放入干燥烘箱內，注意不要擺放太

9、密，以免妨礙空氣流通；不得使器皿與烘箱的內層底板直接接觸。將烘箱的溫度升至160170并恒溫12h，注意勿使溫度過高，超過170，器皿外包裹的紙張、棉花會被烤焦燃燒。如果是為了烤干玻璃器皿，溫度為120持續(xù)30分鐘即可。溫度降至6070時方可打開箱門，取出物品，否則玻璃器皿會因驟冷而爆裂。 用此法滅菌時，絕不能用油、蠟紙包扎物品。 5.2.2.3火焰滅菌 直接用火焰灼燒滅菌，迅速徹底。對于接種環(huán)，接種針或其它金屬用具，可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進行滅菌。此外，在接種過程中，試管或三角瓶口，也采用通過火焰而達到滅菌的目的。 2. 烘箱（干熱滅菌）2.1 原理：通過使用干熱空氣殺滅微生物。一般是

10、把待滅菌的物品放入電烘箱中烘烤，加熱至160170維持2h（除熱原要求250維持1h）。2.2 操作步驟：將待滅菌物品正確包扎與加塞，以免滅菌后被外界污染將包扎好的物品放入干燥烘箱內3. 超凈工作臺4. 培養(yǎng)箱5. 集菌儀6. 傳遞窗7. 潔凈室（四） 平板和接觸皿制備將需倒平板的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到4550,立刻倒平板。（五） 微生物數(shù)量測定三. 檢驗項目（一） 微生物限度檢查（二） 無菌檢查（三） 環(huán)境監(jiān)控檢查（四） 模擬灌裝檢查（五） 培養(yǎng)基靈敏度檢查（六） 菌株傳代與保藏四. 其它（一） 微生物形態(tài)觀察（菌落形態(tài)、染色與鏡檢）（二） 微生物分離純化培養(yǎng)（三） API法鑒定微生物（四

11、） PCR法鑒定微生物7思考 7.1制備培養(yǎng)基的一般程序是什么？ 7.2做過本次實驗后，你認為在制備培養(yǎng)基時要注意些什么問題？ 7.3滅菌在微生物學實驗操作中有何重要意義？ 4試述高壓蒸汽滅菌的操作方法和原理。 5高壓蒸汽滅菌時應注意哪些事項？標準菌種的保藏形式 我國提供的標準菌種通常是以凍干粉的形式包裝于熔封的厚玻璃容器中。在這種容器中，微生物通常與賦形劑共存，由于缺乏生長必須的環(huán)境條件，一般呈休眠狀態(tài)。純培養(yǎng) 所謂微生物的純培養(yǎng)是指在一個微生物的菌落形成單位中，所有的微生物細胞或孢子都屬于生物學的同一個種。嚴格地說，純培養(yǎng)是在培養(yǎng)基上由一個細胞或孢子分裂、繁殖而產生的后代。在該細胞或孢子的

12、生長過程種，不受其他微生物的侵犯，不會在培養(yǎng)物中產生另外微生物種的后代，在整個生長過程中不發(fā)生變異或死亡。 獲取純培養(yǎng)的工作環(huán)境1、潔凈工作室：環(huán)境潔凈度10000級下的局部100級的單向流空氣區(qū)域內，全過程必須無菌操作，防止微生物污染。2、無菌隔離艙獲取純培養(yǎng)的接種工具1、接種環(huán)2、接種針3、接種鏟4、接種鉤5、其他玻璃器械獲取純培養(yǎng)的其他器具1、玻璃器皿：如各種規(guī)格培養(yǎng)皿。2、微生物實驗室常用的設備，如高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱等獲取純培養(yǎng)的主要技術移植（又稱接種） 微生物的移植（或稱接種）是指將微生物接種在培養(yǎng)基上的操作。移植（又稱接種）的兩種方式劃線 和穿刺 1、劃線法是指用接種工具將微生

13、物細胞移植在固體培養(yǎng)基斜面或平板上的一種方法 。2、穿刺法是指用接種工具將微生物細胞移植到固體或半固體培養(yǎng)基內的一種方法。 影響集菌培養(yǎng)效果的若干因素n 溫度n 滲透壓n 氧氣n 光n pH值和氧化還原電位n 培養(yǎng)基n 抗生素驗證純培養(yǎng)的主要依據1、用顯微鏡觀察時，全部的生物個體是相似的，如果是細菌，對革蘭氏染色反應應當是一致的。2、將培養(yǎng)物制成懸液，重新傾注平板，或平板劃線培養(yǎng)后，所形成的全部菌落的形態(tài)應該是相似的。如果是細菌，將重新形成的菌落各作穿刺培養(yǎng)，其培養(yǎng)特征應當是一致的。3、從重新分離的各菌落作生理特征觀測時，如對氮源的利用，對糖類的發(fā)酵或同化以及其他生理生化的測定，應呈現(xiàn)出一致性

14、。 定期移植保藏法 一般步驟為：將菌種接種在所要求的培養(yǎng)基上，置最適溫度下集菌培養(yǎng)。得到健壯的菌體（如有性孢子、無性孢子或細胞等）后，放于溫度較低、干燥處保藏，并且每隔一定時間重新移植培養(yǎng)一次。 定期移植保藏法1、細菌置46保藏，芽孢桿菌每36個月移植一次，其他細菌每月移植一次。 2、放線菌于46保藏，每3個月移植一次。 3、酵母菌于46保藏，每46個月移植一次。 4、絲狀真菌于46保藏，每3個月移植一次。 5、擔子菌于46保藏，每3個月移植一次。6、保藏的濕度通常在5070為宜。 定期移植保藏法1、需定期檢查2、移植進行時，應仔細核對3、集菌培養(yǎng)完成后，應比較培養(yǎng)特征4、應注意觀察各代之間的

15、變化瓊脂斜面低溫保藏法1、菌種的典型菌落接種至斜面，規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng)，充分生長，硅膠塞換成無菌橡膠塞。46 冰箱保藏a:13個月移植一次，繼續(xù)保藏。b:用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，可保藏半年至一年。瓊脂斜面低溫保藏法n 適用細菌、霉菌、酵母菌及放線菌保藏n 優(yōu)點：簡便、大多數(shù)微生物適用n 缺點：保藏期短；傳代次數(shù)多；容易發(fā)生變異及污染。n 生孢梭菌用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、乙型溶血性鏈球菌及肺炎球菌用血肉湯（瓊脂）培養(yǎng)基液體石蠟保藏法 一般步驟為：準備液體石蠟并滅菌去水備用。獲得需要保藏菌種的純培養(yǎng)，將液體石蠟注入培養(yǎng)容器中，并完全覆蓋培養(yǎng)基。 液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基上端0.51cm為宜 46

16、 冰箱保藏液體石蠟保藏法甘油冷凍保藏法n 將保藏菌種接種瓊脂斜面上，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時間，用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使菌種充分擴散到無菌水中，調證菌液濃度，向已制備好的菌懸液加入等體積的20無菌甘油，輕輕振試管管，使內容物充分混合，分裝于無菌小管。甘油冷凍管最好在-30 貯存。沙管保藏法n 制備沙管n 培養(yǎng)接種n 制備菌懸液n 混菌n 干燥n 保藏n 適合保藏芽孢桿菌、梭菌、放線菌和一些絲狀真菌。 土壤保藏法n 用土壤替代沙管保藏法中的河沙，其余操作與沙管保藏法相同n 適合保藏土壤細菌、放線菌和絲狀真菌，時間為26年。 硅膠保藏法n 用硅膠替代沙管保藏法中的

17、河沙，其余操作與沙管保藏法相同n 適合保藏酵母菌和某些絲狀真菌 濾紙保藏法n 保藏微生物細胞或孢子的載體為濾紙。n 對細菌、酵母菌、絲狀真菌等都有一定的效果，有些菌種最長可達17年 。 明膠片保藏法n 制備無菌營養(yǎng)明膠n 制備無菌石蠟濾紙n 微生物培養(yǎng)并制成濃厚的懸液n 在懸液中加入營養(yǎng)明膠n 將含微生物細胞或孢子的營養(yǎng)明膠滴于石蠟濾紙表面n 干燥n 將形成的明膠片密封保藏麩皮保藏法n 我國歷史悠久的微生物保藏法n 適于保藏根霉、曲霉、青霉、紅曲霉等屬和赤霉菌 梭氏真空干燥保藏法n 在小試管中放置菌懸液n 小試管在大試管中放置n 大試管在真空狀態(tài)下干燥n 密封大試管液體直接干燥保藏法n 需要加

18、入保護劑n 干燥之前不需凍結n 在干燥過程中為增大蒸發(fā)面積，可加入多孔材料n 干燥后的容器應熔封蒸餾水保藏法n 最為簡便的微生物保藏法n 微生物細胞或孢子保藏在蒸餾水中n 保藏的容器應密封n 適于保藏棒狀桿菌、土壤桿菌和假單孢菌等 液氮冰箱超低溫保藏法n 需專用設備液氮超低溫冰箱n 菌懸液密封于安瓿管內，控速凍結n 國外已普遍采用n 保藏時間長凍結真空干燥保藏法n 歷史悠久，又稱凍干法n 不產生孢子只產生菌絲體的絲狀真菌不宜采用該法n 適用面廣n 保藏時間可達10年以上n 多為菌種保藏機構采用凍結真空干燥保藏法n 密封性好，可避免保藏期間的污染n 保藏容器體積小，方便攜帶和貯藏n 保藏時間更長

19、，變異概率更低普通微生物實驗室適用的保藏技術n 瓊脂斜面低溫保藏法n 液體石蠟保藏法n 低溫冷凍保藏法n 甘油冷凍保藏法瓊脂斜面低溫保藏法n 細菌置46保藏，芽孢桿菌每36個月移植一次，其他細菌每月移植一次。 n 放線菌于46保藏，每3個月移植一次。 n 酵母菌于46保藏，每46個月移植一次。 n 絲狀真菌于46保藏，每4個月移植一次。 n 擔子菌于46保藏，每3個月移植一次。n 保藏的濕度通常在5070為宜。 菌種保藏的一般規(guī)定1、菌種“代”的確定：2005版藥典規(guī)定，以干燥菌種管為第“0”代，由此得到的第一批子代為第一代，以此類推。2、菌種傳代次數(shù)規(guī)定：2005版藥典規(guī)定不超過5代。3、菌

20、種應專人保藏、專柜貯藏，認真做好登記，統(tǒng)一編號，按期傳代，并做好有關檢驗記錄。4、保存菌種傳代或凍干均應填寫專用記錄，菌種管上應有標簽，表明菌種編號、代次、批號、日期。5、過期菌種應及時處理、登記，經121 30分鐘滅菌消毒。實驗室菌種傳代操作步驟n 1、接種前用1：1000新潔爾滅擦拭工作臺面，然后開紫外燈消毒30分鐘。n 2、自冰箱取出保存工作用菌種，室溫放置20分鐘；溫度平衡后才能傳代。n 3、實驗人員進入緩沖間，換鞋、穿無菌衣、戴口罩，用1：1000新潔爾滅溶液消毒雙手，并將培養(yǎng)基及菌種移入陽性菌接種室。n 4、點燃酒精燈，將菌種管塞子，通過火焰轉動使稍稍松動，以免接種時粘著打不開。n

21、 5、接種操作：左手拿住菌種管，將管口靠近火焰旁，右手拿接種棒，將白金耳燒紅約30秒，桿部通過火焰滅菌。挑取少量菌苔；另取，照上述方法在火焰旁打開塞子，將白金耳伸入管內斜面培養(yǎng)基的底部，從下到上將白金耳輕貼斜面培養(yǎng)基的表面作曲折移動。n 5、接種后，將斜面置規(guī)定溫度、時間培養(yǎng)。取出觀察，菌種生長良好，換橡皮塞，貼上標簽，放入冰箱保存。n 6、細菌一個月傳代一次，枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉可三個月傳代一次。菌種管理n 1、標準菌種必須從認可的菌種收集途經獲得；實驗室必須建立和保存所有菌種的收集、貯藏、保存、確認試驗的記錄。n 2、實驗室應有文件管理標準菌種（從原始菌

22、種到工作用菌種）。該程序應包括：a:標準菌種必須定期傳代，并做確認試驗，包括實驗室在所需要關鍵診斷指標，實驗室必須記錄并保存。b：每一子菌種都應以適當標簽、標記來表示名稱、標準號、接種日期和傳代日期。C:每一子菌種都應以標記從原始菌種傳代到工作用菌種的代數(shù)；記錄菌種生長的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件；菌種生存條件等。過期菌種處理n 過期菌種應及時清理、登記，并經121 、30分鐘高壓消毒滅菌。例1：金黃色葡萄球菌傳代保藏技術n 1、購置金黃色葡萄球菌（如我所提供的菌種為第二代菌種），假定購置日期為5月21日。n 2、準備10支營養(yǎng)瓊脂斜面，其中2支用于保藏，其余8支用于當月實驗。n 3、于5月22日打開菌

23、種管，接種菌種至上述10支斜面，35 培養(yǎng)1618小時。n 4、將10支第三代菌種管做好標簽，置適宜溫度保藏。n 5、5月22日至6月22日，可以使用上述第三代菌種管。n 6、至6月22日，重復步驟2，得第四代菌種管。n 7、至8月22日前，重新購置原種管。例2：黑曲霉的傳代技術n 1、制備孢子懸液：取滅菌水或生理鹽水35ml，分23次小心滴加至菌種管內（試管斜面），反復振搖。傾取孢子懸液置另一滅菌試管。n 2、涂布接種：用滅菌滴管吸取懸液滴加至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面，每管滴加23滴，轉動試管，使懸液與斜面表面充分接觸菌種確認試驗n 包括以下幾個方面：1、菌落生長情況：目測2、染色鏡檢：3、生

24、化試驗；(1)糖醇代謝試驗 （2）氨基酸和蛋白質代謝試驗 （3）碳源和氮源利用試驗 （4）酶類試驗 （5）其他試驗短小芽孢桿菌確認該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過顯微鑒別，為不呈鏈狀排列的桿菌，革蘭氏染色為陽性。2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔光滑，薄，閃光，蔓延，不粘著，常常是淺黃色。 3、生化試驗可選做明膠穿刺、淀粉水解和硝酸鹽還原 ，結果為明膠緩慢液化，淀粉水解陰性，硝酸鹽還原陰性。枯草芽孢桿菌確認該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過顯微鑒別，為呈鏈狀排列的桿菌，不形成莢膜，革蘭氏染色為陽性。2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔生長豐厚，粗糙，不透明，不閃光，蠟質，蔓延，奶油色至微褐色。 3、生化試驗可選做

25、明膠穿刺、淀粉水解和硝酸鹽還原，結果明膠呈漏斗形至層狀液化，淀粉水解陽性，硝酸鹽還原陽性。大腸埃希菌確認該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過顯微鑒別，為成對和呈短鏈排列的近球形的桿菌，一般不形成莢膜，革蘭氏染色為陰性。2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔通常白色，有時帶黃白色，濕潤，閃光，蔓延生長。 3、生化試驗可選做明膠穿刺和靛基質試驗、甲基紅試驗、V.P.試驗和檸檬酸鹽利用試驗，結果不液化明膠，靛基質試驗和甲基紅試驗陽性，V.P.和檸檬酸鹽利用試驗陰性。大腸埃希菌 該菌為微生物限度檢查規(guī)定不得檢出的控制菌，有一整套完整的鑒定手段，也可參考該方法用于判斷所保藏的菌種有無發(fā)生變異。 該鑒定方法主要內容即為經典的IMViC試驗，結果為+-。銅綠假單孢菌確認該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過顯微鑒別，為單個，成對或呈短鏈排列的桿菌，有運動性，革蘭氏染色為陰性。2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔生長旺盛，薄，白色，閃光，培養(yǎng)基變?yōu)榫G色至暗褐色或黑色，發(fā)熒光。 3、生化試驗可選做明膠穿刺、吲哚和硝酸鹽還原試驗，結果迅速液化明膠，液體呈淺黃綠色或淺藍綠色，吲哚試驗陰性，硝酸鹽還原試驗陽性。