流式細(xì)胞術(shù)描述

1、會(huì)計(jì)學(xué)1流式細(xì)胞術(shù)描述流式細(xì)胞術(shù)描述基本概念第一節(jié) 流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)與原理第二節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)分析第三節(jié) 流式細(xì)胞儀分析的技術(shù)要求第四節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用 一、流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)與功能 二、流式細(xì)胞術(shù)的重要術(shù)語 三、流式細(xì)胞術(shù)基本原理 四、流式細(xì)胞術(shù)的樣本設(shè)置第一節(jié) 流式細(xì)胞儀基本結(jié)構(gòu)與原理 將目的細(xì)胞群圈定（即設(shè)門），然后將門內(nèi)細(xì)胞以FSC或SSC為橫坐標(biāo)，熒光信號(hào)為縱坐標(biāo)的散點(diǎn)分布圖表示出來，此圖中細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)在與其FSC或SSC相應(yīng)的位置，并只可能表現(xiàn)兩種情況：熒光信號(hào)弱或無、熒光信號(hào)強(qiáng)或有。 調(diào)節(jié)電壓可改變目的細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，那么如何判斷特異性熒光信號(hào)的有無？ 需要設(shè)置陰性對(duì)照

2、以確定細(xì)胞自身基礎(chǔ)熒光域值，并通過它來判斷待測樣本中是否有特異性熒光信號(hào)。 首先通過調(diào)節(jié)電壓將陰性對(duì)照細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值調(diào)至陰性致信區(qū)內(nèi)，然后對(duì)陰性置信區(qū)進(jìn)行界定，大于陰性置信區(qū)的熒光信號(hào)為特異性熒光信號(hào)。 對(duì)于流式樣本來說，設(shè)置陰性對(duì)照是必須的，且陰性置信區(qū)一旦設(shè)定，將作為后續(xù)樣本的陰、陽性判斷的基礎(chǔ)，不能隨意變動(dòng)。1. 分選速度：幾千個(gè)細(xì)胞/秒2. 分選純度: 99.5%左右 分離后的樣品中該亞群細(xì)胞所占的百分比。3. 分選收獲率: 90-95% 分離后所得的細(xì)胞亞群數(shù)占原細(xì)胞樣品中該亞群細(xì)胞數(shù)的百分比。前向散射光 (forward scatter)： FSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小相關(guān)側(cè)向

3、散射光（side scatter)： SSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少相關(guān) 利用前向角和測向角散射光可以把外周血白細(xì)胞分成三群，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。散射光的測定 利用電子技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號(hào)加以扣除的技術(shù)稱“熒光補(bǔ)償”PMTPMTPMTPMT二分鏡帶通濾光片激光1234Flow cell 由若干組透鏡、濾光片和分光鏡等光學(xué)元件組成，它們分別將不同波長的光信號(hào)送入到不同的探測器。濾光片主要分為四類：長通濾光片（LP）、短通濾光片（SP）、帶通濾光片（BP）和二分鏡光學(xué)系統(tǒng) 以分布直方圖( distribution histogram )來顯示，橫軸為該參數(shù)測量

4、強(qiáng)度相對(duì)值，單位是道數(shù)。強(qiáng)度分布可以是線性的，也可以是對(duì)數(shù)的?？v軸一般是細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞出現(xiàn)的頻數(shù)。1.單參數(shù)直方圖看圖技巧：1.先看橫、縱坐標(biāo)，了解檢測目的；2.看圖形分布，直方圖峰形越往右移，代表其熒光強(qiáng)度越強(qiáng)；3.M1的確定是根據(jù)陰性對(duì)照細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值設(shè)定的，峰形右移，熒光信號(hào)大于基礎(chǔ)熒光域值（M1），表示陽性（M2）；4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)，檢測目的物一般用各Marker區(qū)內(nèi)的細(xì)胞所占百分比或用平均熒光強(qiáng)度表示；5.幾個(gè)直方圖的比較，關(guān)鍵看Marker（M1、M2）的位置以及細(xì)胞數(shù)。 能夠顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系，橫、縱坐標(biāo)分別代表兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)，平面上每一個(gè)點(diǎn)表示具有相應(yīng)坐標(biāo)值的

5、細(xì)胞。 用等高線來表示細(xì)胞數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞數(shù)相同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。3.二維等高線圖 縱軸與橫軸分別代表被測細(xì)胞的兩個(gè)測量參數(shù),Z軸為細(xì)胞數(shù)。4 .假三維圖5.三維圖 任意選三個(gè)參數(shù)為x，y，z軸，構(gòu)成一個(gè)三維圖，每一群細(xì)胞根據(jù)各自參數(shù)處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的空間，三維圖對(duì)比較復(fù)雜的亞群的顯示更為直觀明了。 一、樣品制備：單細(xì)胞懸液 二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色 三、質(zhì)量控制第三節(jié) 流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求一、樣品制備流式細(xì)胞儀的樣品要求： 單細(xì)胞懸液，避免任何細(xì)胞沉積 被檢細(xì)胞或顆粒大小0.240um 樣品中至少20000個(gè)細(xì)胞，濃度105-106個(gè)/毫升（一）外周血淋

6、巴細(xì)胞樣品的制備 利用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，得到外周血中所有白細(xì)胞的流式細(xì)胞分析的二維散點(diǎn)圖 單層培養(yǎng)細(xì)胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來，然后離心漂洗。 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，可不用酶消化，直接吹打制備成單細(xì)胞懸液。（二) 培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備 機(jī)械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法。 酶處理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。 化學(xué)試劑處理法：EDTA、EGTA等。 表面活性劑處理法： Triton-100、皂素等。(三)新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備 機(jī)械法往往常成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而結(jié)果卻是較低的細(xì)胞產(chǎn)量。 如用低速離心去碎片，用尼龍網(wǎng)過濾團(tuán)塊等，也可利用電子學(xué)技術(shù)處理的方法排除團(tuán)塊和

7、碎片的干擾。 酶學(xué)法、化學(xué)法對(duì)實(shí)體組織的分散效果較理想，但會(huì)造成所測化學(xué)成份的不良影響。FCM所測細(xì)胞是單個(gè)分散狀態(tài)；對(duì)細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞碎片盡可能少；細(xì)胞的活性不受損害，以保證下一步的熒光染色處理不受影響。 防止細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞膜原有的特性保存的方法：1、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。2、乙醇與甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。3、甲醛或多聚甲醛固定法：細(xì)胞不具有生物活性，但 細(xì)胞表面熒光染色分析不受影響。(四）單細(xì)胞懸液的保存 染料的選擇和標(biāo)記染色保證了熒光信號(hào)的產(chǎn)生（一）免疫熒光標(biāo)記最常用的熒光染料熒光染料 激發(fā)波長（nm) 發(fā)射波長（nm) 顏色FITC 488 525 深藍(lán)

8、色PE(RDI) 488 575 橙色ECD 488 620 橙紅色PeCy-5 488 670 紅色PeCy-7 488 755 深紅色PI 488 620 橙紅色APC 633 670 紅色二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在488nm波長激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生的熒光信號(hào)。LaserCY5PECY5CY5488nm能量傳遞染料：熒光染料與細(xì)胞成分的結(jié)合方式： 結(jié)構(gòu)親和方式 嵌入結(jié)合方式 共價(jià)結(jié)合方式 熒光抗體特異性結(jié)合方式1、直接免疫熒光染色2、間接免疫熒光染色（二）免疫熒光標(biāo)記3、雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)記FIT

9、C+PE 488 525 、575 綠色、橙色FITC+T red 488 525 綠色 568 615 紅色FITC+PeCy5 488 525、 675 綠色、 紅色FITC+ ECD 488 525、 625 綠色、橙紅色F+P +PeCy5 488 525、575、675 綠、橙、紅色F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 綠、 橙紅色、紅色F+P+APC 488 525 、 575 綠色、橙色 633 670 紅色熒光染料 激發(fā)波長（nm) 發(fā)射波長（nm) 顏色（一）單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)量控制（二）細(xì)胞懸液免疫熒光染色的質(zhì)量控制 1、溫度對(duì)熒光染色的影響 2、pH對(duì)熒光發(fā)射強(qiáng)度的影響 3、熒光染料濃度的控制 4、固定劑對(duì)熒光染色的影響（三）儀器操作技術(shù)的質(zhì)量控制三、質(zhì)量控制 1、同型對(duì)照：選用相同源性的未標(biāo)記單抗作為同型對(duì)照（陰性對(duì)照） 2、全程質(zhì)控：在流式檢測中，樣品標(biāo)記、溶血、洗滌、儀器質(zhì)量控制和上機(jī)檢測的過程都會(huì)直接影響檢測結(jié)果。采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品來進(jìn)行全程質(zhì)控，使得同類實(shí)驗(yàn)室建立質(zhì)控比對(duì)，數(shù)據(jù)可