細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

1、第二章 細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、光學(xué)顯微鏡（一）普通光學(xué)顯微鏡（略）（二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。功用：用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描；能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)；分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍；能掃描不同層次，形成立體圖像。（三）激光共聚焦掃描顯微境1、特點(diǎn):高分辨率（0.18µm）、高靈敏度、高放大倍數(shù) 2、在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（主要） （1） 細(xì)胞、組織的三維重建 （2）對活細(xì)胞進(jìn)行無損傷的適時觀察分析（各種細(xì)胞器、核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)） （3） 細(xì)胞內(nèi)鈣離子、pH值和其他離子動態(tài)分析 （四

2、）暗視野顯微鏡 dark field microscope聚光鏡中央有擋光片，視野背景是黑的，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，物體邊緣是亮的。可觀察 4200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。（五）微分干涉差顯微鏡 （DIC）1952年Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。（九）當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢采用組合方式，集普通光鏡、相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體；自動化與電子化。二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍；用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小

3、于0.2µm）。（1）超薄切片超薄切片厚度僅50nm左右，用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。（2）負(fù)染技術(shù)用重金屬鹽(如磷鎢酸) 染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。（ 3）冰凍蝕刻 freeze-etching亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴涂一層蒸汽鉑和碳。然后將組織溶掉，把鉑和碳的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜。斷面的三種處

4、理方法：蝕刻（ etching ）、不蝕刻（no etching ）、深度蝕刻（deep etching ）（二）掃描電子顯微鏡主要用于觀察樣品（細(xì)胞）的表面形貌（三）掃描隧道顯微鏡分辨率：橫向?yàn)?.10.2nm，縱向可達(dá)0.01nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。三、顯微操作技術(shù)是在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。第二節(jié) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整的條件下，通過化學(xué)反應(yīng)對細(xì)胞內(nèi)各種成分進(jìn)行定性、定位和定量的研究，以及了解這些成分在細(xì)胞活動過程中的動態(tài)變化

5、的技術(shù)。 原理：利用某些化學(xué)物質(zhì)可與細(xì)胞內(nèi)某種成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，而在局部范圍內(nèi)形成有色沉淀或電子密度高的物質(zhì)。 可對蛋白質(zhì)（酶）、核酸、碳水化合物等進(jìn)行定性、定位、定量研究。 二、熒光細(xì)胞化學(xué)與免疫熒光熒光細(xì)胞化學(xué)：自發(fā)或激發(fā)熒光免疫熒光：利用抗體同特定抗原專一結(jié)合的原理，對抗原進(jìn)行定位測定的技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。 免疫熒光法：如異硫氰酸熒光素、羅丹明等。 酶標(biāo)免疫法：如辣根過氧化物酶。三、放射自顯影術(shù)用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，

6、經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。 一般用14C和3H標(biāo)記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。四、分子雜交技術(shù)具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。（一）原位雜交（in situ hybridization）。用于檢測染色體上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。（二）Southern雜交是體外

7、分析特異DNA序列的方法，操作時先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。五、PCR技術(shù)1983 Kary Mullis 發(fā)明1985 開始有文章發(fā)表1993 獲諾貝爾獎廣泛用于分子生物學(xué)研究領(lǐng)域PCR技術(shù)的原理PCR即：polymerase chain reaction。反應(yīng)體系：樣品DNA；引物（primer），約15-20個核苷酸；4種dNTP；Tag DNA聚合酶，來自于嗜熱水生菌Thermus aquat

8、icus，最適作用溫度7580，短時間在95下不失活。緩沖體系和Mg2+。反應(yīng)過程：變性：約90-95；復(fù)性：約60左右；延伸：70-75；重復(fù) “變性-復(fù)性-延伸” 過程20-30次循環(huán)。影響PCR的因素1.DNA模板純度：蛋白、多糖、酚類等抑制PCR反應(yīng)完整性：模板降解會導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無產(chǎn)物濃度：濃度適當(dāng)2.引物特異性：長度適當(dāng)、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體完整性：避免反復(fù)凍融濃度：過高導(dǎo)致非特異性增加；過低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少3.反應(yīng)Buffer4.Mg 2濃度: 過高非特異性嚴(yán)重;過低無擴(kuò)增產(chǎn)物5. dNTP Mixture: 濃度適當(dāng)，避免反復(fù)凍融6. ddH2O: pH值適當(dāng)，避免污染7. DN

9、ATaq聚合酶、反應(yīng)條件和其它因素的影響第三節(jié) 細(xì)胞分離技術(shù)一、離心技術(shù)是分離細(xì)胞器及各種大分子基本手段。轉(zhuǎn)速1025kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kg者稱為超速離心機(jī)。超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min，離心力超過500kg。（一）差速離心 Differential centrifugation特點(diǎn)：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級離心。用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體?？蓪⒓?xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。 （二）密度梯度離心用途：對單個細(xì)

10、胞進(jìn)行快速定量分析與分選。原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞儀（flow cytometer）。用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分離。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高；2）PH中性或易調(diào)為中性；3）濃度大時

11、滲透壓不大；4）對細(xì)胞無毒。二、流式細(xì)胞術(shù)用途：對單個細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選。原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞儀（flow cytometer）。三、細(xì)胞電泳原理：在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動。各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同 。用途：檢測細(xì)胞生理狀態(tài)、分離不

12、同種類的細(xì)胞。四、激光捕獲顯微切割技術(shù)：準(zhǔn)確分離組織切片中的單個細(xì)胞，進(jìn)行分子生物學(xué)分析 應(yīng)用：如癌組織和癌旁組織的分離第四節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交一、細(xì)胞培養(yǎng)群體培養(yǎng)（mass culture）：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層；克隆培養(yǎng)（clonal culture）：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長，每一個細(xì)胞形成一個細(xì)胞集落，稱為克隆。原代培養(yǎng) （primary culture）：即：培養(yǎng)來自動物機(jī)體的細(xì)胞群。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的容器中培養(yǎng)稱為傳代或傳代培養(yǎng)（passage culture ），每代細(xì)胞分裂約3-6次。細(xì)胞系（cell line）：能無限傳代的細(xì)胞。細(xì)胞株（cell strain）：從培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。 克隆（clone）：亦稱無性系。指由同一個祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。實(shí)驗(yàn)室中常用的幾種細(xì)胞系二、細(xì)胞融合通過培養(yǎng)和介導(dǎo)，兩個或多個細(xì)胞合并成一個雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合（cell fusion）或細(xì)胞雜交。同核體：相同基因型的細(xì)胞融合而成。異核體：不同基因型的細(xì)胞融合而成。自發(fā)融合：同種