突變生物合成在微生物藥物領(lǐng)域的研究進(jìn)展

1、突變生物合成在微生物藥物領(lǐng)域的研究進(jìn)展 【摘要】突變生物合成作為產(chǎn)生抗生素衍生物的重要手段，自20世紀(jì)70年代興起以來(lái)，發(fā)揮了巨大作用，已開(kāi)發(fā)出許多至今在臨床上仍廣泛使用的抗生素品種。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，突變生物合成技術(shù)可直接對(duì)次級(jí)代謝途徑中一特定酶基因進(jìn)行改造獲得突變株，大大提高了工作效率和準(zhǔn)確性。本文綜述了突變生物合成技術(shù)在微生物藥物領(lǐng)域的應(yīng)用，特別是結(jié)合基因技術(shù)進(jìn)行突變生物合成研究的新進(jìn)展。【關(guān)鍵詞】 微生物藥物Review on mutational biosynthesis in microbial medicinal fields ABSTRACT Mutational biosy

2、nthesis since its rising in1970s，as a tool for the formation of antibiotic structural analogues，has played an important role and developed some novel derivatives which are still widely used in the clinic today.With the advance of gene engineering，mutants can be obtained by direct gene modifi-cation

3、to certain enzyme in secondary metabolism pathway and efficiency is greatly promoted.In this paper，the progress，especially combining gene engineering of mutational biosynthesis is reviewed. KEY WORDS Mutational biosynthesis（MBS）; Mutasynthon; Blocked mutant; Antibiotics 新疾病的產(chǎn)生和耐藥菌的出現(xiàn)，迫切呼喚新的生物活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)

4、。人們主要從三個(gè)途徑獲得新的活性物質(zhì):自然界;化學(xué)合成以及化學(xué)改造;對(duì)產(chǎn)生菌的次級(jí)代謝途徑進(jìn)行改造，使其合成途徑發(fā)生改變，以獲得新化合物，主要包括突變生物合成（muta-tional biosynthesis，MBS）和前體定向生物合成（pre-cursor directed biosynthesis，PDB）。盡管前兩種方式在新藥開(kāi)發(fā)過(guò)程中仍然占主導(dǎo)地位，但后者特別是MBS也為一種十分有效的途徑，且顯示出巨大的潛力。 MBS是指抗生素產(chǎn)生菌經(jīng)過(guò)物理、化學(xué)等誘變因素的作用或通過(guò)基因改造，生物合成途徑中的某一位點(diǎn)發(fā)生突變，喪失合成完整抗生素分子的能力而成為阻斷突變株。在發(fā)酵培養(yǎng)這種阻斷突變株時(shí)，

5、添加某種天然的或化學(xué)合成的化合物突變合成元（muta- synthon）參與生物合成并獲得新抗生素的方法和過(guò)程。廣義的MBS還包括利用生物合成途徑改變獲得原抗生素的代謝產(chǎn)物和利用阻斷突變株積累一些原始菌株所不能積累的抗生素中間體。 1969年，Shier用MBS方法對(duì)新霉素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。1975年，Nagaoka等用“idiotroph”獨(dú)需型（特需型）來(lái)描繪那些需要加入外源前體完成新衍生物合成的突變株，并用“mutational biosynthesis”突變生物合成來(lái)描繪這種技術(shù)。1977年Rinehart將這種技術(shù)定義為“mutasysthesis”。按照Rinehart的解釋，利用MB

6、S技術(shù)制備新衍生物應(yīng)包括:突變株的獲得;突變合成元的獲得;添加的突變合成元被細(xì)胞吸收并參與新衍生物合成。此外，后續(xù)工作還應(yīng)包括新衍生物的分離和結(jié)構(gòu)鑒定，以及生物活性評(píng)價(jià)。 本文按結(jié)構(gòu)類(lèi)別介紹MBS技術(shù)在微生物藥物領(lǐng)域的研究應(yīng)用，特別是近年來(lái)結(jié)合基因技術(shù)進(jìn)行MBS研究的新進(jìn)展。1 突變生物合成在氨基糖苷類(lèi)抗生素中的應(yīng)用15氨基糖苷類(lèi)抗生素是臨床上重要的抗感染藥物，但存在一定程度的腎、耳毒性。因此，對(duì)已有品種進(jìn)行改造，開(kāi)發(fā)對(duì)耐藥菌有效、腎（耳）毒性相對(duì)較小的新品種一直是新藥研究人員追尋的目標(biāo)。20世紀(jì)70年代，人們利用MBS技術(shù)對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素進(jìn)行改造，獲得成功，特別是涉及2-脫氧鏈霉胺（2-d

7、eoxystrepta-mine，DOS）獨(dú)需型阻斷突變株的研究。如Rosi等通過(guò)誘變獲得慶大霉素產(chǎn)生菌絳紅色小單孢菌（Micromo-nospora purpurea）D-突變株后，添加鏈霉胺，生成2-羥基-慶大霉素，該化合物對(duì)含有2”-腺苷腺化酶的慶大霉素耐藥菌有較強(qiáng)活性，毒性低，在臨床上被廣泛使用。這方面的研究Rinehart等曾進(jìn)行過(guò)總結(jié)，本文不做詳細(xì)敘述。 值得提出的是，20世紀(jì)80年代趙敏等通過(guò)誘變獲得a位點(diǎn)（Fig.1）阻斷的突變株JIM-401，該突變株代謝產(chǎn)物中慶大霉素C 2b （GM C2b ）組分即小諾米星的產(chǎn)量大大提高，并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn);再以JIM-401為出發(fā)菌株，獲

8、得c位點(diǎn)阻斷的突變株JIM-202，該突變株的代謝產(chǎn)物中慶大霉素C1a （GM C 1a ）的積累量大大增加（含量在85%以上），在其2-脫氧鏈霉胺1-N位引入一個(gè)乙基，經(jīng)半合成獲得新化合物1-N-乙基慶大霉素C1a （etimicin，依替米星）;再以JIM-202為出發(fā)菌 株，獲得b位點(diǎn)阻斷的突變株JIM121，其代謝產(chǎn)物中 西索米星（sisomicin）組分的產(chǎn)量大大增加。 目前，丁酰苷菌素、卡那霉素、慶大霉素、妥布霉素、新霉素、鏈霉素等氨基糖苷類(lèi)抗生素的生物合成基因簇的研究取得了可喜的成就，這為利用MBS方法結(jié)合現(xiàn)代基因技術(shù)對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素進(jìn)行改造提供了有利條件。 2 核苷類(lèi)抗生素的

9、MBS研究6，7 Nikkomycin是唐德鏈霉菌（Streptomyces tendae）Tü901產(chǎn)生的一種核苷肽類(lèi)抗生素，與幾丁質(zhì)合成酶底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺有類(lèi)似結(jié)構(gòu)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制幾丁質(zhì)合成酶，干擾真菌細(xì)胞壁的合成，是一種低毒的抗真菌及殺蟲(chóng)劑。 尿嘧啶和4-甲?；?4-咪唑啉-2-酮是nikkomycin生物合成途徑中的兩個(gè)中間體，分別對(duì)應(yīng)Z和X組分。1984年，Delzer等通過(guò)誘變獲得pyr - 突變株。該突變株不能合成以尿嘧啶為中間體的nikkomycin。添加23種N-雜環(huán)化合物進(jìn)行MBS研究，其中胸腺嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶和5-氟尿嘧啶可被利用合成新的衍生物。

10、1999年，Bormann等采用基因工程方法進(jìn)行MBS的研究，構(gòu)建了L-賴氨酸-2-氨基轉(zhuǎn)移酶失活突變株S.tendae nikC，該突變株不能合成nikkomycin I，J，X，Z肽基側(cè)鏈的前體哌啶-2-羧酸，積累了nikkomycin的核苷成分。當(dāng)添加吡啶甲酸時(shí)，可恢復(fù)產(chǎn)生nikkomycin I，J，X，Z;添加苯甲酸，獲得Bx和Bz組分（如Fig.2所示）。Bx和Bz比X，Z有較高的pH穩(wěn)定性，Bx對(duì)白念珠菌有更高的抑菌活性。 此外，Bormann等還構(gòu)建了產(chǎn)nikkomycin LX 和L 的突變株，獲得的新衍生物也顯示出很好的抗菌活性。目前，nikkomycin產(chǎn)生菌分子生物學(xué)特

11、性的研究已經(jīng)取得了巨大的成就，通過(guò)MBS技術(shù)并結(jié)合基因手段，相信會(huì)有更多更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品出現(xiàn)。3 Clorobiocin的MBS研究8，9 Clorobiocin、新生霉素（novobiocin）和coumer-mycin（香豆霉素）是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類(lèi)具有抑制 DNA旋轉(zhuǎn)酶活性的抗生素，同屬于氨基香豆素家族， Fig.2 MBS of nikkomycin 能夠與細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶B亞基緊密結(jié)合，有效抑制該酶活性，實(shí)現(xiàn)抗菌作用。對(duì)氨基香豆素類(lèi)抗生素的研究主要集中在clorobiocin和新生霉素，兩者的結(jié)構(gòu)如Fig.3所示，包括三個(gè)部分:ring A，3-異戊烯基-4-羥基-苯甲酰（3-preny

12、l-4-hydroxybenzoyl，DMAHB）;ring B，3-氨基-4，7-二羥基香豆素（3-amino-4，7-dihy-droxycoumarin，ADHC）;ring C，諾維糖（L-noviose）。2004年Galm等通過(guò)基因手段構(gòu)建了clorobiocin產(chǎn)生菌異戊烯基轉(zhuǎn)移酶失活突變株cloQ - 。該突變株不能合成DMAHB前體。添加DMAHB類(lèi)似物（如Fig.4所示）獲得了28種clorobiocin衍生物。體外活性研究發(fā)現(xiàn)，新衍生物對(duì)大腸埃希菌DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制活性是新生霉素的50%200%，但即使是活性最高的衍生物，其活性僅為clorobiocin的50%;對(duì)枯草芽孢

13、桿菌ATCC14893的生長(zhǎng)抑制活性比新生霉素和clorobiocin都低;大部分新衍生物對(duì)葡萄球菌均有效。4 糖肽類(lèi)抗生素的MBS研究活性與萬(wàn)古霉素相當(dāng)，但對(duì)厭氧菌尤其是梭狀芽孢桿菌的抑制活性要高得多。因此，balhimycin具有很好的臨床價(jià)值。 目前，對(duì)balhimycin等糖肽類(lèi)抗生素的結(jié)構(gòu)改造研究主要集中在非蛋白組成氨基酸，如-羥基酪氨酸（Hty）、3，5-二羥基苯基甘氨酸（Dpg）和4-羥基苯基甘氨酸（Hpg）等。 2002年，Pek等第一次用MBS技術(shù)對(duì)balhimycin進(jìn)行研究（Fig.6a），刪除過(guò)氧化氫酶基因bhp的一段序列，獲得Hty合成阻斷突變株。添加Hty，修復(fù)ba

14、l-himycin生產(chǎn)能力;添加外消旋3-氟-羥基酪氨酸合成了fluorobalhimycin;添加2-氟，3，5-二氟-羥基酪氨酸也合成了相應(yīng)的fluorobalhimycins;D/L-酪氨酸以及酪氨酸酚羥基被氟取代或位置改變的類(lèi)似物，未能摻入到新衍生物的合成，說(shuō)明酚羥基的重要性?；钚匝芯勘砻?，所有的氟化balhimycin衍生物對(duì)枯草芽孢桿菌都有抑制活性。 2004年，Weist等刪除Dpg編碼基因dpgA的一段序列，獲得Dpg合成阻斷突變株。添加Dpg，修復(fù)balhimycin生產(chǎn)能力;添加4種單、雙取代羥基、甲氧基的Dpg類(lèi)似物（Fig.6b）均獲得了新衍生物;通過(guò)添加實(shí)驗(yàn)，Weis

15、t等共獲得20多種糖基化方式不同的衍生物。有趣的是，添加3-單取代-苯基甘氨酸，合成的新衍生物有一部分在7位Dpg和5位Hpg間缺少正常balhimycin的AB-環(huán)聯(lián)芳鍵。 CDA CDA（calcium-dependent antibiotic）是由天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）A3產(chǎn)生的酸性脂肽類(lèi)抗生素，其結(jié)構(gòu)與達(dá)托霉素（daptomycin）類(lèi)似，分子中有許多D-氨基酸和非蛋白組成氨基酸，與免疫抑制劑環(huán)孢菌素、抗腫瘤藥物博來(lái)霉素和抗菌藥物萬(wàn)古霉素同屬于非核糖體合成肽（nonribosomal peptides）家族。CDA的結(jié)構(gòu)如Fig.7所示，根據(jù)R

16、6 、R 9 、R10 和R 11 上取代基的不同，分為CD A 1b 、CD A 2b 、CD A 3b 、CD A4b 、CD A 2a 、CD A 4a 等組分。英國(guó)曼徹斯特理工 大學(xué)（UMIST）和Sanger研究所對(duì)CDA基因簇結(jié)構(gòu)研究結(jié)果顯示，82Kb的基因簇序列包含了至少40個(gè)開(kāi)放閱讀框（SCO3210-SCO3249），并利用分子手段結(jié)合現(xiàn)代分離檢測(cè)技術(shù)對(duì)各閱讀框的功能和CDA的生物合成途徑進(jìn)行了研究和推理。 2002年，Hojati等利用分子生物學(xué)手段獲得4-羥基-苯乙醇酸合成酶基因hmaS（SCO3229）被破壞的突變株，該突變株不能合成CDA分子重要的結(jié)構(gòu)單元4-羥基-苯

17、基甘氨酸（Hpg）。添加外消旋4-羥基-苯乙醇酸或4-羥基-苯乙醛酸或L-Hpg可恢復(fù)CDA的生產(chǎn)能力;添加苯乙醇酸、苯乙醛酸、苯酰甘氨酸類(lèi)似物（脫羥基或羥基被鹵元素取代），獲得了芳香側(cè)鏈4位羥基被H取代的衍生物CDA 2d 和被F取代的 R6 R 9 R10 R11 CAD1b OH OPO3 H2 H H-H CAD 2a OH OPO3 H2 CH 3 -bond CAD2b OH OPO 3 H2 CH3 H-H CAD3a OH OH H -bond CAD3b OH OH H H-H CAD 4a OH OH CH 3 -bond CAD4b OH OH CH3 H-H CAD2d

18、 H OPO3 H2 CH3 H-H CAD1ta F OPO 3 H 2 CH 3 -bond CDA 2td F OPO3 H 2 CH3 H-H Fig.7 Structure of CDA analoguesCDA 2fd ;而添加4-氯苯乙醛酸以及含對(duì)氯和對(duì)甲氧基的類(lèi)似物，均未得到類(lèi)似CDA2fd 的衍生物。 5 聚酮類(lèi)抗生素的MBS研究 5.1 Rapamycin（雷帕霉素）2023 Rapamycin是由吸水鏈霉菌（Streptomyces hygro-scopicus）NRRL5491產(chǎn)生的31元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)免疫抑制劑，結(jié)構(gòu)與FK506（tacrolimus，他克莫司）和immu

19、nomycin相似（Fig.8）。臨床上主要用于自身免疫病和組織器官移植時(shí)產(chǎn)生的排異反應(yīng)的治療。 來(lái)源于L-賴氨酸的六氫吡啶酸是rapamycin聚酮環(huán)的重要組成結(jié)構(gòu)。研究表明，rapL基因編碼的RapL（賴氨酸環(huán)化脫氨酶）催化L-賴氨酸生成L-六氫吡啶羧酸。 1998年，Khaw等通過(guò)C31噬菌體介導(dǎo)的基因置換使rapL產(chǎn)生移碼突變，構(gòu)建了RapL失活突變株LEK111。當(dāng)用TSBGM完全培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)野生型菌時(shí)，產(chǎn)生rapamycin和prolylrapamycin（脯氨酰雷帕霉素，L-脯氨酸取代L-六氫吡啶羧酸），兩者比例約為201;同樣條件下發(fā)酵LEK111，則產(chǎn)生少量rapamy-c

20、in和prolylrapamycin，且prolylrapamycin的相對(duì)含量大大增加;添加L-六氫吡啶羧酸，產(chǎn)生rapamycin的量和野生型菌株幾乎相當(dāng);添加L-反-4-羥脯氨酸，產(chǎn)生兩種新的rapamycin類(lèi)似物4-羥脯氨酰-26-去甲氧基-rapamycin（4-hydroxyprolyl-26-demethoxy-ra- pamycin）和4-羥脯氨酰rapamycin（4-hydroxyprolyl- rapamycin）;L-順-4-羥脯氨酸、L-順-3-羥脯氨酸也可以摻入到rapamycin中，但新物質(zhì)結(jié)構(gòu)未闡明;3，4-雙羥脯氨酸和吡啶羧酸未能摻入到rapamycin中。

21、體外活性順序?yàn)閞apamycin>脯氨酰rapamycin>4-羥脯氨酰-26-去甲氧基-rapamycin。 2001年，Chung等通過(guò)同源雙雜交技術(shù)，獲得一個(gè)rapamycin基因簇rapQONML被破壞的突變株，在添加六氫吡啶羧酸后，生成16-氧-去甲基-27-去甲氧基rapamycin，而非rapamycin。 2003年，Graziani等添加RapL的抑制物到野生型菌的發(fā)酵液中，進(jìn)行類(lèi)似MBS的研究，在添加噻嗪烷羧酸后，生成了含硫的rapamycin類(lèi)似物。 Gregory等也曾采用基因手段對(duì)rapamycin產(chǎn)生菌進(jìn)行MBS研究23 。 5.2 Enterocin（

22、伏爾加霉素，恩特洛霉素）24 Enterocin和wailupemycin是由Streptomyces maritimus產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)相似的抑菌劑，其生物合成途徑如Fig.9所示。由encP基因編碼的苯丙氨酸氨基裂合酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）對(duì)entero-cin和wailupemycin的起始前體苯甲酰CoA的合成起著決定性作用。 2003年，Kalaitzis等通過(guò)同源雙雜交技術(shù)，刪除了442bp的EncP序列，構(gòu)建了PAL失活的S.mari-timus突變株XP。添加芳香酸（包括單取代苯甲酸、雜環(huán)芳香酸、1-烯-環(huán)己烷甲酸），發(fā)現(xiàn)單取代苯甲酸中，只

23、有對(duì)-氟苯甲酸可被利用，生成20-氟代enterocin、5-脫氧-20-氟代enterocin和19-氟代wailupemycin DG;2-噻吩甲酸和3-噻吩甲酸以近似12的比例摻入到enterocin和wailupemycin類(lèi)似物分子中，但雜環(huán)化合物如呋喃酸（糖酸）、煙酸未能摻入;添加1-烯-環(huán)己烷甲酸，只生成了enterocin類(lèi)似物;添加N-乙酰半胱氨酸（NAC）基礎(chǔ)上改造而來(lái)的芳香酰CoA硫酯的模擬物，只有苯甲酰-SNAC和2-噻吩甲酰-SNAC以很低的效率摻入到enterocin和wailupemycin G的分子中，而對(duì)-甲苯酰-SNAC和對(duì)-氯-苯甲酰-SNAC未被利用。這

24、是Kalaitzis等第一次利用MBS技術(shù)對(duì)PKS型的大環(huán)內(nèi)酯抗生素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的研究。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明型PKSs對(duì)外源起始單元的耐受性相對(duì)較低，具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。 5.3 Erythromycin（紅霉素）25 紅霉素是1952年從紅霉素鏈霉菌（Streptomyceserythreus）培養(yǎng)液中分離出來(lái)的堿性大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生 素，有A、B、C、D、E等組分。紅霉素分子包括三部分:紅霉素內(nèi)酯（erythronolide）、去氧氨基己糖（desosa-mine）和紅霉糖（cladinose）。 6-dEB（6-脫氧紅霉素內(nèi)酯）是紅霉素合成途徑中最早的中間體，在羥化酶的作用下，C-6位

25、羥基化形成紅霉素內(nèi)酯參與生物合成。早期曾獲得不能合成6-dEB的突變株2NU153，添加一系列的紅霉素內(nèi)酯類(lèi)似物，合成了許多新的衍生物2 。6-dEB是在聚酮合成酶（polyketide synthases）DEBS催化作用下，由丙酰-CoA和六個(gè)甲基丙二酰-CoA以類(lèi)似脂肪酸合成的途徑生成的。DEBS包括三個(gè)亞基:DEBS1、DEBS2和DEBS3，每個(gè)亞基包含兩個(gè)模塊，其中DEBS1還包含荷載域（loading domain），DEBS3還包含一個(gè)硫酯酶TE;Pieper等研究表明DEBS1的荷載域?qū)Φ孜锏奶禺愋杂休^大的寬容性，除正常的丙酰-CoA外，還可以接受乙酰-CoA、丁酰-CoA和

26、N-乙酰半胱氨酸（SNAC）硫酯等。Khosla等1997年通過(guò)分子手段使DEBS1酮基縮合酶失活，并構(gòu)建質(zhì)粒p JRJ2 ，通過(guò)質(zhì)粒將6-dEB基因轉(zhuǎn)移到異源宿主天藍(lán)色鏈霉菌（Strep-tomyces coelicolor）中，獲得工程菌CH999。添加SNAC-硫酯類(lèi)似物，修復(fù)6-dEB的生產(chǎn)能力，并形成新衍生物。然后將這些新衍生物添加到Streptomyces erythreus發(fā)酵液中，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化作用，合成一系列erythromycin D的類(lèi)似物（Fig.10）。研究發(fā)現(xiàn)，SNAC的穩(wěn)定性和添加時(shí)間直接影響到MBS的成功與否及新衍生物的產(chǎn)量。 目前，對(duì)紅霉素生物合成途徑和基因簇的

27、研究已經(jīng)比較透徹，為合成新的衍生物提供了重要基礎(chǔ)和有利條件。 5.4 Avermectin2632 Avermectins（AVM）是由除蟲(chóng)鏈霉菌（Strepto-mycin avermitilis）產(chǎn)生的具有殺昆蟲(chóng)、殺螨、殺線蟲(chóng)活性的16元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，結(jié)構(gòu)如Fig.11所示。AVM分子主要由兩部分（十六元大環(huán)內(nèi)酯環(huán)和L-齊墩果糖二糖）組成，根據(jù)C5、C22-23、C26位結(jié)構(gòu)的不八個(gè)組分。AVM的起始單元來(lái)自L-Ile和L-Val，它們?cè)谥ф湴被徂D(zhuǎn)氨酶的作用下生成-酮酸，然后在支鏈氨基酸-酮酸脫氫酶BCDH的作用下分別生成2-甲基-丁酰-CoA和異丁酰-CoA。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步合成

28、AVM a和b。早在1986年BuLock等就通過(guò)誘變獲得BCDH失活的突變株，利用MBS技術(shù)對(duì)AVM C25位上的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。1991年，Hafne等詳細(xì)介紹了采用NTG誘變獲得BCDH失活突變株的過(guò)程，并獲得性能穩(wěn)定的突變株ATCC53568。之后，Dutton和BuLock等利用ATCC53568進(jìn)行了系統(tǒng)的MBS研究，添加800多種突變生物合成元，獲得了36種新衍生物，均表現(xiàn)出很好的生物活性。其中，最重要的一個(gè)衍生物就是多拉克?。╠oramectin），它被認(rèn)為是采用MBS技術(shù)合成的AVM家族中最優(yōu)秀的成員。多拉克汀是在發(fā)酵培養(yǎng)BCDH失活突變株的過(guò)程中添加環(huán)己烷羧酸（cyclohe

29、xanecarboxylic acid，CHC）獲得的。因?yàn)锽CDH失活，不能利用L-Ile和L-Val為起始單元合成正常的AVM，CHC在脂酰-CoA合成酶的作用下，參與到新起始單元的合成。其結(jié)構(gòu)如Fig.11所示，環(huán)己烷取代C25位上的原有結(jié)構(gòu)。多拉克汀抗蟲(chóng)譜廣、活性強(qiáng)，為極具開(kāi)發(fā)潛力的抗蟲(chóng)新藥。 1995年，Skinner等分別對(duì)BCDH的兩個(gè)基因（bkdABC和bkdFGH）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)F基因中斷，添加2-甲基丁酸，只產(chǎn)生a組分。添加環(huán)己烷羧酸合成多拉克汀。 2000年，Croop等從S.collinus中克隆到一個(gè)能夠合成環(huán)己烷甲酸-CoA的基因，并成功地將該基因?qū)隨trepto

30、mycin avermitilis bkd突變株中，使合成的環(huán)己烷脂肪酸占總脂肪酸的49%。這樣，在不添加環(huán)己烷甲酸的情況下也能產(chǎn)生多拉克汀。隨后，Stutz- man-Engwall等通過(guò)插入失活、定點(diǎn)突變和錯(cuò)配PCR 等技術(shù)使aveC失活，獲得CHC-B1 （多拉克汀）與CHC-B2 的比例增大4倍的突變株。經(jīng)過(guò)上述改造獲得的工程菌，其多拉克汀的產(chǎn)量大大提高，并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。 6 Siderophore的MBS研究33 Siderophore是微生物產(chǎn)生的一類(lèi)低分子量的Fe離子螯合劑，具有很強(qiáng)的Fe離子親和力，滿足微生物對(duì)鐵元素的需要。Phenolic是siderophore家族重要的成

31、員之一，是由銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerugi-nosa）產(chǎn)生的酚代side-rophore。水楊酸（salicylic acid）是phenolic生物合成的關(guān)鍵中間體。 1991年，Ankenbauer等構(gòu)建了水楊酸合成阻斷突變體Sal-IA602。Ankenbauer等添加13種水楊酸類(lèi)似物到IA602的發(fā)酵液中，發(fā)現(xiàn)其中只有5-氟水楊酸（5-fluorosalicylic acid）、4-甲基水楊酸（4-methylsali-cylic acid）和3-羥基吡啶甲酸（3-hydroxypicolinic acid）可摻入到pyochelin類(lèi)似物的生物合成中，并相應(yīng)的生

32、成5-氟pyochelin、4-甲基pyochelin和6-aza-pyochelin（Fig.12）?；钚匝芯勘砻鳎叨季哂蠪e離子運(yùn)輸活性，活性順序?yàn)?-甲基pyochelin>Phenolic>6-azapyochelin>5-fluoro-pyochelin。 7 討論 突變生物合成是在研究抗生素次級(jí)代謝途徑的過(guò)程中興起、發(fā)展和完善起來(lái)的。最初在氨基糖苷類(lèi)抗生素中得到廣泛應(yīng)用。到目前為止，幾乎涉及到抗生素的各個(gè)類(lèi)別，特別是氨基糖苷類(lèi)、聚酮類(lèi)和多肽類(lèi)，開(kāi)發(fā)了許多優(yōu)秀品種，如2-羥基慶大霉素、N-乙酰西索米星、多拉克汀和依替米星等。同時(shí)，也在非抗生素領(lǐng)域得到應(yīng)用，如對(duì)s

33、iderophore和rapamycin衍生物的研究。 MBS的發(fā)展很大程度上決定于突變株的檢出，在分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于MBS以前，主要靠化學(xué)、物理誘變來(lái)獲得突變株，這種方法具有很大的隨機(jī)性，而且工作量大，限制了其發(fā)展?；蚣夹g(shù)的發(fā)展使突變株的獲得方式發(fā)生了巨大變化:直接改造藥物的生物合成基因，有目的性和針對(duì)性地獲得突變株。新階段MBS研究的發(fā)展還得益于以下幾個(gè)方面:微生物次級(jí)代謝途徑和基因簇研究的深入;現(xiàn)代分離檢測(cè)方法特別是HPLC-MS的應(yīng)用;突變合成元來(lái)源的擴(kuò)大;酶工程的發(fā)展。 作為產(chǎn)生微生物藥物衍生物的重要手段，MBS有著巨大的發(fā)展?jié)摿?，主要體現(xiàn)在:與半合成相比，污染少、成本低，而且有

34、些衍生物不能通過(guò)化學(xué)方法制備;新衍生物的發(fā)酵工藝、提取工藝、所需設(shè)備等與原品種相似或相近，甚至稍做改動(dòng)便可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益;微生物次級(jí)代謝途徑和基因簇研究的深入，為MBS提供了更多的研究對(duì)象。 MBS技術(shù)更廣泛地應(yīng)用存在一些限制因素如:盡管利用基因技術(shù)可以有目的的獲得所需要的突變株，但由于酶的專一性，使得突變合成元的選擇范圍受到很大限制;摻入量有限，給新衍生物的檢測(cè)、分離和工業(yè)化增加了難度。針對(duì)這些問(wèn)題，需要對(duì)產(chǎn)生菌進(jìn)一步改造、對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化、對(duì)提取分離檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)。 MBS本身也存在一定的局限性，即MBS主要是對(duì)微生物藥物的母體結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，為藥物結(jié)構(gòu)類(lèi)似

35、物的研究制備方法。 盡管MBS技術(shù)還存在這樣那樣的問(wèn)題，許多優(yōu)秀的衍生物品種，特別是多拉克汀的開(kāi)發(fā)成功，無(wú)疑預(yù)示著其巨大的潛力?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Rinehart K L.Mutasynthesis of new antibiotics J.Pure Appl Chem，1977，49（9）:13612Daum S J，Lemke J R.Mutational biosynthesis of new antibiotics J.Annu Rev Microbiol，1979，33:2413Takeda K，Kinumaki A，YukioIto，et al.Mutational biosynth

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