放射免疫法和ELISA之間的差別

1、放射免疫法和ELISA之間的差別 付濤（2012881007）2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院放射免疫法放射免疫法一、原理： 利用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體，然后與被測(cè)的抗體或抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物的原理來(lái)進(jìn)行分析的。2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院分析方法分析方法放射免疫法分析有兩種方法：競(jìng)爭(zhēng)性競(jìng)爭(zhēng)性RIA,又稱傳統(tǒng)又稱傳統(tǒng)RIA非競(jìng)爭(zhēng)性非競(jìng)爭(zhēng)性RIA，又稱免疫放射分析（，又稱免疫放射分析（IRMA)2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院競(jìng)爭(zhēng)性競(jìng)爭(zhēng)性RIA 主要特點(diǎn)：標(biāo)記的是抗原。其原理：未知抗原Ag+標(biāo)記抗原Ag+已知定量抗體Ab標(biāo)記抗原與抗體復(fù)合物AgAb+未知抗原與抗體復(fù)合物AgAb+游離標(biāo)

2、記抗原Ag（去除）。2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院基本原理基本原理 Ag-Ab + Ag *Ag AbAg+*Ag-Ab + *Ag (B)復(fù)合物復(fù)合物 (F)游離物游離物 4*Ag與與Ag的免疫活性相同的免疫活性相同4*AgAg AbAg= * Ag , AgAb=*AgAbAg *Ag , *AgAb (B) *Ag(F)Ag 90%2）半衰期足夠長(zhǎng)）半衰期足夠長(zhǎng)3）保持原有抗原的特性）保持原有抗原的特性125I大分子、3H or 125I小分子2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院（二）（二） B和和F的分離的分離1、第一類、第一類2、第二類、第二類雙抗體沉淀法雙抗體沉淀法PEG沉淀法沉淀法固相

3、第二抗體法固相第二抗體法二、基本方法二、基本方法+AgAb(1)Ab(2)試管試管Ab(2)Ab(1)Ag可溶性復(fù)合物可溶性復(fù)合物可沉淀復(fù)合物可沉淀復(fù)合物2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院三、質(zhì)量控制（三、質(zhì)量控制（quality controlquality control） 1、精密度（、精密度（precision） 變異系數(shù)（變異系數(shù)（ CV ）2、準(zhǔn)確度（、準(zhǔn)確度（accuracy） 回收率回收率=測(cè)定值測(cè)定值/真實(shí)值真實(shí)值100% 90%110% 3、靈敏度、靈敏度 （sensitivity）方法的最小可測(cè)量方法的最小可測(cè)量4、特異性（、特異性（specificity）交叉反應(yīng)率交叉反應(yīng)

4、率5、可靠性（、可靠性（validity）平行性試驗(yàn)平行性試驗(yàn)6、穩(wěn)定性（、穩(wěn)定性（stability）B0%，NSB，ED25，ED50，ED75 ABC2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院RIA RIA 小小 結(jié)結(jié)靈敏度高靈敏度高特異性好特異性好精確的定量精確的定量方法操作簡(jiǎn)便方法操作簡(jiǎn)便2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院非競(jìng)爭(zhēng)性非競(jìng)爭(zhēng)性RIA（MISA) 主要特點(diǎn)：標(biāo)記的是抗體。按反應(yīng)原理又分兩種：?jiǎn)挝稽c(diǎn)IRMA,其原理：抗原只有一個(gè)抗原決定簇，所測(cè)的抗原為小分子抗原。雙位點(diǎn)IRMA：抗原有兩個(gè)抗原決定簇，所使用的兩種亞型抗體在與同一抗原分子結(jié)合時(shí)互不干擾。2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院免疫放射分

5、析法免疫放射分析法*Ab+Ag-*Ab + *Ab（immunoradiometric assay,IRMA）B% Ag（B）（F）2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院 IRMA與與RIA工作原理的主要區(qū)別工作原理的主要區(qū)別RIAIRMA競(jìng)爭(zhēng)性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)非競(jìng)爭(zhēng)性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)采用標(biāo)記抗原采用標(biāo)記抗體三種主要反應(yīng)試劑二種主要反應(yīng)試劑所用抗體是限量的所用抗體是過(guò)量的*AgAb的量與待測(cè)Ag的量呈負(fù)相關(guān)Ag*Ab的量與待測(cè)Ag的量呈正相關(guān)反應(yīng)到達(dá)平衡慢反應(yīng)到達(dá)平衡快非特異結(jié)合主要影響高劑量區(qū) 非特異結(jié)合主要影響低劑量區(qū)低劑量區(qū)有不確定因素低劑量區(qū)無(wú)不確定因素2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院ELISA

6、ELISA即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。其基本原理有三條： （1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性； （2）抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性； （3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。 2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院 ELISA過(guò)程包括：抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被，加待測(cè)抗體（抗原）, 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體（抗原）,生成抗原

7、（抗體）待測(cè)抗體（抗原）酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體（抗原）的量。待測(cè)抗體（抗原）的定量與有色產(chǎn)生成正比。2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院 ELISA常用的四種方法常用的四種方法 1直接法測(cè)定抗原直接法測(cè)定抗原 1、將抗原吸附在載體表面； 2、加酶標(biāo)抗體，形成抗原抗體復(fù)合物； 3、加底物。底物的降解量抗原量。 2間接法測(cè)定抗體間接法測(cè)定抗體 1、將抗原吸附于固相載體表面； 2、 加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物； 3、加酶標(biāo)抗體； 4、加底物。 測(cè)定底物的降解量抗體量。2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院洗滌洗滌洗滌洗滌洗滌洗滌待測(cè)抗體待測(cè)抗體酶標(biāo)抗

8、抗體酶標(biāo)抗抗體2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院3.雙抗體夾心法測(cè)定抗原雙抗體夾心法測(cè)定抗原 1、將抗原免疫第一種動(dòng)物獲得的抗體吸附于固相表面; 2、加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物; 3、加抗原免疫第二種動(dòng)物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復(fù)合物; 4、加酶標(biāo)抗抗體（第二種動(dòng)物抗體的抗體）; 5、加底物。底物的降解量抗原量。2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院洗洗滌滌洗洗滌滌洗洗滌滌待測(cè)抗原待測(cè)抗原2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院 4. 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原（1）將抗體吸附在固相載體表面;（2）加入酶標(biāo)抗原（3）加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原；（4) 加底物。 對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差未知抗原量。 2022

9、-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院洗滌洗滌洗滌洗滌待測(cè)抗原待測(cè)抗原酶標(biāo)抗原酶標(biāo)抗原2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院每空加洗滌液 350ul，30秒甩甩盡孔內(nèi)液體，吸水紙上拍干盡孔內(nèi)液體，吸水紙上拍干重復(fù)3次2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值減去空白孔的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出標(biāo)本濃度2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院放射免疫法和ELISA之間的差別 1)放射免疫分析通過(guò)放射活性分子共價(jià)交聯(lián)至抗體或抗原上，免疫反應(yīng)后測(cè)定放射活性分子的放射信號(hào)來(lái)定量檢測(cè)相應(yīng)抗體或抗原等，可用于測(cè)定包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲、腫瘤以及小分子藥物等的多種抗原和抗體。由于該方法特異性好，靈敏度高，且儀器自動(dòng)化，操作簡(jiǎn)便，樣品制備簡(jiǎn)單等，因而自50年代末問(wèn)世以來(lái)已在許多領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。但該方法中操作人員需要接觸放射性物質(zhì)，會(huì)損害操作人員的身體，同時(shí)測(cè)定完成后放射性材料的處置也是個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。2022-5-2 浙江萬(wàn)里學(xué)院總結(jié) 2)酶免疫分析是將抗原、抗體的特異性免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來(lái)的一種免疫分析方法。將特定的酶標(biāo)記在抗原或抗體上，在免疫反應(yīng)后，通過(guò)肉眼觀察或借助簡(jiǎn)單的光學(xué)儀器測(cè)定酶催化底物所生成的有色