放射免疫法和ELISA之間的差別

1、放射免疫法和ELISA之間的差別 付濤（2012881007）2022-5-2 浙江萬里學院放射免疫法放射免疫法一、原理： 利用放射性同位素標記抗原或抗體，然后與被測的抗體或抗原結(jié)合，形成抗原抗體復合物的原理來進行分析的。2022-5-2 浙江萬里學院分析方法分析方法放射免疫法分析有兩種方法：競爭性競爭性RIA,又稱傳統(tǒng)又稱傳統(tǒng)RIA非競爭性非競爭性RIA，又稱免疫放射分析（，又稱免疫放射分析（IRMA)2022-5-2 浙江萬里學院競爭性競爭性RIA 主要特點：標記的是抗原。其原理：未知抗原Ag+標記抗原Ag+已知定量抗體Ab標記抗原與抗體復合物AgAb+未知抗原與抗體復合物AgAb+游離標

2、記抗原Ag（去除）。2022-5-2 浙江萬里學院基本原理基本原理 Ag-Ab + Ag *Ag AbAg+*Ag-Ab + *Ag (B)復合物復合物 (F)游離物游離物 4*Ag與與Ag的免疫活性相同的免疫活性相同4*AgAg AbAg= * Ag , AgAb=*AgAbAg *Ag , *AgAb (B) *Ag(F)Ag 90%2）半衰期足夠長）半衰期足夠長3）保持原有抗原的特性）保持原有抗原的特性125I大分子、3H or 125I小分子2022-5-2 浙江萬里學院（二）（二） B和和F的分離的分離1、第一類、第一類2、第二類、第二類雙抗體沉淀法雙抗體沉淀法PEG沉淀法沉淀法固相

3、第二抗體法固相第二抗體法二、基本方法二、基本方法+AgAb(1)Ab(2)試管試管Ab(2)Ab(1)Ag可溶性復合物可溶性復合物可沉淀復合物可沉淀復合物2022-5-2 浙江萬里學院三、質(zhì)量控制（三、質(zhì)量控制（quality controlquality control） 1、精密度（、精密度（precision） 變異系數(shù)（變異系數(shù)（ CV ）2、準確度（、準確度（accuracy） 回收率回收率=測定值測定值/真實值真實值100% 90%110% 3、靈敏度、靈敏度 （sensitivity）方法的最小可測量方法的最小可測量4、特異性（、特異性（specificity）交叉反應(yīng)率交叉反應(yīng)

4、率5、可靠性（、可靠性（validity）平行性試驗平行性試驗6、穩(wěn)定性（、穩(wěn)定性（stability）B0%，NSB，ED25，ED50，ED75 ABC2022-5-2 浙江萬里學院RIA RIA 小小 結(jié)結(jié)靈敏度高靈敏度高特異性好特異性好精確的定量精確的定量方法操作簡便方法操作簡便2022-5-2 浙江萬里學院非競爭性非競爭性RIA（MISA) 主要特點：標記的是抗體。按反應(yīng)原理又分兩種：單位點IRMA,其原理：抗原只有一個抗原決定簇，所測的抗原為小分子抗原。雙位點IRMA：抗原有兩個抗原決定簇，所使用的兩種亞型抗體在與同一抗原分子結(jié)合時互不干擾。2022-5-2 浙江萬里學院免疫放射分

5、析法免疫放射分析法*Ab+Ag-*Ab + *Ab（immunoradiometric assay,IRMA）B% Ag（B）（F）2022-5-2 浙江萬里學院 IRMA與與RIA工作原理的主要區(qū)別工作原理的主要區(qū)別RIAIRMA競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)非競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)采用標記抗原采用標記抗體三種主要反應(yīng)試劑二種主要反應(yīng)試劑所用抗體是限量的所用抗體是過量的*AgAb的量與待測Ag的量呈負相關(guān)Ag*Ab的量與待測Ag的量呈正相關(guān)反應(yīng)到達平衡慢反應(yīng)到達平衡快非特異結(jié)合主要影響高劑量區(qū) 非特異結(jié)合主要影響低劑量區(qū)低劑量區(qū)有不確定因素低劑量區(qū)無不確定因素2022-5-2 浙江萬里學院ELISA

6、ELISA即酶聯(lián)免疫吸附測定。其基本原理有三條： （1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學活性； （2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學和酶學活性； （3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結(jié)果。 2022-5-2 浙江萬里學院 ELISA過程包括：抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被，加待測抗體（抗原）, 再加相應(yīng)酶標記抗體（抗原）,生成抗原

7、（抗體）待測抗體（抗原）酶標記抗體的復合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計的光吸收計算抗體（抗原）的量。待測抗體（抗原）的定量與有色產(chǎn)生成正比。2022-5-2 浙江萬里學院 ELISA常用的四種方法常用的四種方法 1直接法測定抗原直接法測定抗原 1、將抗原吸附在載體表面； 2、加酶標抗體，形成抗原抗體復合物； 3、加底物。底物的降解量抗原量。 2間接法測定抗體間接法測定抗體 1、將抗原吸附于固相載體表面； 2、 加抗體, 形成抗原-抗體復合物； 3、加酶標抗體； 4、加底物。 測定底物的降解量抗體量。2022-5-2 浙江萬里學院洗滌洗滌洗滌洗滌洗滌洗滌待測抗體待測抗體酶標抗

8、抗體酶標抗抗體2022-5-2 浙江萬里學院3.雙抗體夾心法測定抗原雙抗體夾心法測定抗原 1、將抗原免疫第一種動物獲得的抗體吸附于固相表面; 2、加抗原，形成抗原-抗體復合物; 3、加抗原免疫第二種動物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復合物; 4、加酶標抗抗體（第二種動物抗體的抗體）; 5、加底物。底物的降解量抗原量。2022-5-2 浙江萬里學院洗洗滌滌洗洗滌滌洗洗滌滌待測抗原待測抗原2022-5-2 浙江萬里學院 4. 競爭法測定抗原競爭法測定抗原（1）將抗體吸附在固相載體表面;（2）加入酶標抗原（3）加入酶標抗原和待測抗原；（4) 加底物。 對照孔與樣品孔底物降解量的差未知抗原量。 2022

9、-5-2 浙江萬里學院洗滌洗滌洗滌洗滌待測抗原待測抗原酶標抗原酶標抗原2022-5-2 浙江萬里學院2022-5-2 浙江萬里學院每空加洗滌液 350ul，30秒甩甩盡孔內(nèi)液體，吸水紙上拍干盡孔內(nèi)液體，吸水紙上拍干重復3次2022-5-2 浙江萬里學院標準品和標本的OD值減去空白孔的OD值繪制標準曲線，查出標本濃度2022-5-2 浙江萬里學院放射免疫法和ELISA之間的差別 1)放射免疫分析通過放射活性分子共價交聯(lián)至抗體或抗原上，免疫反應(yīng)后測定放射活性分子的放射信號來定量檢測相應(yīng)抗體或抗原等，可用于測定包括病毒、細菌、寄生蟲、腫瘤以及小分子藥物等的多種抗原和抗體。由于該方法特異性好，靈敏度高，且儀器自動化，操作簡便，樣品制備簡單等，因而自50年代末問世以來已在許多領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。但該方法中操作人員需要接觸放射性物質(zhì)，會損害操作人員的身體，同時測定完成后放射性材料的處置也是個嚴重的問題。2022-5-2 浙江萬里學院總結(jié) 2)酶免疫分析是將抗原、抗體的特異性免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用有機結(jié)合起來的一種免疫分析方法。將特定的酶標記在抗原或抗體上，在免疫反應(yīng)后，通過肉眼觀察或借助簡單的光學儀器測定酶催化底物所生成的有色