生物制品：抗體藥物

1、抗體藥物抗體藥物第一節(jié)第一節(jié) 概述概述第二第二節(jié)節(jié) 抗毒素與免疫血清抗毒素與免疫血清第三節(jié)第三節(jié) 單克隆抗體單克隆抗體第四第四節(jié)節(jié) 基因工程抗體基因工程抗體第一節(jié)第一節(jié) 概述概述抗體藥物的概念抗體藥物的概念抗體抗體機體在抗原性物質的刺激下所產生的一種免疫機體在抗原性物質的刺激下所產生的一種免疫球蛋白球蛋白(主要由淋巴細胞所產生主要由淋巴細胞所產生)，因其能與細菌、病毒，因其能與細菌、病毒或毒素等異源性物質結合而發(fā)揮預防、治療疾病作用。或毒素等異源性物質結合而發(fā)揮預防、治療疾病作用。藥物藥物(drug)：是一類分子（化學合成物，蛋白質，核酸：是一類分子（化學合成物，蛋白質，核酸等）可以干擾人體內

2、細胞生命過程中一些重要的生理和等）可以干擾人體內細胞生命過程中一些重要的生理和病理活動或通路病理活動或通路抗體類藥物以其高特異性、有效性和安全性正在發(fā)展成抗體類藥物以其高特異性、有效性和安全性正在發(fā)展成為國際藥品市場上一大類新型診斷和治療劑。為國際藥品市場上一大類新型診斷和治療劑。Antibody has a higher specificity and affinity to bind to target protein. 抗體技術的發(fā)展抗體技術的發(fā)展多克隆抗體多克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體基因工程抗體基因工程抗體多克隆抗體多克隆抗體1890年，德國人年，德國人Behring（培林）和（培林

3、）和日本人日本人Kitasato(北里）將白喉外毒素北里）將白喉外毒素注射給動物，發(fā)現在該動物血清中存注射給動物，發(fā)現在該動物血清中存在一種能中和白喉外毒素的物質，他在一種能中和白喉外毒素的物質，他們稱之為抗毒素。將具有抗毒素的免們稱之為抗毒素。將具有抗毒素的免疫血清注入正常動物體內，可使其獲疫血清注入正常動物體內，可使其獲得對白喉毒素的抵抗力。他們以同樣得對白喉毒素的抵抗力。他們以同樣的方法用這種免疫血清成功地治愈了的方法用這種免疫血清成功地治愈了一例患白喉病的女孩。一例患白喉病的女孩。1901年獲諾貝爾獎年獲諾貝爾獎單克隆抗體單克隆抗體1975年，英國劍橋的科學家年，英國劍橋的科學家Koh

4、ler和和Milstein將小鼠骨髓瘤細胞核經綿陽紅細胞將小鼠骨髓瘤細胞核經綿陽紅細胞免疫過的小鼠脾細胞在體外進行細胞融合，免疫過的小鼠脾細胞在體外進行細胞融合，采用合適的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，結果發(fā)現，采用合適的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，結果發(fā)現，部分雜家細胞既能繼續(xù)在體外培養(yǎng)條件下部分雜家細胞既能繼續(xù)在體外培養(yǎng)條件下生長繁殖，有能分泌抗體，他們稱這種雜生長繁殖，有能分泌抗體，他們稱這種雜交細胞系為雜交瘤。交細胞系為雜交瘤。應用雜交瘤技術可獲得幾乎所有抗原的單應用雜交瘤技術可獲得幾乎所有抗原的單克隆抗體?？寺】贵w。這種方法制備的單克隆抗體可視為第二代這種方法制備的單克隆抗體可視為第二代抗體。抗體?；蚬こ炭?/p>

5、體基因工程抗體基因工程抗體興起于基因工程抗體興起于20世紀世紀80年代早期。這年代早期。這一技術是在充分了解一技術是在充分了解Ig基因結構與功能的基基因結構與功能的基礎上與礎上與DNA重組技術相結合，然后根據研究重組技術相結合，然后根據研究者的意圖，在基因水平上對者的意圖，在基因水平上對Ig分子進行剪切、分子進行剪切、連接或修飾，甚至是人工合成后導入受體細連接或修飾，甚至是人工合成后導入受體細胞表達，產生新型抗體，也稱為第三代抗體。胞表達，產生新型抗體，也稱為第三代抗體。嵌合抗體、改型抗體、單鏈抗體、單區(qū)抗體、嵌合抗體、改型抗體、單鏈抗體、單區(qū)抗體、抗體庫抗體庫7576777879808182

6、838485868788899091929394959697989920001 12 23 34 45 56 67 71.1.單克隆抗體單克隆抗體- -雜交瘤技術宣告誕生雜交瘤技術宣告誕生圖圖1.治療性抗體發(fā)展歷程和事件治療性抗體發(fā)展歷程和事件 2.2.應用抗體治療淋巴瘤取得成功應用抗體治療淋巴瘤取得成功3. OKT3單抗被美國單抗被美國FDA批準上市批準上市4. 單抗用于腫瘤治療效果不佳單抗用于腫瘤治療效果不佳 5.5.抗內毒素單抗試用于治療敗血癥性休克失敗抗內毒素單抗試用于治療敗血癥性休克失敗6. 6. 抗抗17-1A17-1A和和ReoProReoPro上市上市7. FDA批準批準21個

7、治療性單抗上市個治療性單抗上市 2010年治療性單抗類藥物市場份額為480億美元,相比于2008年的370億美元和2009年的400億美元,穩(wěn)步提高.另外用于診斷和作為試劑用途的單抗類產品銷售額為100億美元。預計到2014年全球抗體藥物的年銷售將達到1000億美元。http:/ NameGenetic Name商品名商品名FDAFDA批準批準上市時間上市時間適應癥適應癥生產廠家生產廠家銷售額銷售額 ( (億億 美元美元) )20092009201020101 1InfliximabInfliximabRemicadeRemicade19981998RA, UC, CD, Ps, PsA, R

8、A, UC, CD, Ps, PsA, AS AS J&J, Merck, Mitsubishi J&J, Merck, Mitsubishi TanabeTanabe69.169.180802 2BevacizumabBevacizumabAvastinAvastin20042004Colon cancerColon cancerRocheRoche59.259.268683 3RituximabRituximabRituxanRituxan19971997NHL, RANHL, RARocheRoche585867674 4AdalimumabAdalimumabHumir

9、a Humira 20022002RA, Ps, JIA, PsA, AS, RA, Ps, JIA, PsA, AS, CD CD AbbottAbbott54.954.965655 5TrastuzumabTrastuzumabHerceptin Herceptin 19981998Breast CancerBreast CancerRocheRoche50.250.255556 6CetuximabCetuximabErbituxErbitux20042004Colon, head and neck Colon, head and neck cancercancerBristol Mye

10、rs Squibb, Bristol Myers Squibb, Merck Serono Merck Serono 25.725.732327 7Ranibizumab hzRanibizumab hzLucentisLucentis20062006Wet Macular Wet Macular degeneration degeneration Novartis, RocheNovartis, Roche24.324.331318 8NatalizumabNatalizumabTysabri Tysabri 2004/20062004/2006Multiple sclerosisMulti

11、ple sclerosisBiogen Idec, ElanBiogen Idec, Elan10.610.617.517.59 9Omalizumab hz Omalizumab hz Xolair Xolair 20032003Allergic AsthmaAllergic AsthmaRoche, NovartisRoche, Novartis9.19.111111010PalivizumabPalivizumabSynagisSynagis19981998RSVRSVAstra ZenecaAstra Zeneca11111010在未來在未來十年內十年內，很多全球，很多全球銷售額達到銷

12、售額達到500500億億美元的生物制品面臨仿制藥的競爭美元的生物制品面臨仿制藥的競爭 迄今為止，我國共批準了15 個抗體藥物上市，7 種為進口，8 種為自主研發(fā)。 差距：技術與資金，單克隆抗體藥還未進入醫(yī)保目錄。 生物制藥占比遠低于世界水平，發(fā)展空間巨大。2007 年全球抗體藥物已占整個生物技術藥物市場份額的34.4%，而我國僅為1.7%，遠低于全球平均水平。 這一方面說明了我國抗體藥物市場的落后，另一方面也提示了我國市場巨大的潛力。以上市時間較早的利妥昔和曲妥珠單抗為例，兩者2003 年在樣本醫(yī)院的銷售額僅為0.177 億元和0.027 億元，而2008年銷售額已上升至2.12 億元和1.1

13、4 億元，20032008 年復合增速高達64%和111%，遠高于總藥品18%的復合增速。 預計到2015年，我國抗體藥物市場規(guī)模將達137億元。單抗藥物國內發(fā)展現狀單抗藥物國內發(fā)展現狀單抗藥物國內銷售額單抗藥物國內銷售額商品名商品名生產廠家生產廠家適應癥適應癥20112011年銷售額年銷售額 ( (億元人民幣億元人民幣) )20112011年增長率年增長率（% %）1 1Mabthera 美羅華美國羅氏淋巴瘤4.94232 2Herceptin 赫塞汀美國羅氏乳腺癌4.17373 3Yi Sai Pu 益賽普中信國健類風濕關節(jié)炎、強直性脊柱炎和銀屑病2.7264 4Tai Xin Sheng

14、 泰欣生百泰生物頸部腫瘤、消化道腫瘤1.38275 5Remicade 英利昔單抗西安楊森類風濕關節(jié)炎1.08286 6Avastin 阿瓦斯汀美國羅氏結直腸癌0.7-7 7Simulect 舒萊諾華制藥器官移植的抗排斥治療0.548 8Enbrel 恩博輝瑞制藥類風濕關節(jié)炎0.228 利卡?。撼啥既A神，治療肝癌 唯美生：上海美恩，治療肺癌 抗CD3單抗：武漢生物所，用于器官移植的抗排斥治療 恩博克： 宏遠逸士生物技術藥業(yè)有限公司，治療牛皮癬 Muromonab-CD3： 奧多生物技術，用于器官移植的抗排斥治療 賽尼哌：美國羅氏，用于器官移植的抗排斥治療 愛必妥： 默克，治療結直腸癌 來自政策

15、的扶持：隨著醫(yī)療改革的推進，政府在公共醫(yī)療衛(wèi)生領域的投入會增大，政策扶持力度將加大，單抗藥物的研發(fā)和產業(yè)將會受益。 目前，國內正興起新一輪抗體藥物投資。據悉，全國各地至少建了三四十條生產線，而每一條投資至少12億美元。 未來幾年國內單抗藥有望實現爆發(fā)式增長，增長率預計超過50%，10年后，國內市場規(guī)模有望達到目前國際水平。目前我國正處于抗體藥物快速發(fā)展的起步階段，未來幾年，單抗藥物將成為生物制藥發(fā)展重點。 我國單抗發(fā)展的重點：防治惡性腫瘤、心腦血管疾病、神經系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、艾滋病以及免疫缺陷等疾病的抗體藥物；抗體人源化及人源抗體；提高大規(guī)模細胞培養(yǎng)和蛋白純化技術。國內單抗藥物發(fā)展展望國

16、內單抗藥物發(fā)展展望中國中國SFDA批準上市和進入臨床的抗體藥物批準上市和進入臨床的抗體藥物抗體名稱抗體名稱商品名商品名廠家廠家抗體類型抗體類型研發(fā)階段研發(fā)階段適應癥適應癥Muromonab-CD3Orthoclone奧多生物技術公司奧多生物技術公司（Ortho Biotech）鼠源鼠源批準上市批準上市抑制排斥反應抑制排斥反應Rituximab利妥昔利妥昔羅氏（羅氏（Roche）公）公司司嵌合嵌合批準上市批準上市治療非何杰金淋巴治療非何杰金淋巴瘤瘤Trastuzumab和曲妥珠和曲妥珠羅氏（羅氏（Roche）公）公司司人源化人源化批準上市批準上市治療乳腺癌治療乳腺癌Basiliximab巴利昔巴

17、利昔諾華制藥諾華制藥（Novartis）嵌合嵌合批準上市批準上市各種器官移植的抗各種器官移植的抗排斥治療，尤其在排斥治療，尤其在對腎移植后急性排對腎移植后急性排斥反應的治療斥反應的治療Trastuzumab賀塞汀賀塞汀基因工程技術公司基因工程技術公司（Genentech）人源化人源化批準上市批準上市注射用鼠源性抗注射用鼠源性抗人人T淋巴細胞淋巴細胞CD3抗原單克隆抗體抗原單克隆抗體 武漢生物制品研究武漢生物制品研究所所 鼠源鼠源批準上市批準上市抗腎移植單抗抗腎移植單抗OKT3 抗人抗人IL-8單克隆單克隆抗體乳膏抗體乳膏 東莞宏遠逸士生物東莞宏遠逸士生物技術藥業(yè)有限公司技術藥業(yè)有限公司 鼠源鼠

18、源批準上市批準上市牛皮癬的治療牛皮癬的治療 碘碘131I人鼠嵌人鼠嵌合型腫瘤細胞核合型腫瘤細胞核單克隆抗體注射單克隆抗體注射液（液（131I-chTNT） 上海美恩生物技術上海美恩生物技術有限公司有限公司 嵌合嵌合批準上市批準上市國家國家類新藥類新藥 ，用用于多種實體瘤于多種實體瘤 中國中國SFDA批準上市和進入臨床的抗體藥物批準上市和進入臨床的抗體藥物抗體名稱抗體名稱商品名商品名廠家廠家抗體類型抗體類型研發(fā)階段研發(fā)階段適應癥適應癥碘碘131I肝癌片肝癌片段抗體注射液段抗體注射液 美妥昔美妥昔第四軍醫(yī)大學第四軍醫(yī)大學 成都華神集團成都華神集團鼠源鼠源完成臨床完成臨床待批上市待批上市用于原發(fā)性肝

19、用于原發(fā)性肝癌的靶向治療癌的靶向治療 H-R3 北京百泰生物藥業(yè)北京百泰生物藥業(yè)公司公司 人源化人源化 期臨床期臨床 實體瘤治療實體瘤治療 注射用鼠抗人注射用鼠抗人T淋淋巴細胞巴細胞CD3表面抗表面抗原單克隆抗體原單克隆抗體 濟南天康生物制品濟南天康生物制品有限公司有限公司 鼠源鼠源臨床研究臨床研究抗移植排斥抗移植排斥 注射用抗腎病綜合注射用抗腎病綜合癥出血熱病毒單克癥出血熱病毒單克隆抗體（隆抗體（I型）型） 武漢生物制品所武漢生物制品所第四軍醫(yī)大學第四軍醫(yī)大學 鼠源鼠源臨床研究臨床研究治療出血熱治療出血熱抗人肝癌單抗抗人肝癌單抗 中科院細胞所中科院細胞所 鼠源鼠源臨床研究臨床研究抗乙型腦炎單

20、抗抗乙型腦炎單抗 北京生物制品所北京生物制品所第四軍醫(yī)大學第四軍醫(yī)大學 鼠源鼠源臨床研究臨床研究注射用重組人注射用重組人型型腫瘤壞死因子受體腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白抗體融合蛋白 上海美恩生物技術上海美恩生物技術有限公司有限公司嵌合嵌合臨床研究臨床研究第二節(jié)第二節(jié) 抗毒素與免疫血清抗毒素與免疫血清抗毒素與免疫血清抗毒素與免疫血清抗毒素（抗毒素（antitoxin）指用細菌外毒素或類毒素免疫）指用細菌外毒素或類毒素免疫動物取得的動物取得的免疫血清。免疫血清。外毒素外毒素指某些細胞生長繁殖過程中分泌到菌體外的一種代謝產物。其主要成指某些細胞生長繁殖過程中分泌到菌體外的一種代謝產物。其主要成分為

21、蛋白質。在人類疾病中，如產生于破傷風、白喉和肉毒中毒等。其毒性分為蛋白質。在人類疾病中，如產生于破傷風、白喉和肉毒中毒等。其毒性作用強，不同種細菌產生的外毒素對機體的毒性作用有明顯不同，可選擇性作用強，不同種細菌產生的外毒素對機體的毒性作用有明顯不同，可選擇性地作用于某些組織器官，引起特殊病變。外毒素不耐熱、不穩(wěn)定、抗原性強，地作用于某些組織器官，引起特殊病變。外毒素不耐熱、不穩(wěn)定、抗原性強，可刺激機體產生抗毒素，可中和外毒素，用作治療。經甲醛處理可脫毒，做可刺激機體產生抗毒素，可中和外毒素，用作治療。經甲醛處理可脫毒，做成類毒素，用作免疫預防劑。成類毒素，用作免疫預防劑。類毒素類毒素是細菌的

22、外毒素經甲醛處理后，失去毒性而仍保留其免疫原性，能刺是細菌的外毒素經甲醛處理后，失去毒性而仍保留其免疫原性，能刺激機體產生保護性免疫的制劑。激機體產生保護性免疫的制劑。目前我國生產的抗血清主要有：目前我國生產的抗血清主要有：白喉抗毒素白喉抗毒素、破傷風抗毒素破傷風抗毒素、氣性壞疽抗毒素、肉、氣性壞疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗蛇毒血清、毒抗毒素、抗蛇毒血清、抗狂犬病血清抗狂犬病血清。抗毒素的性質及作用機制抗毒素的性質及作用機制1）理化性質刺激機體產生針對各種決定簇的抗體是多克隆抗體2）抗毒活性臨床上常用抗毒素（毒素的對應抗體）治療外毒素所致疾?。ò缀怼⑵苽L）以及毒蛇咬傷?？苟舅匮迨怯妙惗舅?、毒素

23、免疫馬后，取其免疫血清制備的。馬的免疫血清對患者具有二重性。一方面，它含有特異性抗體（抗毒素），可以中和相應的毒素，起到防治的作用；另一方面，馬血清對人而言是異種蛋白，具有抗原性， 可引起血清病?？苟舅氐闹圃炜苟舅氐闹圃?.免疫血清的制造 1）馬匹選擇 2）免疫原（精制類毒素或類毒素） 3）免疫方法（基礎免疫和超免疫） 4）血清的分離2.抗毒素的精制 硫酸銨鹽析法與胃酶消化聯合抗毒素的應用抗毒素的應用白喉抗毒素白喉抗毒素破傷風抗毒素破傷風抗毒素肉毒抗毒素肉毒抗毒素抗蛇毒血清抗蛇毒血清第三節(jié)第三節(jié) 單克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體的治療機制1）中和作用2）示蹤或導向作用3）競爭

24、性抑制作用/拮抗作用4）抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用單抗的治療應用單抗的治療應用1）抗腫瘤2）抗器官移植排斥反應3）抗感染4）抗血栓形成5）解毒6）構建抗獨特型抗體疫苗7）在自身免疫性疾病及變態(tài)反應性疾病中的應用8）毒品方面的應用9）血型鑒定單克隆抗體的診斷作用單克隆抗體的診斷作用1.T細胞及其亞群單抗診斷試劑2.病原體的單抗診斷試劑3.腫瘤單抗診斷試劑4.激素、酶等生物活性物質單抗診斷試劑5.生物制劑的單抗偵檢試劑6.環(huán)境和食品衛(wèi)生的單抗診斷試劑單克隆抗體的缺點單克隆抗體的缺點1.單克隆抗體具有免疫原性2.半衰期短3.靶吸收差4.生產復雜、價格昂貴第四節(jié)第四節(jié) 基因工程抗體基因工程抗體基因

25、工程抗體基因工程抗體將制備單克隆抗體的細胞工程技術與生產重將制備單克隆抗體的細胞工程技術與生產重組分子的基因工程技術和蛋白質工程技術結組分子的基因工程技術和蛋白質工程技術結合起來，對編碼蛋白質的基因按不同需要進合起來，對編碼蛋白質的基因按不同需要進行加工改造和重新組裝，轉染適當的受體細行加工改造和重新組裝，轉染適當的受體細胞后表達出抗體分子，這種經基因重組的抗胞后表達出抗體分子，這種經基因重組的抗體稱為基因工程抗體，又稱重組抗體。體稱為基因工程抗體，又稱重組抗體?；蚩贵w：通過基因工程手段，保留抗體重輕鏈可變區(qū)中主要基因抗體：通過基因工程手段，保留抗體重輕鏈可變區(qū)中主要與抗原結合的與抗原結合的

26、CDR功能區(qū)功能區(qū), 而形成的各種功能抗體而形成的各種功能抗體Complementary-determining regions: CDR基因工程抗體的分類基因工程抗體的分類基因工程抗體的分類基因工程抗體的分類小分子抗體（1）Fab片段（2）單鏈抗體（single chain antibody，scFv）、雙鏈抗體、三鏈抗體（3）微型抗體（minibody，兩個scFv與抗體CH3區(qū)連接）（4）雙特異性抗體（diabody）（5）其他形式抗體（細胞內抗體、催化抗體、免疫脂質體、最小結合單位等）抗體藥物在應用中存在的問題：抗體藥物在應用中存在的問題：一般必須用小鼠骨髓瘤制備單抗，故所得鼠源性單抗

27、，必須人源化，在臨床上可減少異源性蛋白所引起的過敏反應和增加療效。鼠源抗體人源化后，抗體效價明顯降低，導致臨床療效降低。臨床治療需要大量的抗體(克級），故需要生物反應器制備抗體。由于抗體的產量和質量受到限制，而影響療效。問題問題:工程細胞系工程細胞系,大規(guī)模生產工藝技術大規(guī)模生產工藝技術基因工程抗體的優(yōu)點和缺點基因工程抗體的優(yōu)點和缺點優(yōu)點：不受動物品系（species)和抗體類型（isotype)的限制。利用嵌合抗體，使鼠源抗體人源化，減少潛在的抗原表位，增強抗體的療效。全人源化抗體，可以降低抗體的異源性和免疫源性，最大化提升抗體的的療效。缺點：抗體的親和力減弱，與完整抗體結構相比，功能明顯降

28、低。目的： 減小鼠源性成份，降低HAMS反應（human against mouse syndrome)。 易于大規(guī)模生產和應用于臨床。 保留抗體的抗原結合能力。基本原理： 借助基因工程手段，將編碼Ab的重輕鏈可變區(qū)基因重組到真核表達載體上并進行表達。基因工程抗體的表達基因工程抗體的表達原核細胞和酵母可以用于表達小分子抗體和抗體片段大部分完整抗體和雙鏈抗體、微型抗體等需要在CHO等哺乳動物細胞中表達利用完整的動植物體通過轉基因的方法表達外源蛋白：如利用轉基因煙草生產抗狂犬病毒抗體抗體工程的發(fā)展歷程抗體工程的發(fā)展歷程動物多克隆抗血清被抗生素所代替成份復雜，副反應嚴重鼠源單克隆抗體1975年，雜交

29、瘤技術制備單抗成功“魔彈”HAMA反應20世紀90年代初，抗內毒素單抗用于治療膿毒敗血癥遭遇失敗?？贵w藥物的研究進入低谷。分子生物學基因工程技術基因工程抗體基因工程抗體鼠源抗體的人源化及形式多樣的改造抗體抗體工程就是指利用分子生物學、基因工程等手段對抗體進行各種不同的改造并在原核、真核細胞中表達制備的工程技術。馬血清,破傷風,狂犬病1.人鼠嵌合抗體人鼠嵌合抗體（Chimeric Antibodies）原理：利用基因重組技術，把鼠抗體的重輕鏈可變區(qū)部分與人抗體重輕鏈恒定區(qū)的進行重組，減少鼠源結構，增加人源結構，而保持抗體與原抗原的特異性結合。缺點：鼠抗體部分亦能作為一種異種抗原，多次反復使用在人

30、體產生抗體及過敏反應（HAMS反應，human against mouse syndrome)。嵌合抗體可保持特異性結合和外源性抗原降低，但親和力明顯下降。Chimeric antibodies雜交瘤細胞株獲得兩個可變區(qū)克隆載體(T載體)原核表達系統(tǒng)檢測構建表達載體RT-PCR酶切測序酶切，連接轉化是是否否酶切，連接1.獲得鼠單抗重輕鏈可獲得鼠單抗重輕鏈可變區(qū)的基因片段。變區(qū)的基因片段。2. 基因片段插入含有人基因片段插入含有人IgG重輕鏈恒定區(qū)的表達重輕鏈恒定區(qū)的表達載體。載體。人鼠嵌合抗人鼠嵌合抗體的真核表體的真核表達在達在CHO細細胞胞（共轉染模式（共轉染模式和單載體轉染模和單載體轉染模

31、式）式） 3.這種嵌合抗體同鼠源抗體比較有以下兩個優(yōu)點：u 它可以按需要對抗體的效應基因進行選擇或剪切。u 在治療中使用人而不是鼠mAb的同種型，大大減小了鼠源mAb作為異種蛋白對人體的免疫原性，它通過避免抗同種型抗體的產生，減少了HAMA的生成。2.人源化抗體（人源化抗體（ humanized antibodies）Humanization or reshaping of murine antibodies is an attempt to transfer the full antigen specificity and binding avidity of murine monoclon

32、al antibodies to a human antibody by grafting the murine complementarity determining regions (CDRs) onto a human variable region framework。保留鼠CDR的人源化Ab65 to 90%可變區(qū)可變區(qū)人源化人源化CDRCDR移植移植AbAb制備原理制備原理 將鼠源mAb的6個互補決定區(qū)的氨基酸序列插入到人Ig的框架區(qū)，通常稱為CDR移植。CDR是抗體識別和結合抗原的區(qū)域，直接決定抗體的特異性。將鼠源單抗的CDR移植至人源抗體可變區(qū)，替代人源抗體CDR，使人源抗體獲

33、得鼠源單抗的抗原結合特異性，同時減少其異源性?？乖m然主要和抗體的CDR接觸，但FR區(qū)也常參作用，影響CDR的空間構型。因此換成人源FR區(qū)后，這種鼠源CDR和人源FR相嵌的V區(qū)，可能改變了單抗原有的CDR構型，結合抗原的能力會下降甚至明顯下降。目前，對CDR移植的人源化路線是： 在鼠/人嵌合抗體的基礎上，通過數據庫檢索、計算機分子模擬等尋找出有最大同源性的人可變區(qū)模板，綜合考慮表面殘基、與CDR有相互作用或對空間結構有重要影響的殘基，確定需要保留和改變的關鍵殘基，再通過模擬基因合成，表達檢測實際效果，進行必要的修正，來獲得高親和力的治療mAb。MouseHumanHumanisedhyperv

34、ariableframeworkhumanization-CDR grafting CDR residues from variable region of a mouse mAb are transferred to human antibody frameworks that have high sequence homology with the mouse counterpartsAllows specificityAllows effector functionsLess immunogenic3. 全人抗體（全人抗體（Fully human mAbs）transgenic mice

35、 Human antibody-display librariesTo make Human mAb from human being全人抗體全人抗體100%1） Transgenic mice1.首先把小鼠編碼Ig重輕鏈的基因剔除。2.制備表達人的Ig重輕鏈的轉基因小鼠。3.上二種小鼠回交，獲得只表達人Ig重輕鏈的基因的小鼠。當用抗原免疫后，小鼠可產生完全人源抗體。Creation of Fully Human mAbs From Transgenic MiceReplace murine immunoglobulin (Ig)G genes with human IgG genesWein

36、er LM. J Immunother. 2006;29:1-9.Yang X-D, et al. Crit Rev Oncol Hematol. 2001;38:17-23.Mouse strain incapable ofproducing mouse antibodiesHuman Ig lociBreedingBreedingMouse embryonic stem cells containing human antibody genesMouse strain producinghuman and mouse antibodiesMouse embryonic stem cells

37、 with inactivated mouse heavy and light chain lociMouse Ig lociMouse strain producingonly human antibodiesTransgenic mouse-advantageHave a repertoire of fully human IgG1 gave researchers an alternative route to human mAbs through active immunization, without the protocol restrictions associated with

38、 human studies. Transgenic mouse-drawbacksAs the immune response in transgenic mice is sometimes less robust than in strains that are used to generate mouse mAbs, more immunizations or antibody screens are often required.These transgenic mice cannot exactly reproduce the human antibody response beca

39、use of repertoire differences and because the genetic background ofthe murine host affects antigen processing, B-cell ontology and regulation (e.g.,tolerance mechanisms). At present, these transgenic mice are protected intellectual property and therefore not commonly available2）噬菌體抗體庫技術）噬菌體抗體庫技術(Pha

40、ge antibody library technique)把人的Ig重輕鏈可變區(qū)基因片段展示在l噬菌體表面,組成抗體庫。通過噬菌體把抗體的表型和基因型相偶聯，易進行分子克隆和基因操作?？贵w庫的來源影響篩選結果（免疫和正常人）。高通量篩選與抗原結合的抗體，但親和力低。scFv-single-chain variable fragmentsDisplay technologies-strategyPhage Display Library-Antibody library-from Immunology Today (2000), 21, 371-378 Start from human gen

41、esNew specificities?Less immunogenic? Can screen a larger repertoireLoss of combinatorial specificities Bypass immunisation naive libraryLow affinity Affinity maturation in vitroExtra steps, more immunogenic? Economical production in bacteria Only fragmentsPhage Display - advantagesPhage Display - d

42、rawbackUnnatural pairings of the antibody heavy and light chain componentsThe method of presentation of antigen as bait for panning may affect the number and distribution of available neutralizing epitopes.3）用人的骨髓瘤細胞直接制備）用人的骨髓瘤細胞直接制備全人抗體全人抗體關鍵點：建立好的人骨髓瘤細胞。穩(wěn)定性高和融合率高。(Human antibodies 2002, 11:85-96)M

43、ousemyelomaHumanmyelomaDouble selecting markers G418 and HATHuman LN B cells4）. B細胞永生化技術：用細胞永生化技術：用EB病毒將人淋巴細胞永生化病毒將人淋巴細胞永生化可產生分泌抗體的可產生分泌抗體的B細胞克隆。這一技術較為成熟，但細胞克隆。這一技術較為成熟，但是存在抗體分泌不穩(wěn)定的缺點，限制了其應用。或直接是存在抗體分泌不穩(wěn)定的缺點，限制了其應用?；蛑苯臃蛛x分泌抗體的分離分泌抗體的B細胞細胞,用用PCR獲得重輕連獲得重輕連,構建全人抗體構建全人抗體.）Single B cell RT-PCR Nature Biot

44、echnology,2008,26:886-887.the strategy of single cell RT-PCRThe time frame-one month各種全人抗體生產技術比較優(yōu)點缺點微生物表面展微生物表面展示技術示技術很成熟，體外進行抗體親和力的完很成熟，體外進行抗體親和力的完善，善，抗體的重輕鏈不是天然配對，抗體的重輕鏈不是天然配對，沒有在體外還原天然抗體的構沒有在體外還原天然抗體的構象象轉基因小鼠轉基因小鼠可以產生全人免疫球蛋白庫，不受可以產生全人免疫球蛋白庫，不受到人體試驗的限制到人體試驗的限制轉基因老鼠還是并不能生產精轉基因老鼠還是并不能生產精確的全人抗體確的全人抗體

45、EBVEBV病毒轉化病毒轉化EBVEBV病毒轉化產生的病毒轉化產生的B B細胞雜交瘤用細胞雜交瘤用于產生中和抗體，材料來源廣泛于產生中和抗體，材料來源廣泛B B細胞雜交瘤存在染色體不穩(wěn)定細胞雜交瘤存在染色體不穩(wěn)定，易丟失的缺陷，易丟失的缺陷單個單個B B細胞細胞RT-PCRRT-PCR1.1.方便方便，常規(guī)分子克隆實驗條件，常規(guī)分子克隆實驗條件2.2.快速快速，條件優(yōu)化后僅需要，條件優(yōu)化后僅需要3030天天3.3.高通量，高通量，針對抗原特異針對抗原特異抗體庫抗體庫4.4.親和力和特異性親和力和特異性：親和力：親和力很高很高，獲得針對獲得針對抗原各表位抗原各表位的抗體的抗體5.5.適用通過疫苗

46、治療的各種疾病適用通過疫苗治療的各種疾病慢期炎癥或致死性病原體如慢期炎癥或致死性病原體如HIVHIV，癌癥和自身免疫病方面應用，癌癥和自身免疫病方面應用受到限制受到限制Source of antibodies on the market(according to a “market analyst”)SourceAntigenicity% HumanMouse+0 %Chimeric+60-70%Humanised- 90%Human-100%三、抗體靶向治療的新思考三、抗體靶向治療的新思考問題1：在臨床上抗體用量大（幾百毫克到克級）， 價格昂貴。在不發(fā)達國家難于承受。問題2：由于專利限制，中

47、國難于進行me too藥仿制。解決方案：能否利用中和性抗體的靶向作用，確定能否利用中和性抗體的靶向作用，確定 抗體作用的靶點位子，用小分子替代，抗體作用的靶點位子，用小分子替代， 設計新藥？設計新藥？四、工程抗體的未來發(fā)展與展望四、工程抗體的未來發(fā)展與展望1. 單克隆抗體的市場需求單克隆抗體的市場需求 對20042011年全球治療單抗市場的分析2. 抗體藥物的應用領域抗體藥物的應用領域抗器官移植排斥反應；腫瘤導向治療； 哮喘、銀屑病、類風濕性關節(jié)炎、紅斑狼瘡、急性心梗、膿毒癥、多發(fā)性硬化癥及其他自身免疫性疾??； 心腦血管疾病；感染性疾病；其他小分子抗體小分子抗體分子量小，穿透性強，抗原性弱，表

48、達容易，易于進行基因工程改造，可用于醫(yī)學影像學分析需提高其小分子抗體的穩(wěn)定性，使重輕鏈分子在表達后能進行充分的折疊；提高與抗原的結合能力以及表達系統(tǒng)的優(yōu)化 胞內抗體、催化抗體：胞內抗體是指在細胞內表達，可以特異性結合細胞內蛋白靶點，從而起到調控細胞內信號轉導途徑，調節(jié)細胞代謝過程的小分子抗體。催化抗體又稱抗體酶，是指具有蛋白酶催化活性的抗體。該技術在有機化學領域具有很好的應用前景?？贵w藥物抗體藥物“生物導彈”特異性好，療效顯著，靶點明確，機理清楚抗體治療作用的發(fā)揮主要依靠（1）抗體與靶抗原的特異性結合（2）利用抗體的識別特異性，發(fā)揮導向作用，將效應分子“運輸”至特定區(qū)域發(fā)揮作用。 效應分子主要

49、包括三類，即放射性核素（如I131）、化學藥物（如氨甲喋呤）和植物、細菌毒素（如阿霉素、長春堿類衍生物）。另外，也有連接細胞因子、肽類分子的抗體治療劑?？贵w藥發(fā)揮治療作用的三種機制抗體藥發(fā)揮治療作用的三種機制Pharmacokinetics of intact antibodies versus fragments基因工程抗體與基因工程抗體與噬菌體噬菌體展示技術展示技術一、噬菌體展示技術的原理一、噬菌體展示技術的原理LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII基因型表達型噬菌體抗體庫的分類噬菌體抗體庫的分類噬菌體抗體是在噬菌體表面表達的抗體分子Fab或scFv, 這種表達是通過Fab段或

50、scFv與噬菌體外殼蛋白pIII或pVIII蛋白形成融合蛋白而完成其特點是它既可以識別相應抗原與之相結合, 其相應載體即噬菌體又能夠感染宿主菌進行再擴增, 將細胞全套可變區(qū)基因克隆出來, 組成噬菌體抗體的群體, 即噬菌體抗體庫。這種建立噬菌體抗體庫的全套方法即稱為噬菌體抗體庫技根據抗體基因的來源和組成不同，噬菌體抗體庫可分為天然抗體庫、免疫抗體庫、半合成抗體庫和全合成抗體庫?？乖乖删w抗體庫噬菌體抗體庫結合與洗滌結合與洗滌洗脫洗脫擴增擴增再循環(huán)再循環(huán)Amplify eluted phageRepeat selectionAnalyzea) ELISAb) Specificityc) Seq

51、uencingd) Affinitye) ActivityE.coli感染和擴增基因工程抗體表達體系基因工程抗體表達體系小分子抗體小分子抗體小分子抗體的優(yōu)點： 1. 制備方法較其他基因工程抗體簡單。 2.免疫原性要比原來的McAb弱得多。如果將改形抗體構建成小分子抗體，更有可能消除其免疫原性。 3. 由于分子量小，小分子抗體更容易通過血管壁，穿透實體瘤，有利于腫瘤的治療。 4. 由于沒有Fc段，不能與非靶細胞的Fc受體結合，更能集中到達腫瘤部位，同時由于沒有Fc調節(jié)IgG的分解代謝，在體內半壽期短 ，周轉快，有利于放射免疫成像檢查腫瘤。 小分子抗體的優(yōu)點：小分子抗體的優(yōu)點： 5. 分子小，能與分布于病毒表面凹槽的抗原結合，有利于病毒性疾病的治療。 6. 在小分子抗體基因的3