沉淀反應(yīng)說課講解

1、沉淀反應(yīng)第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗 一、單向擴散試驗一、單向擴散試驗 二、雙向擴散試驗二、雙向擴散試驗第四節(jié)第四節(jié) 免疫電泳技術(shù)免疫電泳技術(shù) 一、對流免疫電泳一、對流免疫電泳 二、火箭免疫電泳二、火箭免疫電泳 三、免疫電泳三、免疫電泳 四、免疫固定電泳四、免疫固定電泳思考題小結(jié)第一節(jié)第一節(jié) 沉淀反應(yīng)原理及特點沉淀反應(yīng)原理及特點沉淀反應(yīng)（precipitation）是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象,其特性與經(jīng)典的抗原抗體反應(yīng)相同。形成肉眼可見的大的免疫復(fù)合物。沉淀線或沉淀環(huán)的觀察以及免疫比濁法中的終點法就是測定此階段形成的復(fù)合物第一階段第二階段沉淀

2、反應(yīng)分兩個階段抗原抗體特異性結(jié)合，快速但不可見。免疫比濁法中的速率法就是利用此階段測定免疫復(fù)合物形成的速率。免疫濁度測定絮狀沉淀試驗單向擴散試驗雙向擴散試驗對流免疫電泳火箭免疫電泳免疫電泳免疫固定電泳液體內(nèi)沉淀試驗?zāi)z內(nèi)沉淀試驗?zāi)z免疫電泳技術(shù)沉淀反應(yīng)可分三類第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗 絮狀沉淀試驗是將抗原與相應(yīng)抗體混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原抗體結(jié)合形成肉眼可見的絮狀沉淀物。方法受抗原抗體比例的影響非常明顯應(yīng)用于測定抗原抗體反應(yīng)的最適比例(三種類型)一、 絮狀沉淀試驗抗原稀釋法：抗原最適比例抗體稀釋法：抗體最適比例方陣滴定法：抗原抗體最適比例絮狀沉淀試驗表表6-1 最適比方

3、陣測定最適比方陣測定法法抗體抗體稀釋度稀釋度抗原稀釋度抗原稀釋度1/101/201/401/801/1601/3201/640對照對照1/5+ + + + + + +1/10+ + + + + + +1/20+ + + + + + +1/40+ + + + +1/80+ 當(dāng)當(dāng)可溶性抗原可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定合適時，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。利用現(xiàn)代光學(xué)測量儀器對濁度進行測定從而檢利用現(xiàn)代光學(xué)測量儀器對濁度進行測定從而檢測抗

4、原含量測抗原含量。 原 理二、免疫濁度測定1. 1.抗原抗體的比例：反應(yīng)體系中保持抗體過量抗原抗體的比例：反應(yīng)體系中保持抗體過量2. 2.抗體的質(zhì)量抗體的質(zhì)量 ：特異性強，效價高，親和力：特異性強，效價高，親和力強并使用強并使用R型抗體型抗體 3. 3.抗原抗體反應(yīng)液的最適抗原抗體反應(yīng)液的最適PH為為6.56.58.5 8.5 4. 4.使用增濁劑使用增濁劑影響因素免疫濁度測定1. 1.透射免疫比濁法透射免疫比濁法2. 2.散射免疫比濁法散射免疫比濁法 3. 3.免疫膠乳比濁法免疫膠乳比濁法 分類免疫濁度測定第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗 可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴散，形成濃可溶

5、性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當(dāng)?shù)亩忍荻?，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。位置形成肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)。 常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠。酰胺凝膠。原理原理：抗體與待測的抗原,在兩者比例合適的部位結(jié)合形成沉淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原的濃度成正相關(guān)。技術(shù)要點：將抗體混入0.9%瓊脂糖內(nèi)（50），未凝固前傾注成平板，凝固后打孔（直徑35mm ），孔中加入抗原溶液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，置濕盒內(nèi)37,2448h 觀察孔周圍是否出現(xiàn)沉淀環(huán)。定量試驗 一、單向擴散試驗 （平板法

6、）傾注平板打孔加樣 放置372448h觀察沉淀環(huán) 單向擴散試驗（平板法）沉淀環(huán)的直徑與待測標(biāo)本含量兩種計算方法Mancini曲線：大分子抗原（IgM） 時間擴散48h，常數(shù)KCd2普通坐標(biāo)紙曲線 Fahey曲線：小分子抗原（IgG,IgA）擴散時間24h常數(shù)KlogCd 半對數(shù)坐標(biāo)紙曲線 C為抗原濃度， d為沉淀環(huán)直徑單向擴散試驗 （平板法）T1為1624h；T2為2448h；T3為48h以上,可見T3為直線，T1為反拋物線t1為1624h；t2為2448h；t3為48h以上,可見t1為直線，t3為反拋物線Mancini曲線Fahey曲線影響因素：影響因素：抗體質(zhì)量抗體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線 ，

7、質(zhì)控血清，質(zhì)控血清結(jié)果與真實含量不符結(jié)果與真實含量不符單克隆抗體；多克隆抗體；單克隆抗體；多克隆抗體；可出現(xiàn)假性降低與增高可出現(xiàn)假性降低與增高 雙環(huán)現(xiàn)象雙環(huán)現(xiàn)象不同擴散率抗原性相同的兩不同擴散率抗原性相同的兩個組分個組分 單向擴散試驗上排為5個不同濃度的參考品；下排為患者血清，下排右2為異常病理血清 單向擴散試驗 （平板法） 原理：將抗原抗體分別加在瓊脂糖不同的對應(yīng)孔中，兩者在凝膠中自由擴散，在比例合適處形成白色沉淀線。 技術(shù)要點：平板玻璃上傾注一層均勻的瓊脂糖薄層，凝固后打孔，孔徑為3mm，孔間距在35 mm之間，在相對的孔中加入抗原或抗體，放置濕盒371824h 后，觀察孔周圍是否出現(xiàn)沉淀

8、環(huán)。鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一 二、雙向擴散試驗 （平板法）應(yīng)用1.抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計 2.抗原或抗體相對分子量的估計 雙向擴散試驗 （平板法）應(yīng)用3.抗原性質(zhì)的分析 雙向擴散試驗 （平板法）應(yīng)用4.抗體效價的滴定 5.抗原或抗體純度的鑒定 雙向擴散試驗 （平板法）第四節(jié)免疫電泳技術(shù)第四節(jié)免疫電泳技術(shù)優(yōu)點：優(yōu)點： 1. 1.加快反應(yīng)的速度。加快反應(yīng)的速度。 2. 2.提高了靈敏度。提高了靈敏度。3. 3.增加了分辨率。增加了分辨率。 電泳分析沉淀反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的高度特異性電泳技術(shù)的高分辨率、快速、微量免疫電泳技術(shù)原理：雙向擴散+ 電泳比雙向擴散試驗靈敏度提高8

9、 16倍技術(shù)要點：制備1.2%巴比妥瓊脂凝膠板，在其上成對打孔，孔徑3mm，孔距6 mm，于陰極側(cè)孔內(nèi)加待測血清，陽性側(cè)孔加抗血清，電泳條件34mA/cm，30min1h。一、對流免疫電泳通電蛋白質(zhì)抗原常帶較強的負(fù)電荷，在電場中向正極移動抗體球蛋白帶負(fù)電荷較少，籍電滲作用向負(fù)極泳動 對流免疫電泳結(jié)果分析：結(jié)果分析：無沉淀線出現(xiàn)則表明無相無沉淀線出現(xiàn)則表明無相應(yīng)的抗原。應(yīng)的抗原。沉淀線位于抗原抗體孔中沉淀線位于抗原抗體孔中間，說明兩者比例較適合。間，說明兩者比例較適合。沉淀線偏向抗原孔一方，沉淀線偏向抗原孔一方，表示抗體濃度抗原，反表示抗體濃度抗原，反之，則是抗體濃度抗原之，則是抗體濃度抗原濃度

10、。濃度。對流免疫電泳電泳時凝膠中抗體不移動，樣品孔中的抗原向正極泳動，隨著抗原量的逐漸減少，抗原泳動的基底區(qū)越來越窄，抗原抗體分子復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個形狀如火箭的不溶性復(fù)合物沉淀峰，抗體濃度固定時，峰的高度與抗原量呈正相關(guān)。 原理單向免疫擴散電泳,定量檢測技術(shù)二、火箭免疫電泳1.2%巴比妥瓊脂糖約55，加入適量抗血清，混勻后制板，打孔，孔內(nèi)加待測樣品，樣品孔放負(fù)極側(cè)， 6h后觀察瓊脂板上沉淀峰，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測樣品濃度。技術(shù)要點火箭免疫電泳1. 1.瓊脂（無電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規(guī)瓊脂（無電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規(guī)則。則。2. 2.電泳終點時間的確定。電

11、泳終點時間的確定。3.標(biāo)本數(shù)量多時應(yīng)先通電后加樣標(biāo)本數(shù)量多時應(yīng)先通電后加樣,防止寬底峰形防止寬底峰形.4.IgG定量時，可用甲醛與定量時，可用甲醛與IgG上的氨基結(jié)合（甲酰上的氨基結(jié)合（甲?；?，抵消了電滲作用?；窒穗姖B作用。 影響因素火箭免疫電泳火箭免疫電泳圖為標(biāo)準(zhǔn)抗原；為標(biāo)本-+火箭免疫電泳示意圖原理：區(qū)帶電泳雙向擴散1、將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中電泳分成肉眼不可見的若干區(qū)帶 2、沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清進行雙向擴散 。 技術(shù)要點：制備瓊脂板打孔，加樣于孔內(nèi)，電泳23mA/cm ，0.51h后，槽內(nèi)加入相應(yīng)抗血清作雙向擴散。三、免疫電泳純化抗原和抗體成分的分析及正常

12、和異常免疫球蛋白的識別與鑒定影響因素抗原抗體比例不當(dāng),需測抗原抗體最適比 抗血清的的抗體譜 ，混合抗血清的使用電泳條件直接影響分辨率應(yīng)用免疫電泳-+免疫電泳示意圖免疫電泳原理，不同之處是將抗血清直接加于電泳后的蛋白質(zhì)區(qū)帶表面，抗原抗體在凝膠中直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，在適當(dāng)位置形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)染色后，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進行分型 原理區(qū)帶電泳沉淀反應(yīng)四、免疫固定電泳先將患者血清或血漿在醋纖膜或瓊脂上作區(qū)帶電泳，根據(jù)血清蛋白質(zhì)的電荷不同將其分開，然后將IgG、IgA、IgM、輕鏈和輕鏈的抗血清加于分離的蛋白質(zhì)泳道，參考泳道則加蛋白質(zhì)固定劑，用于區(qū)帶對照，作用一定時間后洗去游離蛋白質(zhì)，染色后則

13、可見被固定的相應(yīng)M蛋白成分。 技術(shù)要點免疫固定電泳左圖為IgG 型, 中圖為IgG 型，右為正常 SP G A M SP G A M SP G AM 免疫固定電泳示意圖分辨率強，敏感度高，操作周期短，僅需分辨率強，敏感度高，操作周期短，僅需數(shù)小時，結(jié)果易于分析。數(shù)小時，結(jié)果易于分析。 應(yīng)用最常用于M蛋白的鑒定與分型，也用于尿中本周氏蛋白質(zhì)的檢測與、 分型，腦脊液中寡克隆蛋白的檢測與分型。優(yōu)點免疫固定電泳1. 1.主要用于血液、體液中蛋白質(zhì)的測定。主要用于血液、體液中蛋白質(zhì)的測定。2. 2.優(yōu)點：穩(wěn)定性好，敏感度高，精確度高，簡便快優(yōu)點：穩(wěn)定性好，敏感度高，精確度高，簡便快速，易于自動化，無放射

14、性核素污染，適合大批量速，易于自動化，無放射性核素污染，適合大批量標(biāo)本檢測。標(biāo)本檢測。3.對流免疫電泳與火箭免疫電泳技術(shù)由于電滲的緣對流免疫電泳與火箭免疫電泳技術(shù)由于電滲的緣故已不推薦使用。故已不推薦使用。4.免疫電泳擴散時間長，影響因素多，結(jié)果不易分免疫電泳擴散時間長，影響因素多，結(jié)果不易分析。析。5.免疫固定電泳分辨力強，敏感度高，結(jié)果易于分免疫固定電泳分辨力強，敏感度高，結(jié)果易于分析，常用于析，常用于M蛋白的鑒定與分型。蛋白的鑒定與分型。 沉淀反應(yīng)在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用1.什么是沉淀反應(yīng)？什么是沉淀反應(yīng)？2.沉淀反應(yīng)的特點？沉淀反應(yīng)的特點？3.免疫濁度法的原理、方法與分類？免疫濁度法的原理、

15、方法與分類？4.單向擴散試驗的原理和應(yīng)用？單向擴散試驗的原理和應(yīng)用？5.免疫固定電泳的原理及臨床應(yīng)用價值？免疫固定電泳的原理及臨床應(yīng)用價值？6.何謂何謂Mancini曲線？曲線？7.何謂何謂Fahey曲線？曲線？8.影響免疫比濁測定的因素有哪些？影響免疫比濁測定的因素有哪些？9.抗原性質(zhì)分析出現(xiàn)哪三種結(jié)果現(xiàn)象？結(jié)果解釋？抗原性質(zhì)分析出現(xiàn)哪三種結(jié)果現(xiàn)象？結(jié)果解釋？10.自動化免疫比濁法發(fā)展趨勢和應(yīng)用前景？自動化免疫比濁法發(fā)展趨勢和應(yīng)用前景？思考題 沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出的沉淀現(xiàn)象生特異性結(jié)合而出的沉淀現(xiàn)象.根據(jù)沉淀反應(yīng)介質(zhì)和檢根據(jù)沉淀反應(yīng)介質(zhì)和檢測方法的不同，將其分為液體內(nèi)沉淀試驗、凝膠內(nèi)沉測方法的不同，將其分為液體內(nèi)沉淀試驗、凝膠內(nèi)沉淀試驗和凝膠免疫電泳試驗三大基本類型。淀試驗和凝膠免疫電泳試驗三大基本類型。 免疫濁法度測定為液體內(nèi)沉淀試驗；單向擴散試驗平免疫濁