dna復制起始謝貽冬

1、復制起始模型建立復制起始的概念病毒原核生物：大腸桿菌真核生物復制起始在細胞周期的調(diào)控DNA復制的引發(fā) 復制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一富含AT的部位叫做復制起始點(originof replication)常用ori或O表示。DNA復制起始原核生物染色體、病毒和核外DNA通常只有一個復制起點。真核生物染色體有多個復制起點，彼此相隔約3-10萬bp。DNA復制起始至少需以下三個步驟:起始蛋白識別一個或一個以上的順式作用元件 DNA雙鏈局部解旋 選擇適宜位點進行引物合成及開始聚合反應一、病毒SV40 的復制起始1、T抗原與起始核心序列特異結(jié)合2、Pola-primase復合物的亞單位 在

2、RP-A存在及ATP水解條件下,T抗原具有解旋酶活性使DNA出現(xiàn)更大范圍解鏈.起始效率與DNA構(gòu)象變化成正相關(guān)。 Pola-primase復合物含四個亞位:p180、p86、p58、p48二、原核生物的復制起始 大腸桿菌的復制起點為oriC，由245個堿基對組成，這些序列在多數(shù)細菌中高度保守，關(guān)鍵序列是3個13bp和4個bpd的重復序列參與復制起始的9個蛋白和酶蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)亞基數(shù)目亞基數(shù)目功能功能Dna A1識別起點序列，在起點特異性位置解開雙鏈Dna B6解開DNA雙鏈Dna C6幫助Dna B結(jié)合于起點HU2類組蛋白，DNA結(jié)合蛋白，促進起始引物合成酶（Dna G）1合成RNA引物單鏈結(jié)合

3、蛋白（SSB）4結(jié)合DNA單鏈RNA聚合酶5促進DnaA活性DNA旋轉(zhuǎn)酶（拓撲酶）4釋放DNA解鏈過程中產(chǎn)生的曲張力Dam甲基化酶1使起點GATC序列的腺嘌呤甲基化復制起始的過程 因為DNA聚合酶只能延長而不能開始新鏈合成，所以DnaB蛋白活化引物合成酶，先合成一小段以RNA為起始的引物（10-15bp），并最終被切除并由DNA取代。 復制時，在原點通過解旋、解鏈和SSB蛋白結(jié)合等過程，這個復制點因形狀象叉子，稱復制叉。三、真核細胞的DNA復制起始復制器的選擇：G1期A區(qū)主要由11bp的ARS共有序列(ACS)5(A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T)3組成,為復制起始所必需.B

4、區(qū)由2一3個部分重復的亞區(qū)(B1,B2等)組成，位于A區(qū)3端,不具遺傳保守性.復制起始位點的激活：S期起始識別復合物(ORC)以ATP依賴的方式特異識別ACS區(qū)和B1區(qū)并與之結(jié)合.復制器的選擇（G1）ORC識別并結(jié)合復制器募集解旋酶裝載器（Cdc6和Cdt1）ORC和裝載器募集解旋酶（Mcm 2-7復合體）最終形成前復制復合體（pre-RC)復制起始位點的激活（S）Cdk和Dbf4磷酸化pre-RC，促使DNA解旋DNA聚合酶和輔助因子與復制起始位點的結(jié)合，并合成RNA引物裝載滑動夾，聚合酶切換，開始合成前導鏈 后隨鏈模板足夠長時啟動后隨鏈的合成釀酒酵母的起始識別復合物(ORC)是一種復雜的蛋

5、白質(zhì)由六種不同的亞基-orc1，orc2，orc3，orc4，orc5，orc6構(gòu)成。ORC1和ORC5亞基含有ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可與ATP結(jié)合，但只有ORC1水解ATPOrc125這五個亞基與DNA接觸并負責結(jié)合A區(qū)，Orc6一直不與DNA接觸ScORC與起始位點結(jié)合貫穿整個細胞周期起始識別復合物在釀酒酵母中最早確定裂殖酵母的復制起始是完全不同于釀酒酵母 裂殖酵母的復制起始有一個大小為5001500 bp的序列，是釀酒酵母的510倍。 裂殖酵母起始區(qū)缺乏一個明顯的共識序列，但它們包含兩個或更多的重要序列，些非常重要的富含A-T的序列經(jīng)常是不對稱的，A在一條鏈，T在另一條鏈，這是ars3001

6、， ars3002，和ars2004起始區(qū)基因缺失造成的。 裂殖酵母的起始區(qū)也有ARS活動，使含一個起始區(qū)的質(zhì)?？稍谄渲斜３址€(wěn)定并復制。 裂殖酵母中有5001000強弱不一的復制起始點，分布在三條染色體上。 裂殖酵母ORC（sporc）有一個額外的域位于其N-末端的orc4亞基中部，這一區(qū)域包含9個AT鉤，用于結(jié)合非對稱的AT序列。 每一個裂殖酵母有兩個或兩個以上的ORC結(jié)合位點，sporc不與它的同源起始區(qū)隨機結(jié)合。 9個sporc4的AT鉤將sporc完全綁定到那些非常重要的AT豐富而不對稱的DNA序列。sporc和DNA之間的相互作用不需要ATP除了基本的ORC結(jié)合位點，裂殖酵母的起始區(qū)

7、包含另一種重要位點，是SAP1蛋白結(jié)合位點。SAP1最初被確定為是一個蛋白被綁定到一個序列的交配型開關(guān)，在復制叉穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要的作用。SAP1結(jié)合在裂殖酵母ars3001一個重要區(qū)域，綁定到一個序列（A / T）4N（C /g）（A / T）1011（C / G）（A / T）4N。像ORC一樣，在起始區(qū)可能有多個親和力不同的SAP1結(jié)合位點。復制起始在細胞周期的調(diào)控DNA復制起始在細胞周期中存在兩個調(diào)控點M/G1過渡時建立復制前染色質(zhì)狀態(tài)G1/S過渡時參與復制起始的蛋白質(zhì)因子接受周期依賴的調(diào)節(jié),直接引發(fā)DNA合成.(復制起始復合體組裝)復制前染色質(zhì)狀態(tài)相關(guān)因子：微小染色體維持基因家族MC

8、M和CDC6、周期蛋白及其依賴的激酶。酵母體系中,M-S期核內(nèi)的MCM5/CDC46作用于復制起始點,與ORC、ARS相互作用.CDC6的表達在M/G,期達到高峰,它在細胞周期的早期與ORC相互作用,提高起始點活性.哺乳類細胞中,在整個間期MCM基因產(chǎn)物都存在于核內(nèi),但它的G1期磷酸化水平與G2期明顯不同.MCM突變株ARS活性降低,復制難以起始. 在芽殖酵母中，ORC作為加載墊將Cdc6聚集在G1期的早期。 然后，ORC和CDC6一起激活CDT1MCM形成前復制復合體。 MCM加載出現(xiàn)重復，意味著每個起始點都裝上了幾個MCM分子，作為復制叉出現(xiàn)損傷或障礙時的備份，以順利完成復制。 MCM加載

9、到DNA不再需要ORC和CDC6輔助的輔助。 在裂殖酵母，前復制復合體也需要ORC，Cdc18、CDT1、MCM和一個必不可少的額外蛋白SAP1。 ORC和SAP1共同作用才能激活CDT1 SAP1是一個新發(fā)現(xiàn)的復制起始蛋白直接參與前復制復合物組裝，參與pre-RCs對Cdc18的加載。Cdt1和Cdc18加載到起始區(qū)后，這兩種蛋白質(zhì)共同負載MCM，與起始區(qū)結(jié)合完成前復制復合物的組裝。CDKs可防止重復復制：協(xié)調(diào)復制和細胞周期.1、防止復制蛋白在G2期與復制起始點結(jié)合；2、CDK活性增高使細胞進人S期： S期的高濃度CDK將抑制蛋白因子在起始點的繼續(xù)組裝.這樣,當在M/G1期組裝于起始點的起始

10、復合物經(jīng)復制被破壞后,細胞在S、G2期不能重新組裝起始復合物.因而從M期到Gl期限制點這段時期內(nèi),由于原有周期蛋白降解,新的周期蛋白還未合成,CDKS活性較低有利于復制前狀態(tài)的建立和維持.周期蛋白及其依賴的激酶CDK的調(diào)解作用DNA復制起始的引發(fā) 酵母體系在生長因子等刺激下,G1期周期蛋白1、2和3活躍表達和積累，使細胞得以通過起始點（START）.起始點與S期間有兩點聯(lián)系:1、B型周期蛋白5和6依賴起始點的表達.它們可與周期蛋白依賴的激酶CDC28,CDK抑制因子P40形成復合物.2、該復合物被依賴起始點的P40降解激活.CDC28可使RP-A、CDC7等磷酸化.CDC7活化后在晚G1期磷酸化，調(diào)節(jié)ORC、MCM或其他蛋白質(zhì),激活DNA復制哺乳動物細胞內(nèi)不止一種CDC(CDK)和周期蛋白參與這一過程 G0期哺乳類細胞受生長因子刺激后,周期蛋白D出現(xiàn)早于周期蛋白E.周期蛋白D和它的mRNA不穩(wěn)定.去除生長因子后,水平迅速下降.周期蛋白D可與CDK2、CDK4、CDK5結(jié)合,在細胞周期內(nèi)發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用:a.刺激Gl期進行.b.確保DNA不提前復制. 周期蛋白E的水平在G1/s過渡期最高.周期蛋白E可以結(jié)合并磷酸