研究生-組織化學(xué)概論2

1、病理學(xué)技術(shù)-組織化學(xué)病理學(xué)教研室王 弦組織切片法 不同的切片制備方法，其切片方法也有較大的差別，組織切片法包括石蠟切片法、冰凍切片法、火棉膠切片法、石蠟包埋半薄切片法、樹脂包埋薄切片法和大組織石蠟切片法等。 常用的切片工具包括組織切片機(jī)、切片刀和自動(dòng)磨刀儀器等。石蠟切片法 石蠟切片機(jī)Lecia RM2235旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)具體使用及技巧1. 切片機(jī)結(jié)構(gòu)簡介：2. 安全性能操作切片機(jī)對操作者而言具有潛在的危險(xiǎn)性，在更換刀具和樣品的時(shí)候，手很容易被割傷，因此在整個(gè)操作過程中，安全性是非常有必要 再三強(qiáng)調(diào)的。手輪鎖 一般切片機(jī)都會(huì)有手輪安全鎖（3），可以將手輪鎖定在任意位置。防止手輪意外被觸及

2、而帶動(dòng)樣品頭升降。 而有第二手輪鎖（5）的切片機(jī)不僅更能確保安全性，還提高了使用的便利性。第二手輪鎖職能將手輪把手鎖定于最高點(diǎn)，即樣品頭鎖定 于距離刀/刀片最遠(yuǎn)的位置，留出足夠空間更換刀具和樣品。操作者在切片過程中，單手就可以將手輪鎖定/解鎖。 刀架保護(hù)裝置 無論是鋼刀刀架還是一次性刀片架，刀架上必須配備結(jié)合牢固的護(hù)刀器（7）（9），在更換樣品或者暫時(shí)不進(jìn)行切片的時(shí)候，護(hù)刀器必 須蓋在刀架上。好的護(hù)刀器必須跟隨刀架一同側(cè)向移動(dòng)，有效覆蓋刀鋒的全長。 3. 切片機(jī)功能簡介： 回縮功能回縮功能開啟，切片行程中當(dāng)樣本頭上升到最高點(diǎn)時(shí)，樣品頭向刀架反方向回退200m，防止刀刃和樣品的互相接觸或摩擦。樣

3、品頭定位裝置：帶有0位指示器（32）的樣品頭定位裝置能以最便捷的方式矯正蠟塊/樣品的平面，直到和刀刃平行。鎖桿（29）用來緊固/放松樣 品頭定位器，旋轉(zhuǎn)旋紐（30）可以使定位器作南北向旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)旋紐（31）可以是定位器作東西向旋轉(zhuǎn)。每個(gè)方向最多旋轉(zhuǎn)8，旋 紐上標(biāo)有刻度，每旋轉(zhuǎn)一圈可控制樣品頭旋轉(zhuǎn)2。刀架（一次性刀片架）（9）護(hù)刀器，切片時(shí)翻下，更換樣品或結(jié)束切片時(shí)，一定要翻上，覆蓋住刀刃。（10）壓板控制鎖桿，緊固/放松刀片（11）刀架側(cè)向移動(dòng)控制鎖桿刀架需要定期拆開進(jìn)行清潔以確保切片良好工作狀態(tài)。以下是清潔步驟：1.翻下護(hù)刀器(9)。2.向前旋轉(zhuǎn)側(cè)向移動(dòng)鎖桿（11），并向外拉出鎖桿。3.連同

4、壓板（83）一起，推動(dòng)刀架底盤（86），直到底盤和壓板一起從刀架弧形基座（87）上取下。4.向下旋轉(zhuǎn)壓板控制鎖桿（10），并將鎖桿向外拉出。5.取下壓板（83）。6.擦拭刀架的所有部件。（請不要使用二甲苯或含有酒精的清洗液，比如玻璃清潔液。）7.擦干所有部件并重新安裝回原樣。8.清潔所有活動(dòng)部件后，在部件上涂上薄層的機(jī)油。9.在安裝壓板（83）時(shí)，必須保證壓板上緣和刀架底座的后緣平行且在同一水平。調(diào)節(jié)刀架的間隙角(1)刀架的刻度0、5、10是用來提示刀的間隙角。位于刀架的右側(cè)。(2)在刀架底座上也有相應(yīng)的刻度，在調(diào)節(jié)間隙角時(shí)候可以參考。(3)用專用六角扳手?jǐn)Q松螺絲，刀架就可以移動(dòng)。(4)移動(dòng)刀

5、架，直到刀架底座上刻度線對準(zhǔn)刀架上指定的讀數(shù)。放大圖示中顯示的間隙角讀數(shù)為5。(5)保持刀架的位置，然后重新用扳手緊固螺絲。樣品夾常見樣品夾一般分夾蠟塊的標(biāo)準(zhǔn)樣品夾和夾包埋盒的通用樣品夾。 標(biāo)準(zhǔn)樣品夾 特殊樣品夾 如果需要夾圓柱形或球形樣品，可以在標(biāo)準(zhǔn)樣品夾的基礎(chǔ)上配合使用V型插件，可確保樣品固定恰當(dāng)。 組織經(jīng)石蠟包埋制成的蠟塊，用切片機(jī)制成切片的過程稱為石蠟切片法。 現(xiàn)在病理診斷最常用的制作切片的方法。 在切片前應(yīng)先切去標(biāo)本周圍過多的石蠟（修塊），但也不能留的太少，否則易造成組織破壞，連續(xù)切片時(shí)分片困難。 一般切46um的切片，特殊情況可切12um。 要觀察病變的連續(xù)性可制作連續(xù)切片。除此之

6、外，石蠟包埋的組織便于長期保存，因此石蠟切片仍是目前各種切片制作方法中最常用、最普遍的一種方法。一、切片前的準(zhǔn)備1. 固定后的標(biāo)本經(jīng)脫水透明浸蠟和包埋以后，制成蠟塊。2. 石蠟切片是以石蠟作為組織的支持媒介作用。應(yīng)先將包埋的每塊組織周圍過多的石蠟切去，組織四周留2mm的石蠟邊。3. 檢查切片刀是否鋒利。4. 待切蠟塊用冰塊冷卻，或置于冰箱中冷卻， 以增強(qiáng)其硬度。5. 將切片漂烘儀調(diào)至48，對水中的氣泡，礦 物質(zhì)雜質(zhì)和殘留的組織碎屑應(yīng)及時(shí)的除去。6. 準(zhǔn)備載玻片，毛筆，鑷子，鉛筆。二、常規(guī)的制片室應(yīng)準(zhǔn)備以下用品清潔的載玻片恒溫烤片機(jī)大、中號優(yōu)質(zhì)狼毫毛筆眼科彎鑷子，鉛筆展片盆、染色架三、切片的制作

7、過程 將預(yù)先冷卻的組織裝在切片機(jī)固定器上。 切片組織經(jīng)過粗切，待組織充分切完整，右手旋動(dòng)切片機(jī)把，切片帶出來之后，用毛筆輕輕托起，再用眼科鑷輕攝蠟片，以正面放入展片盆中，待攤平整后撈片。 撈片在載玻片上的二分之一以處。 切片附貼后，放在空氣中稍涼干，即可進(jìn)行烤片。四、切片的注意事項(xiàng) 凡是陳舊、腐敗或干枯的組織不易制好切片。 固定失時(shí)或固定不當(dāng)?shù)慕M織，染色時(shí)常出現(xiàn)核質(zhì)著色較淺、輪廓不清，出現(xiàn)不等的片狀發(fā)白區(qū)。 組織脫水，透明和浸蠟過度，會(huì)造成過硬、變脆，特別是動(dòng)物組織應(yīng)嚴(yán)格控制。 切片出現(xiàn)橫皺紋常多見于組織固定不牢，或切片刀固定不緊。 切片刀不鋒利，切片時(shí)會(huì)自行卷起或皺起，更不能順利地將切片聯(lián)結(jié)

8、成蠟帶。切片刀如有缺口存在，更易造成切片斷裂、破碎、不完整等現(xiàn)象。 組織切片機(jī)各個(gè)零件和螺絲應(yīng)旋緊，否則將會(huì)產(chǎn)生震動(dòng)，以致切片厚薄不均。靜電的消除 在冬天，靜電是很常見的，如果增加環(huán)境的濕度，靜電很容易被消除（在室內(nèi)燒水）。用干燥紙摩擦工作區(qū)域也會(huì)有所幫助。冰凍切片法冰凍切片機(jī)Lecia CM1900雙壓縮機(jī)式冰凍切片機(jī) 冰凍切片在組織學(xué)技術(shù)中應(yīng)用范圍較廣，對病理學(xué)中的臨床手術(shù)的快速診斷其意義更大。 冰凍切片不經(jīng)過各級乙醇的脫水及二甲苯的透明等過程，因此對于脂肪和類脂的保存較好，在進(jìn)行脂肪染色和神經(jīng)組織髓鞘的染色時(shí)常用。 冰凍切片利于一些抗原的檢測，比如做免疫熒光檢測，需要利用冰凍切片，因石蠟

9、切片會(huì)使抗原產(chǎn)生交聯(lián)。一、直接冰凍切片法 冰凍切片多用于新鮮組織、低溫冰箱冷藏的組織塊等。組織塊可以不經(jīng)任何的包埋劑或用甲基纖維素（OCT）包埋后，直接放在制冷臺(tái)上冷卻后進(jìn)行切片。1. 二氧化碳冰凍切片法2. 甲醇制冷器3. 半導(dǎo)體制冷冰凍切片法4. 恒冷箱切片 Lecia CM1900了解內(nèi)容二、明膠冰凍切片法 明膠包埋法一般用于冰凍切片易碎的組織，特別是某些有樹突狀突起的組織，當(dāng)切片入水以后常引起分散，甚至產(chǎn)生丟失，某些間歇較多的組織，也可因結(jié)構(gòu)散亂而失去固有的聯(lián)系，形成移位。 明膠冰凍切片可避免以上情況的發(fā)生。步驟： 參考教科書P21三、冰凍切片粘片法1. 蛋白甘油粘片法2. Lilli

10、e明膠粘片法3. 酒精明膠粘片法四、冰凍切片注意事項(xiàng)1. 所有試劑和機(jī)器都要處于可供使用的狀態(tài)2. 切去的組織塊大小適宜，厚度小于2mm，并盡快置于冰凍切片機(jī)上制備切片3. 調(diào)節(jié)冰凍程度，試切合適時(shí)便迅速切片，冰凍不足無法切片，冰凍過度切片易碎4. 固定：切片后應(yīng)立即投入甲醇中固定，否則會(huì)造成細(xì)胞的退變，固定液有很多種（乙醚酒精，酒精冰醋酸，甲醇，乙醇，丙酮），但是經(jīng)過實(shí)踐認(rèn)為，甲醇作用快，受縮小，染色較清晰，是最理想的固定劑，如加5%冰醋酸，效果更好。5. 包埋劑：可用普通膠水代替，最好加入適量 的水（膠水：水2：1）6. 做冰凍切片應(yīng)帶手套，防止感染，注意不要切到手！7. 切片一般在5um

11、.8.切片要完整，不要有皺褶，染色要清晰，防止有冰晶（托盤要放入機(jī)箱待用，OCT盡量少一些，要用冷錘） 補(bǔ)充要點(diǎn)：關(guān)于切片質(zhì)量1、冰晶多：這是最普遍的現(xiàn)象，主要原因是冷凍速度慢：（1）將標(biāo)本托盤放在外面，這是錯(cuò)誤的，熱的托盤會(huì)延長冷凍的時(shí)間，增加冰晶的產(chǎn)生。（2）膠放得太多，同樣也會(huì)延長冷凍的時(shí)間。冰晶會(huì)使診斷產(chǎn)生誤診，特別是軟組織腫瘤和含水量較高的組織。2、細(xì)胞退變：切片粘在玻片上要立即固定，固定時(shí)間越快，細(xì)胞退變越少，從固定速度上看，甲醇是最快也是最好的。3、細(xì)胞收縮： 用電吹風(fēng)吹或用丙酮固定，都會(huì)引起細(xì)胞收縮，但如果沒有對照，不是很明顯。4、染色較淺： 主要是蘇木素的染色時(shí)間 應(yīng)該用顯微

12、鏡觀察一下5、切片有很多空洞： 主要是肝臟，由于動(dòng)物冷凍后發(fā)脆，粗切時(shí)肝組織呈大塊大塊的粉狀，肝切片上有很多的小白點(diǎn)（即肝組織掉出），這就要求我們多細(xì)切幾下。6、皺折： 主要是選擇展片的方法不一樣造成：有的 用毛筆慢慢拉下在切片臺(tái)上，然后用玻片粘；有的用毛筆在組織塊成小卷后拉開，然后用玻片粘；這二種情況在組織好切，心情平各時(shí)，也能做出好片子。但在比賽時(shí)，腎上腺素較高，手多多少少會(huì)顫抖，容易造成拉力不均勻，導(dǎo)致切片出現(xiàn)小皺。還有組織邊上留膠太少，會(huì)造成組織邊緣出現(xiàn)皺折。7、組織發(fā)脆： 冰凍切片機(jī)冷凍室的溫度冬天一般設(shè)在19，夏天設(shè)在22 不同的組織，對溫度要求不一樣，肝臟和甲狀腺15 ，脂肪組織

13、35 如果遇到組織有很多的裂痕 ，說明溫度過低，可用手指稍微去摸一下 冰脆：核退變：冰晶多 冰晶少大組織石蠟切片法 制備大組織塊可觀察完整的組織病變情況，以及保持結(jié)構(gòu)上的連續(xù)性。有時(shí)在病理診斷上有重要的意義。 因?yàn)橛行┎∽冊谌庋凵蠠o法分辨正常組織和病變組織的界限，尤其像甲狀腺組織腫瘤，觀察有無胞膜浸潤或胞膜是否完整，如不用大塊組織，則必須將一完整腫瘤的斷面分成若干小組織塊，如果包埋不當(dāng)或者切面不正，則無法全面觀察病變組織的分布情況而影響診斷。因此制備大組織石蠟切片很有必要。制備方法：1. 固定后取材2. 沖洗3. 脫水，透明，浸蠟 表格參考P174. 包埋5. 切片：大塊組織切片較難，可采用以

14、下方法較少阻力（1）包埋可采用5254的石蠟，以減少一些硬度。（2）切片前蠟塊不需要冰箱內(nèi)冷卻，防止過硬（3）切片刀要鋒利，組織蠟塊稍傾斜，以較少阻力。6. 展片和烘片7.染色8.觀察其它切片法1. 塑料切片法 塑料包埋組織的切片方法與常規(guī)切片方法相同。可同時(shí)進(jìn)行光鏡和電鏡的檢測，定位準(zhǔn)確。塑料包埋切片的厚度可達(dá)0.52um（半薄切片）。 塑料切片主要用于免疫電鏡的超薄切片前定位。包埋前染色的標(biāo)本，切半薄切片后不需染色，直接在相差顯微鏡下觀察。免疫反應(yīng)部位成黑點(diǎn)狀，定位后進(jìn)一步做超薄切片，這樣可明顯提高免疫電鏡陽性檢出率。2. 碳蠟（PEG）切片 按石蠟切片法切片，但在操作中注意碳蠟塊盡量不要

15、接觸水和冰塊，儲(chǔ)存應(yīng)密封干燥冷藏 該方法的缺點(diǎn)是夏季室溫高時(shí)，切片困難，連續(xù)切片不如石蠟切片容易，碳蠟吸水性較強(qiáng)，也不易長期保存。3. 超薄切片 用于電鏡標(biāo)本的制備4. 石蠟包埋半薄切片法 同常規(guī)方法，但切片刀要鋒利，最好用一次性刀片，氣溫高時(shí)，可將蠟塊和切片刀冷卻后切片。HE染色染色 蘇木精 伊紅染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ，簡稱HE染色法 ，石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一 。蘇木精染液為堿性 ，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色 ；伊紅為酸性染料 ，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色 。HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中

16、最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。 試劑配置試劑配置vA：0.51% 的伊紅酒精溶液： v稱取伊紅Y 0.51 g，加少量蒸餾水溶解后，再滴加冰醋酸直至漿糊狀。以濾紙過濾，將濾渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工業(yè)酒精，如果不怕浪費(fèi)，用無水乙醇配制也可）100毫升溶解。 vB：蘇木素染液配方：v蘇木精 2g v無水乙醇 250 ml v硫酸鋁鉀 17.6 g v蒸餾水 750 ml v碘酸鈉 0.2 g v冰醋酸 20 ml 配制方法：將蘇木素溶于無水乙醇，再將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水.兩溶液溶解后將其混合，加入碘酸鈉，最后加入冰醋酸。C：1%鹽酸酒精分化液：將1毫升濃鹽酸加入99毫升70%酒精中即可。

17、分化：分化：用某些試劑，將過度染色或者不需要著色的組織成分上的顏色除去。藍(lán)化：藍(lán)化：用明礬蘇木素液深染細(xì)胞核后，通過鹽酸乙醇的分化，切片從酸性環(huán)境中（此時(shí)，切片呈紅褐色）轉(zhuǎn)移至流水中使之變藍(lán)的過程。明礬蘇木素液這種紅變藍(lán)的現(xiàn)象，本質(zhì)上是染料蘇木紅加鋁（藍(lán)色色精）之間的結(jié)合或者中斷關(guān)系。一般來講，在酸性環(huán)境中，使深藍(lán)色的色精處于離子狀態(tài)，此時(shí)為紅色，這種現(xiàn)象稱色精形成中斷。相反，紅色離子狀態(tài)的色精，在堿性環(huán)境中（相對地說）處于結(jié)合狀態(tài)，這種現(xiàn)象稱色精形成，并呈藍(lán)色。v染色流程染色流程v(1)二甲苯（） 10min v(2) 二甲苯（） 10 min v(3)100%乙醇（） 1min v(4)1

18、00%乙醇（） 1min v(5)80%乙醇 2min v(6)蒸餾水 1-2min v(7)蘇木精液染色 5 min v(8 ) 流水稍洗去蘇木精液 1-3 s v(9) 1%鹽酸乙醇 1-3 s (11)流水沖洗10min v(12) 0.5%伊紅液染色 1-3 min v(13) 蒸餾水稍洗 1-2 s v(14) 80%乙醇稍洗 1min v(15) 95%乙醇（） 1min v(16) 95%乙醇（） 1minv(17) 無水乙醇 1min v(18) 無水乙醇 1min v(19) 二甲苯（） 1min v(20) 二甲苯（） 1min v(21) 二甲苯（） 1 min v(22

19、) 中性樹膠封固 v冷凍切片HE染色步驟： v（1）冰凍切片固定 1030 s v（2）稍水洗 12 s v（3）蘇木精液染色（60） 3min v（4）流水洗去蘇木精液 510 s v（5）1%鹽酸乙醇 13 s v（6）稍水洗 12 s v（7）促藍(lán)液返藍(lán) 510 s v（8）流水沖洗 1530 s v（9）0.5%曙紅液染色 30s v（10）蒸餾水稍洗 12 s v（11）80%乙醇 10 s v（12）95%乙醇 10 s v（13）無水乙醇 10 s v（14）無水乙醇10 s v（15）二甲苯（） 10 s v（16）二甲苯（） 10 s v（17）中性樹膠封固。 v染色結(jié)果：細(xì)

20、胞核藍(lán)色，胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維和紅細(xì)胞呈深淺不一的紅色 v注意事項(xiàng)：v1.脫蠟v2.烤片溫度和時(shí)間v3.染色時(shí)間，根據(jù)試劑新鮮程度v4.鹽酸乙醇分化必須控制時(shí)間，分化可以選擇溫水v5.脫水必須充分v6.透明必須充分，封片盡量濕封常用的特殊染色v一、特殊染色的意義v1.顯示HE染色切片中看不到的目的物v2.區(qū)別HE染色切片中一些難以鑒別的病變v3.使HE染色切片中不明顯或容易被忽略的 目的物變得明顯易見v二、特殊染色的分類v結(jié)締組織、肌肉組織、神經(jīng)組織、脂類物質(zhì)、糖類、色素類、病理的內(nèi)源性沉著物、病原微生物、內(nèi)分泌、單種細(xì)胞、性染色質(zhì)、骨、血液、造血組織、核酸、酶類等v三、特殊染色的命名v1、

21、按發(fā)明者的姓名命名v2、按所用染色劑命名v3、按顯示的目的物命名v4、采用混合性命名v四、學(xué)習(xí)特染技術(shù)應(yīng)掌握的重點(diǎn) （注意事項(xiàng)）（1）染色方法的成敗，應(yīng)該在溫度、濃度、時(shí)間和PH值等方面找原因。（2）注意特染的應(yīng)用范圍，如某種病變應(yīng)用什么方法染色才能達(dá)到目的，一般先在HE切片所見的要求去選擇適當(dāng)?shù)奶厝痉椒ǎ环N或多種。 （3）必須掌握各種特殊染色的結(jié)果，避免導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論或嚴(yán)重的誤診，如在網(wǎng)染時(shí)把膠元纖維誤以為網(wǎng)狀纖維。（4）盡量要陽性切片作對照，便于選擇特染方法，并與HE切片作對照。（5）特染的組織，在其固定、脫水根據(jù)要求選擇。所用的器皿都必須化學(xué)清洗。v三、玻璃器皿的清潔 在病理實(shí)驗(yàn)室可用

22、的玻璃器皿，都必須經(jīng)過清洗干凈才能使用，清洗的方法依玻璃器皿的新舊而不同。v1、新購玻璃器皿的處理 對于新購買的玻璃器皿應(yīng)先用洗衣粉浸泡洗刷，自來水沖洗后再用12%鹽酸水溶液浸泡數(shù)小時(shí)后，用自來水沖洗干凈，必要時(shí)可用少量蒸餾水洗2次。v2、使用后玻璃器皿的處理 每次使用后的玻璃器皿都必須及時(shí)徹底清洗干凈，以供下次實(shí)驗(yàn)之用，如輕視這一步驟，可用的玻璃器皿不夠干凈，則會(huì)影響染色效果，甚至導(dǎo)致染色失敗，特別在酶組化和銀離子反應(yīng)操作過程中更有嚴(yán)格的要求，使用后的玻璃器皿在一般清洗后，還要求用硫酸清洗液浸泡。v硫酸清洗液配制重鉻酸鉀 80g自來水 1000ml濃硫酸（工業(yè)用） 120m新配制的清潔液為紅

23、褐色，反復(fù)使用一段時(shí)間后，慢慢變成綠色，說明清潔液已失敗，不能繼續(xù)使用應(yīng)重新配制。v3、玻璃器皿的清洗方法 任何玻璃器皿都必須用自來水沖洗，然后把殘余藥液或染液洗去。 用毛刷沾洗衣粉擦干凈。 自來水沖洗，蒸餾水洗2次。 把晾干的器皿輕輕置入清潔液浸泡數(shù)日。 取出器皿，用自來水把器皿內(nèi)外徹底沖洗干凈，最后用蒸餾水洗2次。 把玻璃器皿倒置于有孔架上自然晾干或溫箱中烤干，最后存放櫥內(nèi)備用。糖類 單糖單糖糖類糖類 雙糖雙糖 淀粉淀粉 植物界植物界 多糖多糖 纖維素纖維素 糖原糖原 動(dòng)物組織（動(dòng)物淀粉）動(dòng)物組織（動(dòng)物淀粉） 中性粘多糖中性粘多糖粘多糖粘多糖 酸性粘多糖酸性粘多糖v一、糖原一、糖原v糖原的

24、分布糖原的分布v糖原染色的應(yīng)用糖原染色的應(yīng)用v1、診斷糖原累積病、診斷糖原累積病v2、糖尿病的診斷及研究、糖尿病的診斷及研究v3、證明與鑒別細(xì)胞內(nèi)空泡狀變性、證明與鑒別細(xì)胞內(nèi)空泡狀變性v4、用于某些腫瘤的診斷與鑒別、用于某些腫瘤的診斷與鑒別v 糖原染色的種類糖原染色的種類v1、過碘酸、過碘酸 Schiff 反應(yīng)（反應(yīng)（PAS）v2、碘染色、碘染色v3、胭脂紅染色法、胭脂紅染色法v 糖原染色原理糖原染色原理v 糖原染色法、過碘酸糖原染色法、過碘酸 Schiff反應(yīng)反應(yīng)（PAS）v二、粘多糖二、粘多糖v 分類與分布分類與分布v1、分類、分類 ：中性粘多糖：中性粘多糖 氨基已糖氨基已糖 游離已糖基游

25、離已糖基 酸性粘多糖酸性粘多糖 氨基已糖氨基已糖 各種酸根各種酸根v分布分布 : 中性粘多糖中性粘多糖 胃粘膜表面上皮胃粘膜表面上皮 十二指腸腸腺等十二指腸腸腺等 酸性粘多糖酸性粘多糖 呼吸道的杯狀細(xì)胞呼吸道的杯狀細(xì)胞 消化道的杯狀細(xì)胞消化道的杯狀細(xì)胞 v（二）粘液物質(zhì)染色的應(yīng)用（二）粘液物質(zhì)染色的應(yīng)用v1、證實(shí)及鑒別胃粘膜的腸上皮化生、證實(shí)及鑒別胃粘膜的腸上皮化生v2、研究胃癌的組織發(fā)生、研究胃癌的組織發(fā)生v3、粘液病和粘液肉瘤、粘液病和粘液肉瘤v4、軟骨粘液樣纖維瘤、粘液胚胎性橫紋肌肉、軟骨粘液樣纖維瘤、粘液胚胎性橫紋肌肉瘤瘤v5、鑒別粘液表皮樣癌與鱗狀細(xì)胞癌、鑒別粘液表皮樣癌與鱗狀細(xì)胞癌

26、v6、鑒別粘液腺癌與未分化鱗癌、鑒別粘液腺癌與未分化鱗癌v（三）粘液物質(zhì)染色方法（三）粘液物質(zhì)染色方法v阿利新蘭過碘酸雪夫氏反應(yīng)（阿利新蘭過碘酸雪夫氏反應(yīng)（AB/PAS）v (四四) 粘液物質(zhì)染色原理粘液物質(zhì)染色原理v（五）粘液物質(zhì)染色（五）粘液物質(zhì)染色脂類染色一、脂類的定義 脂類是油脂、類脂以及它們的衍生物的總稱。脂類物質(zhì)簡稱脂質(zhì)。二、脂類的性質(zhì) 1.化學(xué)性質(zhì) 脂類中最多是真正的脂肪（油），是脂肪酸和甘油形成的。在性質(zhì)上它通常是三個(gè)脂肪酸分子（飽和或不飽和的）與一個(gè)甘油分子相結(jié)合形成的甘油三酯。 絕大多數(shù)自然存在的甘油三酯是混合的甘油三酯，就是說它們是含有兩個(gè)或三個(gè)不相同的脂肪酸。還有少部分

27、的簡單甘油三酯，它們是含有同一種脂肪酸的甘油三酯。v2.物理性質(zhì)v 脂類的比重小于1，所以比水輕，根據(jù)室溫及其 熔點(diǎn)呈固態(tài)或液態(tài)。熔點(diǎn)取決于兩個(gè)因素：一是脂肪酸的鏈長（增加而升高）；另外就是脂類的飽和程度（增加而升高）。v3.存在形式v（1）.儲(chǔ)存脂質(zhì)儲(chǔ)存脂質(zhì)：大量存在于脂肪細(xì)胞中，廣泛分布于皮下、 大網(wǎng)膜、 腸系膜、 腎和胰等臟器周圍以及肌間組織等處。儲(chǔ)存脂質(zhì)具有支持、保護(hù)、維持體溫等作用，并參與能量代謝，故又稱為能量庫。v（2）.基本脂質(zhì)基本脂質(zhì)：存在于細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞原生質(zhì)的組成部分或形成某種特殊的結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、線粒體、髓鞘。脂質(zhì)往往和組織的蛋白質(zhì)結(jié)合而形成脂蛋白。v三、脂類的類型v 脂

28、類分為油脂、類脂及其衍生物。油脂（單純脂）就是油和脂肪的統(tǒng)稱。v1.中性脂肪（脂肪）：又稱甘油三酯，是甘油和脂肪酸所形成的脂。脂肪又分為簡單甘油三酯和混合甘油三酯。v2.類脂（復(fù)合脂）：磷脂、糖脂、膽固醇及其酯。v3.衍生脂類：上述脂類的水解產(chǎn)物，包括脂肪酸及其衍生物、甘油、鞘氨醇等。蘇丹III染色法一、原理 蘇丹染料對脂肪染色的機(jī)制一般認(rèn)為是物理學(xué)上的溶液作用或吸附作用，借溶液作用使脂肪染色，即先把蘇丹染料溶于有機(jī)溶劑中，這種染料在冰凍切片內(nèi)脂質(zhì)的溶解度較在原有溶劑中的溶解度更大，所以在染色時(shí)染料就從有機(jī)溶劑中轉(zhuǎn)移入脂質(zhì)中而使脂肪顯示顏色。二、固定 10%甲醛溶液三、試劑配制 蘇丹III染液

29、：蘇丹0.15g，60%70%乙醇 100ml。將蘇丹60%70%乙醇或 60%70%乙醇與丙酮的等量飽和混合液，此溶液配制完畢后應(yīng)充分溶解，形成飽和沉淀液作為備用液。若臨時(shí)配制需過濾后才能使用。注意事項(xiàng)： 1、使用備用液時(shí)不能搖動(dòng)試劑瓶，應(yīng)緩慢傾倒。 2、盛放此溶液的容器需塞緊蓋嚴(yán)，防止揮發(fā)導(dǎo)致染色時(shí)沉淀。四、染色步驟v1.冰凍切片厚8-18umv2.蒸餾水稍洗v3.Harris蘇木素液中染約1minv4.自來水洗后，用0.5%鹽酸乙醇分化，再水洗直至細(xì)胞核返藍(lán)為止v5.蒸餾水洗后移入70%乙醇內(nèi)浸洗一下v6.浸入蘇丹III染液中約30min或更長時(shí)間。若置于56溫箱中可適當(dāng)縮短時(shí)間v7.在

30、70%乙醇中分化數(shù)秒鐘v8.將切片浸于蒸餾水里，待組織片上的乙醇洗凈，然后用玻璃棒挑撈切片貼在載玻片上v9.待切片在空氣中稍晾干或用冷風(fēng)機(jī)吹稍干v10.及時(shí)用甘油明膠封片五、染色結(jié)果 脂肪呈紅色，胞核呈藍(lán)色油紅O染色法一、原理利用染料易溶于脂質(zhì)的性質(zhì)證明組織脂質(zhì)含量的多少二、固定10%甲醛、甲醛鈣固定液三、試劑配制油紅O染色原液：油紅O 0.5g,異丙醇（含量98%以上）100mL充分溶解后作為儲(chǔ)存液（染色原液）。臨用時(shí)取染色原液6mL加蒸餾水4mL，稀釋，靜置5-10min后過濾，次液保存不得超過1-2h四、染色步驟v1.冰凍切片厚8-18um，后進(jìn)行水洗v2.置于密封容器盛裝的脂肪染色劑內(nèi)

31、（稀釋后的油紅染液）10-15minv3.用60%的乙醇分色v4.水洗v5.在Harris或其他蘇木素淡染 30sv6.用水或者1%的磷酸氫二鈉沖洗至變藍(lán)v7.附貼與載玻片上，稍干v8.用甘油明膠封固五、染色結(jié)果 脂肪呈紅色，胞核呈藍(lán)色網(wǎng)狀纖維染色1、定義 網(wǎng)狀纖維（reticular fiber ）是一種纖細(xì)的纖維。它穿行于網(wǎng)狀細(xì)胞體和突起分支，并互相交織成網(wǎng)，因而被稱為網(wǎng)狀纖維，又因這種纖維對銀的浸染著色特別顯著。故又稱為嗜銀纖維。 2、形成 它的形成主要是在纖維母細(xì)胞的粗面內(nèi)漿網(wǎng)中，合成可溶性膠原。在醛糖、類脂的作用下，形成可溶性膠原，隨后它被分泌到細(xì)胞外，在基質(zhì)中（或在細(xì)胞的表面）通過

32、原膠原蛋白分子間的交聯(lián)，聚合成為不溶性的膠原原纖維即網(wǎng)狀纖維。3、特點(diǎn) 網(wǎng)狀纖維纖細(xì)，直徑0.2-1m,沒有彈性，而有韌性，能抵抗胃液的消化和弱酸的腐蝕。它的主要成分也是膠原蛋白，在電鏡下也有膠原原纖維特有的周期性橫帶。因此，網(wǎng)狀纖維在分子結(jié)構(gòu)上可能和膠原纖維相似，只不過膠原原纖維補(bǔ)蛋白質(zhì)和多糖的基質(zhì)粘聚成束，形成膠原纖維后，從而失去嗜銀性。所以膠原纖維銀染色呈陰性而網(wǎng)狀纖維則呈陽性，網(wǎng)狀纖維的原纖維上包有一層糖蛋白，據(jù)稱這是導(dǎo)致它有嗜銀性的原因。4、分布 網(wǎng)狀纖維的分布很廣泛，常以兩種形式存在。一種是以網(wǎng)狀結(jié)締組織形式分布，即有網(wǎng)狀纖維和網(wǎng)狀細(xì)胞同時(shí)存在。多分布于造血器官和淋巴網(wǎng)狀器官,如紅

33、骨髓、脾、淋巴結(jié)、肝、扁桃體和胸腺,消化管和呼吸道管壁的淋巴組織內(nèi),并成為這些器官的網(wǎng)狀支架。另一種是以網(wǎng)狀纖維單獨(dú)存在,沒有網(wǎng)狀細(xì)胞伴隨,見于上皮的基底膜,還有平滑肌,脂肪細(xì)胞,毛細(xì)血管和神經(jīng)纖維都有網(wǎng)狀纖維包裹。我們?nèi)粘ＫQ的網(wǎng)狀纖維染色,主要是顯示淋巴網(wǎng)狀組織的網(wǎng)狀纖維,因?yàn)檫@些組織網(wǎng)狀纖維的增多或減少,崩解成斷裂,都有助于病理組織上的診斷。 顯示網(wǎng)狀纖維主要是用銀浸染法。銀浸染技術(shù)最初是由Bielschowsky氏于1904年設(shè)計(jì)用于神經(jīng)原纖維的研究,后經(jīng)Maresch氏于1905年發(fā)展應(yīng)用于網(wǎng)狀纖維染色。以后,網(wǎng)狀纖維染色技術(shù)就在此基礎(chǔ)上逐步發(fā)展為各種銀氨液浸染法。例如Perdrau

34、氏法,Foot氏法,Gomori氏法,Wilder氏法,Gorden-Sweets氏法,James氏法,Naounenko-Feigin氏法等十多種。 在這些方法中,他們主要不同點(diǎn),一是所使用的氧化劑不同,如有些用高錳酸鉀氧化,有些用高錳酸鉀和硫酸氧化,有些用高碘酸氧化。目的是要增強(qiáng)氧化的效果,使網(wǎng)狀纖維的染色加強(qiáng),背景更為清晰。二是所使用的銀氨液不同,如硝酸銀氨液,碳酸銀氨液,醋酸銀氨液以及氫氧化銀氨液等。這些都是配位化合物,簡稱配合物(舊稱絡(luò)合物)。它們都有一共性,即是每種銀氨液都處于離子狀態(tài),即離解成帶有正電荷的Ag(NH3)2+和帶有負(fù)電荷的N03-、CO3-、CH3C00-、0H-等

35、。一般來說,氧氧化銀氨液(又稱氫氧化二氨合銀液)是銀氨液中最易被還原,容易和組織結(jié)合的一種,故一般多采用。但該液較不穩(wěn)定,對光的敏感性強(qiáng),故配制后容易形成沉淀，不易保存。原理：組織經(jīng)過氧化劑的氧化使網(wǎng)狀纖維對銀離子具有選擇性的親和力，并在媒染劑的作用下，氨銀液被組織吸咐與組織中的蛋白結(jié)合，經(jīng)甲醛還原成黑色的金屬銀沉積于組織內(nèi)及表面。用氯化金調(diào)色后，再用硫代硫酸鈉液洗去未還原的銀鹽，從而將組織內(nèi)的網(wǎng)狀纖維清晰地顯示出來。v染色的應(yīng)用：（一）、用于顯示和鑒別腫瘤的性質(zhì)和來源1）顯示和區(qū)分癌和肉瘤 癌巢周圍存在網(wǎng)狀纖維，肉瘤網(wǎng)狀纖維包繞每個(gè)細(xì)胞2)顯示和區(qū)分血管內(nèi)皮瘤與血管外皮瘤 血管內(nèi)皮瘤的瘤細(xì)胞

36、在網(wǎng)狀纖維膜內(nèi)，而血管外皮瘤則在網(wǎng)狀纖維膜外，血管內(nèi)皮肉瘤的瘤細(xì)胞呈泡巢狀，周圍多被網(wǎng)狀纖維包繞；而血管外皮肉瘤的瘤細(xì)胞可見較多的網(wǎng)狀纖維。 3）用以鑒別淋巴細(xì)胞肉瘤與網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤前者瘤細(xì)胞間的網(wǎng)狀纖維比正常稍減少，后者則比正常時(shí)增多。 4）區(qū)分骨尤文氏肉瘤與骨網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤5）顯示與鑒別骨異常增生與骨化性纖維瘤6）區(qū)分軟骨粘液纖維瘤與粘液肉瘤7）鑒別腦膜瘤與星行細(xì)胞瘤 腦膜瘤有網(wǎng)狀纖維（二）用于某些腫瘤的診斷1）平滑肌肉瘤瘤細(xì)胞間可見大量平行分布的網(wǎng)狀纖維2）纖維肉瘤大量網(wǎng)狀纖維密集包繞細(xì)胞3）滑膜肉瘤其梭形細(xì)胞產(chǎn)生網(wǎng)狀纖維少4）惡性神經(jīng)鞘瘤網(wǎng)狀纖維與梭形細(xì)胞平行排列，不包繞細(xì)胞兩端注：大多被

37、免疫組化取代，很少用（三）用于觀察和研究癌組織的發(fā)生、發(fā)展及其惡性程度（四）顯示與觀察基底膜的變化如：原位癌，可見有完整的基底膜，而浸潤性癌則可見到被破壞的基底膜。（五）用于識別壞死組織的結(jié)構(gòu)及類型1）凝固性壞死2）肺結(jié)核干酪樣壞死 用網(wǎng)染可觀察到早期凝固性壞死處網(wǎng)狀纖維支架還保留的特點(diǎn)（六）用于顯示和研究肝組織病變 例如肝炎的壞死程度及范圍，如果網(wǎng)狀支架塌陷則演變成肝硬化。色素基本解釋：使有機(jī)體具有各種不同顏色的物質(zhì) 詳細(xì)解釋：白光照在物質(zhì)上，特定波長的光被吸收，其它波長的光被反射出去，因此我們才能看到該物質(zhì)特有的顏色。這樣有選擇性的將特定波長的光吸收或反射的物質(zhì)叫做色素。 一、人為性色素及

38、沉著物：認(rèn)為造成的產(chǎn)物，甲醛色素、一、人為性色素及沉著物：認(rèn)為造成的產(chǎn)物，甲醛色素、汞沉著汞沉著二、病理性色素及沉著物：二、病理性色素及沉著物：1，外源性，外源性如硅、碳末、如硅、碳末、石棉、銀、銅等石棉、銀、銅等 2，內(nèi)源性，內(nèi)源性（1）血源性色素）血源性色素如血紅蛋白、含鐵血如血紅蛋白、含鐵血黃素、膽色素等黃素、膽色素等（2）非血源性色素）非血源性色素如黑色素、脂褐素、如黑色素、脂褐素、腎上腺色素等腎上腺色素等v甲醛色素甲醛色素v 暗棕色結(jié)晶，由酸性甲醛與溶血后血紅蛋白中的血紅素結(jié)合而形成的酸性甲醛羥基血紅素沉淀，一般多見于含血多的組織，如淤血、血腫、出血性梗死組織、血管腔及其周圍等v除去方法：(1)切片脫蠟至水v (2)入2%苦味酸無水乙醇飽和液 15Hv (3)自來水沖洗1020minv (4)蒸餾水洗后，HE染色依原步驟進(jìn)行含鐵血黃素(hemosiderin)v紅細(xì)胞被巨噬細(xì)胞攝入并由其溶酶體降解，使來自紅細(xì)胞血紅蛋白紅細(xì)胞被巨噬細(xì)胞攝入并由其溶酶體降解，使來自紅細(xì)胞血紅蛋白的的Fe3+與蛋白質(zhì)結(jié)合成電鏡下可見的鐵