蚓激酶研究及應(yīng)用進(jìn)展

1、早在早在1596年我國年我國本草綱目本草綱目對蚯蚓的藥用就對蚯蚓的藥用就有詳細(xì)記載。有詳細(xì)記載。1878年法國人發(fā)現(xiàn)蚯蚓消化器官的分年法國人發(fā)現(xiàn)蚯蚓消化器官的分泌物能降解纖維蛋白。泌物能降解纖維蛋白。20世紀(jì)世紀(jì)70年代以來年代以來,中國、中國、日本和韓國的科學(xué)家對蚯蚓提取物進(jìn)行了酶學(xué)組分、日本和韓國的科學(xué)家對蚯蚓提取物進(jìn)行了酶學(xué)組分、理化性質(zhì)及臨床應(yīng)用的研究。理化性質(zhì)及臨床應(yīng)用的研究。1979年年P(guān)ak發(fā)現(xiàn)蚯蚓發(fā)現(xiàn)蚯蚓提取物中含有能降解酪蛋白、明膠和清蛋白的水解提取物中含有能降解酪蛋白、明膠和清蛋白的水解酶。酶。1983年年Mihara等從粉正蚓等從粉正蚓(Lumbricus rubullu

2、s)中分離出中分離出具有溶纖活力的粗提物具有溶纖活力的粗提物,并將其命名為蚓激酶并將其命名為蚓激酶(lumbrokinase)。隨后。隨后,蚯蚓纖維蛋白水解酶蚯蚓纖維蛋白水解酶(earthworm fibrinolytic enzymes,EFE)、絲氨酸內(nèi)切蛋白酶、蚯蚓磷、絲氨酸內(nèi)切蛋白酶、蚯蚓磷脂激酶等相繼被分離出來。脂激酶等相繼被分離出來。其中其中EFE水解纖維蛋白的活性較強(qiáng)水解纖維蛋白的活性較強(qiáng),適用于防治血栓及栓塞適用于防治血栓及栓塞性疾病。因此性疾病。因此EFE的分離純化、理化性質(zhì)、作用機(jī)制及臨的分離純化、理化性質(zhì)、作用機(jī)制及臨床應(yīng)用受到國內(nèi)外廣泛的重視。床應(yīng)用受到國內(nèi)外廣泛的重視

3、。1蚓激酶的分離純化11來源于粉正蚓(Lumbricus rubullus)的纖溶酶通過層析、電泳、質(zhì)譜等對氨基酸組成、N-末端序列等方面的研究,Nakajima等確定了來源于粉正蚓的EFE含有6個絲氨酸蛋白酶組分:F-I-0,F-I-1,F-I-2,F-,F-1,F-2,并測定它們的N端序列,見表1。12來源于赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)的纖溶酶周元聰?shù)劝l(fā)現(xiàn)赤子愛勝蚓提取物中至少含有7組具有溶解纖維蛋白活性的組分。經(jīng)FPLC分離,得到3種純的纖溶酶,其中1種同工酶N末端是亮氨酸底物專一性研究結(jié)果顯示,該酶的專一性不同于尿激酶而與組織型纖溶酶原激活物相似。嘉樹等報道了來源于赤子愛勝

4、蚓的相對分子質(zhì)量為45103的EFE由2個片斷組成(26103和18103),其中大片段有催化活性,其N端序列與日本報道F-1(或F-2)和F-的相似。中國科學(xué)院生物物理研究所蚓激酶研究小組從事該領(lǐng)域研究已經(jīng)有十幾年的時間,最近他們將來自赤子愛勝蚓的蚓激酶組分A(EFEa)培養(yǎng)出了單晶,并用X-射線衍射分析其晶系,測定晶胞參數(shù),收集完整的分辨率數(shù)據(jù),測定氨基酸序列,構(gòu)建完整的結(jié)構(gòu)模型,并提出與底物結(jié)合、剪切機(jī)制。EFEa是第一個被確定三維晶體結(jié)構(gòu)的蚓激酶組分,也是第一個來源于環(huán)節(jié)動物的絲氨酸蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)。序列比較顯示EFEa與F-基本一致。北京百奧藥業(yè)公司最近也分離出蚓激酶單一組分,體外溶

5、栓試驗(yàn)和毒性試驗(yàn)均顯示良好結(jié)果,目前尚無進(jìn)一步的報道。李莉4采用瓊脂糖凝膠-間氨基苯硼酸親和層析法從蚯蚓的勻漿中分離純化出一糖基化組分,經(jīng)SDS-PAGE檢測為單一成分,質(zhì)譜測定其相對分子質(zhì)量為24 193。N-末端的序列為:Ala-Glu-Val-Cys-Cys-Asp-Ile-,與已知的纖溶酶都不同。該糖基化組分對纖維蛋白和蛋白酶底物Chromozym TH具有顯著的水解活性。13來源于雙胸蚓(Lumbricus bimastus)的蚓激酶牛勃等5經(jīng)分離純化獲得了一個相對分子質(zhì)量為221103的單一蛋白酶組分。梁國棟等測定了一種來源于雙胸蚓蚯蚓纖溶酶的mRNA序列(Genbank,AF10

6、9648),其編碼的成熟肽序列N端與F-一致,但與F-1和F-2的序列同源性僅35%左右。14蚓激酶的序列測定和基因組結(jié)構(gòu)及重組研究日本學(xué)者Nakajima等6報道了來源于粉正蚓中的具纖溶活性的絲氨酸蛋白酶組分F-1, F-2的mRNA的序列測定結(jié)果(GenBank, AB045719,AB045720), F-1和F-2的同源性達(dá)到90%左右,但是為確切不同的2種蛋白質(zhì)。梁國棟等7,8克隆到2個蚯蚓纖溶酶基因,其中PI239編碼283個氨基酸前體,成熟肽含有239個氨基酸,與國外從粉正蚓屬蚯蚓中獲得的纖溶酶基因有很高的同源性,屬酸性蛋白質(zhì)、絲氨酸蛋白酶,與人凝血酶、t-PA和尿型纖溶酶原激活

7、物(u-PA)有一定結(jié)構(gòu)同源性。另一個基因?yàn)镻I242,是新發(fā)現(xiàn)的基因,2001年向GenBank投送了與F-同源性相近的組分PI239(GenBank,AF433650),并向中國國家知識產(chǎn)權(quán)局申報了名為正蚓科雙胸蚓屬蚓激酶基因核苷酸序列及其克隆方法的發(fā)明專利(公開號:CN 1208770A)。趙曉瑜等于2001年11月報道了來源于赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)中的一個纖溶組分的共180個氨基酸殘基的氨基酸序列(GenBank,AF4322241)。較早的相關(guān)序列報道還有韓國Choi在1995年4月向Genbank投送了與日本的F-1和F-2相應(yīng)的來源于雙胸蚓的2種蚓激酶的mRNA

8、序列(Genbank,U25648,U25643),但至今沒有發(fā)表相關(guān)的文獻(xiàn);英國學(xué)者Sturzenbaum在1997年1月向Genbank投送了與上述序列同源性很高的一個來源于雙胸蚓的蚯蚓胰凝乳蛋白酶的mRNA序列(Genbank,AJ223152),但是沒有發(fā)表相關(guān)文獻(xiàn)。根據(jù)序列比較和同源性分析結(jié)果,同種組分日本和韓國學(xué)者研究結(jié)果存在差異,可能因?yàn)椴煌赜虻尿球净虬l(fā)生不同的進(jìn)化所造成的。這些序列的報道給蚓激酶更為具體的鑒定提供了可能。在蚓激酶基因重組和表達(dá)方面,Nakajima等報道了來源于粉正蚓的蚯蚓纖溶組分F-2基因的克隆和表達(dá)。中國科學(xué)院生物物理研究所生物大分子國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉俊峰

9、等9用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法從赤子愛勝蚓中克隆了編碼蚓激酶組分A的cDNA,導(dǎo)入大腸桿菌的表達(dá)載體pQE31和pMAL- c2X構(gòu)建了相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒,并分別在大腸桿菌菌株M15中誘導(dǎo)表達(dá)出了重組蛋白,一種以包涵體形式存在,而另一種是具有纖溶活性的可溶性蛋白。梁國棟等則將從我國特有的雙胸蚓屬(Lumbricusbimastus)中獲得的蚓激酶新基因PV242,PI239分別在大腸桿菌和桿狀病毒中進(jìn)行了表達(dá)。這些工作為蚓激酶的進(jìn)一步分子生物學(xué)研究和基因工程開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。2蚓激酶的酶學(xué)性質(zhì)蚓激酶的共同特性包括,相對分子質(zhì)量在(2030)103之間,等電點(diǎn)多在35,偏酸性,屬于絲氨酸蛋白酶類。pH穩(wěn)定范

10、圍廣,有較好的熱穩(wěn)定性。大部分蚓激酶具有直接降解纖維蛋白(原),和激活纖溶酶原為纖溶酶的雙重活性。21最適pH值、溫度及穩(wěn)定性來源于赤子愛勝蚓的纖溶酶在pH410的范圍內(nèi)活力較強(qiáng),在25下最適宜pH為911,當(dāng)pH12時,活力喪失。在37,pH110的范圍內(nèi),依然能保持活力,大于60其酶活力喪失。來源于粉正蚓的蚓激酶較耐受熱和pH值的變化,纖溶活性在pH 111,37,30 min和在pH69,60,30 min酶活力保持不變。80加熱30 min,活力喪失。來源于正蚓科雙胸蚓的蚓激酶有2種成分,其中EFE-為單體酶10,在pH410,室溫60 min或55以下60 min酶活力保持不變。EF

11、E-F1,2具有強(qiáng)烈的纖溶活性11,在55,60 min活力喪失46%。22纖溶活力、底物專一性和抑制劑來源于粉正蚓的EFE 6個蛋白酶組分雖然在體外都表現(xiàn)出纖溶活性,但其纖溶活力、底物專一性和抑制劑卻存在差異。根據(jù)這些底物專一性的特征確定這6個組分都是絲氨酸蛋白酶,其中2個組分(F-1,F-2)為胰蛋白酶類型,F-1,F-2在對不同底物的作用中表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性和類似的底物特異性,對H-D-Phe-Pip-Arg-pNA作用最強(qiáng)。3種組分(F-I-0,F-I-1,F-I-2)為胰凝乳蛋白酶類型,F-I-1,F-I-2表現(xiàn)出類似的底物特異性,對H-D-Ile-Pro-Arg-pNA作用最強(qiáng),F-

12、I-0對H-D-ValLeu-Arg-pNA作用最強(qiáng)。另外1種組分(F-)為彈性蛋白酶和胰蛋白酶類。F-對Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA有作用,以人纖溶酶為標(biāo)準(zhǔn),采用平板法測定其水解纖維蛋白的活力由高到低排列為:F-1,F-2,F-,F-I-0,F-I-1,F-I-2,其對小鼠尾靜脈注射給藥的LD50值分別為33,38,27,114,135和88 mgkg-1。二異丙基氟磷酸酯(DFP)、大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)、抑蛋白酶肽(aprotini)均能強(qiáng)烈抑制F-1和F-2,部分抑制其他組分;N-對甲苯磺酰賴氨酰氯甲酮(TLCK),甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK),

13、彈性蛋白酶抑制劑(elastatinal),EDTA和6-氨基己酸對EFE無抑制作用。李莉等在研究來源于赤子愛勝蚓的EFEa底物專一性時采用羰基二咪唑活化的SepharoseCL-6B瓊脂糖凝膠將EFEa固定化。固定化EFEa殘留活性為天然酶的55%60%,但在熱和酸堿的環(huán)境中穩(wěn)定性有所提高。固定化EFEa分別水解纖維蛋白原和纖溶酶原,測定水解片斷N-末端的氨基酸序列并推斷酶切位點(diǎn)。EFEa在纖溶酶原上有4個切點(diǎn):Lys77-Arg78,Arg342-Met343,Ala444-Ala445及Arg557-Ile558。Arg557-Ile558是t-PA和u-PA的切點(diǎn),產(chǎn)生的纖溶酶可以降解

14、纖維蛋白,Ala444-Ala445之間肽鍵的水解產(chǎn)生的小纖溶酶,具有較弱的活性。EFEa水解纖維蛋白原的方式與人類嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶相同:在降解C末端區(qū)域后,在N-端Val21-Glu22切開(與凝血酶不同),破壞了纖維蛋白單體的互相識別,由此產(chǎn)生可溶性片段。EFEa底物專一性較寬,能水解彈性蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶的生色底物,反應(yīng)速率比為1 2 4。另外,彈性蛋白酶和胰蛋白酶的專一性抑制劑也能顯著抑制EFEa活性。結(jié)合纖維蛋白原和纖溶酶原的水解位點(diǎn),進(jìn)一步表明EFEa具有胰蛋白酶類和彈性蛋白酶類的雙重水解特性。EFE-抗血栓的藥理過程是在直接和間接(激活纖溶酶原)水解纖維蛋白的同時,降

15、低血液中纖維蛋白原濃度的多重機(jī)制而實(shí)現(xiàn)的。來源于正蚓科雙胸蚓的蚓激酶有2種組分,EFE-為單體酶,有直接和間接的纖溶活性。EFE-F1,2具有強(qiáng)烈的纖溶活性,用其抑制劑4 molL-1脲處理1h活性僅損失56%,EFE-F3對合成底物S-2288和chromozym P的Km分別是001 mmolL-1和002 mmolL-1,對2種底物均表現(xiàn)為競爭性抑制,Ki均為1 mmolL-1。來源于巨蚓科鋸齒遠(yuǎn)蚓的EFE-2和EFE-4是單體酶,屬糖蛋白酶。EFE-2有直接間接纖溶活性。利馬豆胰蛋白酶抑制劑(LBT)能100%抑制EFE-2的活性,TLCK能抑制其60%活性,DFP能抑制其20%活性。

16、EFE-2將人血纖維蛋白原中的3條主鏈及纖維蛋白溶酶原降解為小分子的多肽和蛋白質(zhì),能溶解人凝血塊。水解對甲苯磺酰精氨酸甲酯(TAME)速率大于苯甲酰賴氨酸甲酯(TLME)。3腸道吸收研究為了研究EFE能否通過腸上皮吸收,且在血液循環(huán)中保持其生物學(xué)功能,赫榮橋研究小組制備了抗EFE-1抗體。腸段保溫培養(yǎng)的免疫學(xué)研究結(jié)果表明,10%15%EFE-1被腸上皮所吸收,在腸上皮細(xì)胞中可通過免疫組織化學(xué)的方法檢測到該酶的存在。另外,對小鼠腹腔注射EFE-1后,發(fā)現(xiàn)血清中存在EFE-1(約10%),表明該酶能通過腸上皮轉(zhuǎn)運(yùn)入血。對血漿樣品的免疫印跡分析檢測到了硝酸纖維素膜上的單一蛋白帶。從小鼠采集血清樣品取

17、代血漿,得到類似的結(jié)果。而用注射生理氯化鈉溶液對照時,未檢測到任何信號。印跡結(jié)果顯示隨著時間的推移,血漿中EFE-1的濃度不斷增加,直到注射后60 min達(dá)到最大灰度值。吸收入血的酶估計約占總注射量的10%。免疫印跡試驗(yàn)表明整分子EFE-1能從腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)入血。通過Chromozym TH分析測定,腹腔注射60min后血液中蚓激酶活性達(dá)到最大(30%),提示蚓激酶口服整分子吸收有效。Walker和Isselbacher在研究蛋白質(zhì)HRP的整分子吸收時提出胞飲-胞吐作用的可能機(jī)制,并指出穿過表皮的轉(zhuǎn)運(yùn)路線可以是通過細(xì)胞,也可以是通過細(xì)胞間隙。在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn),是一些蛋白質(zhì)與腸上皮的表面受體結(jié)合,接著卷

18、入蛋白質(zhì)內(nèi)陷形成吞噬體(例如溶酶體),其中的蛋白質(zhì)可能發(fā)生降解。重要的著色物質(zhì)位于腸上皮細(xì)胞中,EFE-1轉(zhuǎn)運(yùn)的主要通道是一種細(xì)胞內(nèi)的方式。其本身即是一個很強(qiáng)的蛋白酶,對細(xì)胞內(nèi)的一些酶的降解作用有抗性。因此,EFE-1能以完整的形式通過胞吐作用自細(xì)胞膜釋放。大分子的吸收有一定選擇性,一些蛋白質(zhì)的N-末端序列可能影響其轉(zhuǎn)運(yùn)。據(jù)Schwarze等13報道,在不能穿越細(xì)胞膜的-半乳糖苷酶的N-末端添加來自人免疫缺陷病毒的TAT蛋白的11個氨基酸的導(dǎo)肽序列后,-半乳糖苷酶則可以穿過細(xì)胞膜。EFE-1和EFE-2的N-末端15個氨基酸序列的相似性為100%,因此估計EFE-2也能通過腸壁轉(zhuǎn)運(yùn)至血液。4蚓

19、激酶的應(yīng)用蚓激酶的口服制劑在我國于1992年正式投入臨床應(yīng)用,主要用于防治缺血性腦血管疾病。近年來,隨著蚓激酶藥學(xué)和作用機(jī)制研究的深入,并由于纖維蛋白原和纖維蛋白原異常存在的廣泛性以及由此引發(fā)的多種疾病,蚓激酶的臨床應(yīng)用也在不斷拓展,如用于肺心病、美尼爾病、突發(fā)性耳聾、糖尿病、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、腎病綜合征等。由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)科、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院神經(jīng)科、上海第二醫(yī)科大學(xué)瑞金醫(yī)院神經(jīng)科、第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院神經(jīng)科采用多中心、隨機(jī)雙盲、安慰劑對照(2 1)臨床試驗(yàn)設(shè)計15,觀察了百奧蚓激酶腸溶膠囊治療腦梗死的療效和安全性。對73例發(fā)病3周后的腦梗死患者,分治療組(n=50)和對照組(n=

20、23),分別口服百奧蚓激酶腸溶膠囊60萬單位和安慰劑2粒,tid,給藥28 d。統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)室檢測病例的凝血、纖溶、血液流變學(xué)指標(biāo),并評價患者的神經(jīng)功能缺損和生活能力缺損程度。治療28 d后,治療組凝血酶原時間(PT)和部分凝血活酶時間(APTT)延長;纖維蛋白原(Fg)降低,D-二聚體含量增加;組織型纖溶酶原激活物(t-PA)含量提高,纖溶酶原激活物抑制物(PAI)含量降低;血漿黏度和全血黏度改善,且均具有顯著性。安慰劑對照組則改變不明顯。臨床神經(jīng)功能缺損評價,兩組均有改善,但是治療組恢復(fù)明顯,治療組有效率為88%,對照組478%。73例患者中,治療組出現(xiàn)1例輕度上消化道出血(2%),無肝腎功能

21、影響。百奧蚓激酶膠囊治療腦梗死安全有效,可作為治療和預(yù)防缺血性腦血管病的有效藥物。翁雪莉等16觀察蚓激酶對腦梗死患者血漿內(nèi)皮素(ET)與降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的影響。結(jié)果表明蚓激酶膠囊可抑制血漿ET過量釋放,同時提高CGRP濃度,有良好的抗缺血作用,對腦梗死有良好的療效。歐柏青等17觀察蚓激酶對冠脈介入術(shù)(PCI)后血纖維蛋白原濃度(Fg)變化的影響。選擇經(jīng)冠脈造影證實(shí)冠狀動脈存在病變,需行擇期PCI術(shù)者共65例,隨機(jī)分為對照組(n=27)和蚓激酶治療組(n=38)。術(shù)前1周開始用藥,觀察兩組在術(shù)前1周、術(shù)前1日、術(shù)后次日及術(shù)后1周血纖維蛋白原濃度的變化。對照組Fg術(shù)后1周與術(shù)前1周相比明顯增高(483106)比(386073) gL-1,P001,與蚓激酶組術(shù)后1周相比差異有顯著性意義(483106)比(416087) gL-1,P005?？梢奝CI可導(dǎo)致Fg濃度升高,術(shù)前口服蚓激酶對這種不利的反應(yīng)有一定預(yù)防作用。舒錦等18觀察蚓激酶治療心絞痛的療效。冠病心絞痛患者62例隨機(jī)分成加服蚓激酶膠囊組32例和不加服蚓激酶膠囊對照組30例,療程均為4周,兩組進(jìn)行療效對比。蚓激酶組臨床有效率及心電圖ST段、T波改善率分別為93%與63%,對照組臨床有效率及心電圖改善率依次為66%與37%,兩組比較有顯著性