第三章沉淀法

1、 沉淀法沉淀法 離心法離心法 電泳法電泳法 層析法層析法 是純化生物大分子物質(zhì)常用的一種經(jīng)是純化生物大分子物質(zhì)常用的一種經(jīng)典方法；優(yōu)點：操作簡單，成本低廉；典方法；優(yōu)點：操作簡單，成本低廉； 分類：分類：鹽析沉淀、有機溶劑沉淀和選擇沉淀鹽析沉淀、有機溶劑沉淀和選擇沉淀 原理：是蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽原理：是蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升濃度的增高而上升( (鹽溶鹽溶) )但當(dāng)鹽濃度增高到但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時、其溶解度又逐漸下降，直至蛋白一定數(shù)值時、其溶解度又逐漸下降，直至蛋白質(zhì)析出質(zhì)析出( (鹽析鹽析) )。 原因：原因：在一定濃度的中性鹽作用下，蛋白質(zhì)顆在一

2、定濃度的中性鹽作用下，蛋白質(zhì)顆粒失去電荷和水膜，則沉淀析出。這時所獲得粒失去電荷和水膜，則沉淀析出。這時所獲得的蛋白質(zhì)沉淀，能保留蛋白質(zhì)原來的性質(zhì)的蛋白質(zhì)沉淀，能保留蛋白質(zhì)原來的性質(zhì)。 常用中性鹽：主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸常用中性鹽：主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應(yīng)用最廣的是其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨硫酸銨； 其優(yōu)點：其優(yōu)點：A.A. 溫度系數(shù)小而溶解度大溫度系數(shù)小而溶解度大(25(25時飽和溶解度時飽和溶解度為為4.1mol/L,4.1mol/L,即即767g/L;0767g/L;0為為3.9mol/L3.9mol/L，即，即676g/L)676g

3、/L)，適合許多蛋白質(zhì)和酶的鹽析，適合許多蛋白質(zhì)和酶的鹽析；（1）鹽類的選擇）鹽類的選擇B.B. 分級沉淀效果比其他鹽好。比如：分級沉淀效果比其他鹽好。比如：有些抽提有些抽提液經(jīng)過加入適量硫酸銨的一步分組沉淀液經(jīng)過加入適量硫酸銨的一步分組沉淀, ,就就可除去雜蛋白可除去雜蛋白75%75%以上以上；C.C. 不容易引起蛋白質(zhì)變性，不容易引起蛋白質(zhì)變性，有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。比如將的作用。比如將2-3mol/L2-3mol/L硫酸銨鹽析的蛋白硫酸銨鹽析的蛋白質(zhì)置低溫下保存一年其性質(zhì)沒有變化；質(zhì)置低溫下保存一年其性質(zhì)沒有變化；D.D. 硫酸銨價廉易得，硫酸銨價廉易得，廢液可肥田。廢

4、液可肥田。 缺點：缺點：即得到的樣品欲繼續(xù)純化時，需花一定時間脫鹽。即得到的樣品欲繼續(xù)純化時，需花一定時間脫鹽。在大體積粗制品溶液中逐步加入固體硫酸銨，加在大體積粗制品溶液中逐步加入固體硫酸銨，加到一定飽和度時，蛋白質(zhì)可沉淀出來。到一定飽和度時，蛋白質(zhì)可沉淀出來。注意：注意： 控制加硫酸銨的速度，在攪拌下、以少量多次方控制加硫酸銨的速度，在攪拌下、以少量多次方式緩慢地加入，待先加的硫酸銨溶解后再加入少式緩慢地加入，待先加的硫酸銨溶解后再加入少量的硫酸銨。量的硫酸銨。固體加入法：固體加入法： 例如：例如： 在尿素酶抽提液中加入固體硫酸銨，當(dāng)飽在尿素酶抽提液中加入固體硫酸銨，當(dāng)飽和度達和度達35%

5、35%，尿素酶基本上仍留在溶液中。，尿素酶基本上仍留在溶液中。而飽和度達而飽和度達5555時尿素酶幾乎全都沉淀出時尿素酶幾乎全都沉淀出來來( (見表見表2-1)2-1)。欲將蛋白質(zhì)溶液變成一定的硫。欲將蛋白質(zhì)溶液變成一定的硫酸銨鹽飽和溶液時，要加入的硫酸銨數(shù)量可酸銨鹽飽和溶液時，要加入的硫酸銨數(shù)量可從硫酸銨飽和溶液計算表查得。從硫酸銨飽和溶液計算表查得。V = V0S2 - S1S3 - S2 在蛋白質(zhì)溶液中逐步加入預(yù)先調(diào)好在蛋白質(zhì)溶液中逐步加入預(yù)先調(diào)好pHpH的飽和的飽和硫硫酸銨溶液，不同飽和度所需的硫酸銨量可酸銨溶液，不同飽和度所需的硫酸銨量可用下列公式計算：用下列公式計算：V V 需加入

6、硫酸銨溶液的體積需加入硫酸銨溶液的體積( (毫升毫升) )；V V。= =原來溶劑的體積（毫升原來溶劑的體積（毫升) )；S S1 1原來溶液的百分飽和度；原來溶液的百分飽和度；S S2 2要求達到的百分飽和度；要求達到的百分飽和度；S S3 3需要加入硫酸銨溶液的飽和度需要加入硫酸銨溶液的飽和度( (一般用一般用100%)100%)。 優(yōu)點：比加入固體硫酸銨沉淀法溫和；優(yōu)點：比加入固體硫酸銨沉淀法溫和； 缺點：對于大體積樣品不適用。因為硫缺點：對于大體積樣品不適用。因為硫酸銨溶液的大量加入，將導(dǎo)致樣品溶液酸銨溶液的大量加入，將導(dǎo)致樣品溶液體積增加。例體積增加。例如，當(dāng)樣品達到如，當(dāng)樣品達到5

7、050硫酸硫酸銨飽和度時，其體積增加一倍。銨飽和度時，其體積增加一倍。 將盛蛋白質(zhì)溶液的透析袋放入一定濃度的大將盛蛋白質(zhì)溶液的透析袋放入一定濃度的大體積鹽溶液中，通過透析作用來改變蛋白質(zhì)體積鹽溶液中，通過透析作用來改變蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度。溶液中的鹽濃度。 特點：鹽濃度是以連續(xù)的狀態(tài)變化，可以避特點：鹽濃度是以連續(xù)的狀態(tài)變化，可以避免鹽濃度局部升高產(chǎn)生的不良影響，分離效免鹽濃度局部升高產(chǎn)生的不良影響，分離效果好。果好。 用鹽析法沉淀欲分離樣品時所需鹽濃度范圍用鹽析法沉淀欲分離樣品時所需鹽濃度范圍要通過實驗確定。要通過實驗確定。具體步驟：具體步驟： 取一定體積已測含量之蛋白質(zhì)或酶的待分離取一定體

8、積已測含量之蛋白質(zhì)或酶的待分離溶液，調(diào)節(jié)溶液，調(diào)節(jié)pHpH至穩(wěn)定范圍，分至穩(wěn)定范圍，分6-106-10次加入不次加入不同量的硫酸銨：第一次加硫酸銨到溶液出現(xiàn)同量的硫酸銨：第一次加硫酸銨到溶液出現(xiàn)微弱混濁狀態(tài)時，靜置一段時間，離心或過微弱混濁狀態(tài)時，靜置一段時間，離心或過濾即得到第一個分級沉淀部分。接著以同樣濾即得到第一個分級沉淀部分。接著以同樣的操作加硫酸銨到上清液或過濾液中則得的操作加硫酸銨到上清液或過濾液中則得到第二個分級沉淀部分。到第二個分級沉淀部分。 如此連續(xù)進行便可得到如此連續(xù)進行便可得到6-106-10個分級沉淀部個分級沉淀部分。然后將每個分級沉淀部分分別重新溶解分。然后將每個分級

9、沉淀部分分別重新溶解于一定體積的適宜于一定體積的適宜pHpH的緩沖液中，根據(jù)其蛋的緩沖液中，根據(jù)其蛋白質(zhì)或酶含量和相對應(yīng)的硫酸銨濃度之間的白質(zhì)或酶含量和相對應(yīng)的硫酸銨濃度之間的關(guān)系作圖，即可得到典型鹽析曲線，在此曲關(guān)系作圖，即可得到典型鹽析曲線，在此曲線基礎(chǔ)上，參照分級試驗方法，可找出有利線基礎(chǔ)上，參照分級試驗方法，可找出有利于提高收得率和純化倍數(shù)的精細鹽析范圍。于提高收得率和純化倍數(shù)的精細鹽析范圍。4020蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)沉淀% %100%飽和度飽和度時的溶質(zhì)量時的溶質(zhì)量20406080100鹽析曲線示意圖鹽析曲線示意圖硫酸銨溶液的飽和度硫酸銨溶液的飽和度飽和度飽和度范圍范圍% %酶沉淀酶沉

10、淀% %蛋白蛋白沉淀沉淀% %純化純化倍數(shù)倍數(shù)備注備注第一第一次試次試驗驗04004040604060608060804 4626232322525222232322.82.81.01.0酶在酶在4060%鹽中沉淀比鹽中沉淀比6080%的多，要改試的多，要改試4570%的鹽沉淀。的鹽沉淀。第二第二次試次試驗驗045045457045706 69090323225252.42.44570%的鹽收得率高但的鹽收得率高但純化倍數(shù)純化倍數(shù)第一次，欲第一次，欲提高純度，需試提高純度，需試4865%的鹽飽和度。的鹽飽和度。第三第三次試次試驗驗0480484865486510107575353525253.

11、03.0硫酸銨的分級試驗硫酸銨的分級試驗每種蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度和該溶液的鹽濃度之間每種蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度和該溶液的鹽濃度之間存在下列關(guān)系，即溶解度存在下列關(guān)系，即溶解度(S(S，以，以mgmgmlml表示表示) )的對數(shù)的對數(shù)值與溶液中鹽的濃度值與溶液中鹽的濃度(M)(M)成反比例關(guān)系，可用下面的公成反比例關(guān)系，可用下面的公式表示式表示: : lgSlgS- K- Ka a M M式中式中 表示有效成分在水中溶解度的對數(shù)值；表示有效成分在水中溶解度的對數(shù)值；MM表示克表示克分子濃度；分子濃度；K Ka a表示有效成分在特定條件下的數(shù)值，即表示有效成分在特定條件下的數(shù)值，即表示有效成分之

12、溶解度降低的速率是隨著鹽濃度的增表示有效成分之溶解度降低的速率是隨著鹽濃度的增加而增加的。加而增加的。(1)鹽析常數(shù)鹽析常數(shù)(Ka) K Ka a值大，則意味著有效成分溶解度降低值大，則意味著有效成分溶解度降低的速率快。因此，對一種有效成分而言，的速率快。因此，對一種有效成分而言，K Ka a值越大，分級范圍越窄。鹽析效果就值越大，分級范圍越窄。鹽析效果就越好。越好。 某一蛋白質(zhì)的某一蛋白質(zhì)的K Ka a值不僅與蛋白質(zhì)本身的值不僅與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，而且與溶液的性質(zhì)有關(guān)，而且與溶液的pHpH、溫度和鹽、溫度和鹽的種類等因子也有關(guān)。的種類等因子也有關(guān)。 當(dāng)分離兩種以上蛋白質(zhì)時，若每一種蛋白當(dāng)

13、分離兩種以上蛋白質(zhì)時，若每一種蛋白質(zhì)的質(zhì)的K Ks s值都很大，而且鹽析范圍值都很大，而且鹽析范圍( (鹽離子強鹽離子強度度) )差異明顯，則分離效果好；若差異明顯，則分離效果好；若K Ks s值很大，值很大，但鹽析范圍差異較小，則分離效果不好。但鹽析范圍差異較小，則分離效果不好。沉淀量（沉淀量（mg）30405060708090ABC三種蛋白質(zhì)的鹽析曲線圖三種蛋白質(zhì)的鹽析曲線圖硫酸銨飽和度硫酸銨飽和度% 溶解度與溶解度與pHpH和鹽濃度有密切關(guān)系。當(dāng)這兩種因子變和鹽濃度有密切關(guān)系。當(dāng)這兩種因子變動時，溶解度將發(fā)生明顯的變化。動時，溶解度將發(fā)生明顯的變化。例如，兔肌甘油醛磷酸脫氫酶例如，兔肌甘

14、油醛磷酸脫氫酶( (等電點等電點8.58.5左右左右) )在在PHPH6.06.0時，能溶于時，能溶于3.2mol/L(NH3.2mol/L(NH4 4) )2 2SOSO4 4溶液，但當(dāng)溶液，但當(dāng)PHPH調(diào)至調(diào)至7 7時，立即產(chǎn)生沉淀，甚至有結(jié)晶析出。時，立即產(chǎn)生沉淀，甚至有結(jié)晶析出。 蛋白質(zhì)存在的形式蛋白質(zhì)存在的形式( (均一的，還是混合的均一的，還是混合的) )和和濃度不同，鹽析范圍和溶解度也不同。在混濃度不同，鹽析范圍和溶解度也不同。在混合的蛋白質(zhì)溶液中，不同分子間的相互作用合的蛋白質(zhì)溶液中，不同分子間的相互作用會發(fā)生共沉淀現(xiàn)象。蛋白濃度越高，這種現(xiàn)會發(fā)生共沉淀現(xiàn)象。蛋白濃度越高，這種

15、現(xiàn)象越明顯，鹽析分離效果則越差。因此一象越明顯，鹽析分離效果則越差。因此一般控制樣品液蛋白濃度在般控制樣品液蛋白濃度在0.20.2一一2 2為宜。為宜。 其它其它在進行鹽析沉淀時，有時需在溶液中加在進行鹽析沉淀時，有時需在溶液中加1mmo1/L1mmo1/L的的EDTA-NaEDTA-Na鹽，鹽，以除去沉淀劑中帶入以除去沉淀劑中帶入的金屬離子。的金屬離子。 再者是加硫酸銨沉淀的時間要控制好，過長再者是加硫酸銨沉淀的時間要控制好，過長過短都不適宜。一般需要二小時左右。過短都不適宜。一般需要二小時左右。具體操作：是把待脫鹽溶液裝入有一定孔徑的透析具體操作：是把待脫鹽溶液裝入有一定孔徑的透析袋，扎緊

16、袋口袋，扎緊袋口( (袋內(nèi)留適當(dāng)?shù)目臻g袋內(nèi)留適當(dāng)?shù)目臻g) )。漂在水或適當(dāng)。漂在水或適當(dāng)?shù)耐肝鲆褐?。要防止透析液從袋口進入，以免引起的透析液中。要防止透析液從袋口進入，以免引起透析袋脹裂，鹽離子和小分子物質(zhì)將穿過半透膜由透析袋脹裂，鹽離子和小分子物質(zhì)將穿過半透膜由高向低進行擴散滲透，而大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)等則高向低進行擴散滲透，而大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)等則留在袋內(nèi)。為了加快透析速度，應(yīng)不斷更新透析液，留在袋內(nèi)。為了加快透析速度，應(yīng)不斷更新透析液，若用溫和攪動的辦法則效果較好；若用溫和攪動的辦法則效果較好；為了避免蛋白質(zhì)為了避免蛋白質(zhì)或酶類破壞，通常宜在低溫下進行?；蛎割惼茐模ǔＲ嗽诘蜏叵逻M行。常用

17、方法：凝膠過濾法和透析法。常用方法：凝膠過濾法和透析法。購買的透析袋購買的透析袋( (或紙或紙) ) 用蒸餾水洗凈用蒸餾水洗凈, ,無漏洞時，即可無漏洞時，即可使用。使用。除去某些易被金屬或水解酶等破壞的樣品中所含鹽除去某些易被金屬或水解酶等破壞的樣品中所含鹽類時，透析袋的處理方法：類時，透析袋的處理方法： 將將l0 l0厘米長的透析袋置厘米長的透析袋置500500毫升含毫升含1mmo11mmo1L L EDTA-NaEDTA-Na2 2的的2 2碳酸氫鈉溶液中煮沸碳酸氫鈉溶液中煮沸1010分鐘，用干分鐘，用干凈鑷子或戴橡皮手套取出，蒸餾水煮沸、漂洗后，凈鑷子或戴橡皮手套取出，蒸餾水煮沸、漂洗

18、后，即可使用。用過的透析袋依上述方法處理，能重復(fù)即可使用。用過的透析袋依上述方法處理，能重復(fù)使用，若不馬上使用，可泡在蒸餾水中置低溫使用，若不馬上使用，可泡在蒸餾水中置低溫（44）；或泡在）；或泡在7070的乙醇中保存。的乙醇中保存。（1 1）透析袋的處理）透析袋的處理 透析袋或透析管的孔徑和規(guī)格因廠而異。透透析袋或透析管的孔徑和規(guī)格因廠而異。透析袋的孔徑大小除與其型號有關(guān)外，還受處析袋的孔徑大小除與其型號有關(guān)外，還受處理方法的影響。例如，用理方法的影響。例如，用64%64%氯化鋅溶液浸氯化鋅溶液浸泡過的透析袋，可使其孔徑增大到能通過泡過的透析袋，可使其孔徑增大到能通過135000135000

19、道爾頓的大分子。而經(jīng)乙?；饔玫牡罓栴D的大分子。而經(jīng)乙酰化作用的透析袋，則可使其孔徑縮小到能阻滯甲醇分透析袋，則可使其孔徑縮小到能阻滯甲醇分子的通過。子的通過。 一般選用的透析液均為低離子強度的中性緩一般選用的透析液均為低離子強度的中性緩沖液。對含有輔基的酶透析時，在透析液中沖液。對含有輔基的酶透析時，在透析液中宜加入適量的輔基或保護輔基的試劑。為了宜加入適量的輔基或保護輔基的試劑。為了防止微生物生長，透析應(yīng)在防止微生物生長，透析應(yīng)在44進行或在透進行或在透析液中添加析液中添加0.020.02疊氮化鈉。疊氮化鈉。 操作在攪拌下進行時，樣品液與透析液體操作在攪拌下進行時，樣品液與透析液體積之比以

20、積之比以1:101:10較好，一般三小時可達平衡。較好，一般三小時可達平衡。若透析在靜止?fàn)顟B(tài)下過夜進行時，則比例若透析在靜止?fàn)顟B(tài)下過夜進行時，則比例應(yīng)擴大到應(yīng)擴大到1 1：2020以上。以上。 有機溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因：有機溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因：1 1、與鹽溶液一樣具有脫水作用；、與鹽溶液一樣具有脫水作用；2 2、有機溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致、有機溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶劑的極性減小。溶劑的極性減小。 常用的有機溶劑：甲醇、乙醇和丙酮常用的有機溶劑：甲醇、乙醇和丙酮。V V需加入有機溶劑的體積；需加入有機溶劑的體積；VoVo蛋白溶液的蛋白溶液的原始體積；原始體積；S1S1

21、蛋白溶液中有機溶劑的濃度蛋白溶液中有機溶劑的濃度( (體積百分濃度體積百分濃度) )；S2蛋白溶液中欲達到的溶蛋白溶液中欲達到的溶劑濃度劑濃度(體積百分濃度體積百分濃度)。 V = V0 S2-S1100-S2 如果使用的有機溶劑含量不是如果使用的有機溶劑含量不是100100而是而是95%95%，則公式中的則公式中的100100應(yīng)改應(yīng)改9595，余此類推。，余此類推。 用有機溶劑沉淀法分離某些蛋白質(zhì)時，效果用有機溶劑沉淀法分離某些蛋白質(zhì)時，效果也不錯。如，從解酚假單胞菌分離鄰苯二酚也不錯。如，從解酚假單胞菌分離鄰苯二酚- -2,3-2,3-雙加氧酶時雙加氧酶時, ,在粗提液中加入在粗提液中加入

22、5050到到6060的冷丙酮溶劑的冷丙酮溶劑, ,能把幾乎全部欲分離物沉淀能把幾乎全部欲分離物沉淀出來。有機溶劑沉淀法的操作與硫酸銨鹽析出來。有機溶劑沉淀法的操作與硫酸銨鹽析法相似。法相似。 由于有機溶劑加入水溶液時產(chǎn)生放熱反應(yīng)會由于有機溶劑加入水溶液時產(chǎn)生放熱反應(yīng)會引起蛋白質(zhì)變性，因此必須把所用之有機溶引起蛋白質(zhì)變性，因此必須把所用之有機溶劑預(yù)冷至劑預(yù)冷至-10-10，而且整個操作要在低溫下，而且整個操作要在低溫下進行。進行。(1)(1)低溫下操作低溫下操作加入適量的中性鹽能增加蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶加入適量的中性鹽能增加蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度，可降低有機溶劑對蛋白質(zhì)的變性作用，同時解度

23、，可降低有機溶劑對蛋白質(zhì)的變性作用，同時還可提高分級效果。還可提高分級效果。但是，加入的量過多，則可引起蛋白質(zhì)析出，影響但是，加入的量過多，則可引起蛋白質(zhì)析出，影響有機溶劑的分級作用。中性鹽的離子強度在有機溶劑的分級作用。中性鹽的離子強度在0.050.05以以下時，能防止蛋白質(zhì)變性。下時，能防止蛋白質(zhì)變性。用有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)時，宜在稀鹽溶液或低濃度用有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)時，宜在稀鹽溶液或低濃度緩沖液中進行。緩沖液中進行。 有些蛋白質(zhì)和多價陽離子有些蛋白質(zhì)和多價陽離子( (如如ZnZn2+2+、CuCu2+2+等等) )能能結(jié)合形成復(fù)合物，致使蛋白質(zhì)在有機溶劑中結(jié)合形成復(fù)合物，致使蛋白質(zhì)在有機溶

24、劑中的溶解度降低。這對在高濃度溶劑中才能沉的溶解度降低。這對在高濃度溶劑中才能沉淀的蛋白質(zhì)特別有益。淀的蛋白質(zhì)特別有益。 例如，在某些蛋白質(zhì)溶液中只要加入例如，在某些蛋白質(zhì)溶液中只要加入0.005-0.005-0.02nmol/L Zn0.02nmol/L Zn2+2+，就可大大減少有機溶劑的，就可大大減少有機溶劑的用量，而將蛋白質(zhì)沉淀出來。用量，而將蛋白質(zhì)沉淀出來。鹽溶鹽溶鹽析鹽析有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀影響影響因素因素蛋白質(zhì)分子表面的蛋白質(zhì)分子表面的帶電基團帶電基團蛋白質(zhì)分子表面的非蛋白質(zhì)分子表面的非極性基團極性基團除了疏水之外的其它作除了疏水之外的其它作用力用力試劑試劑NaCl(單價離子

25、單價離子)硫酸銨硫酸銨(兩價離子兩價離子)甲醇、丙酮等有機溶劑甲醇、丙酮等有機溶劑發(fā)生發(fā)生機制機制蛋白質(zhì)在其蛋白質(zhì)在其pI下，下，因電荷為零而聚集因電荷為零而聚集沉淀；若加入鹽類，沉淀；若加入鹽類，會阻礙其聚集而增會阻礙其聚集而增加溶解度。加溶解度。硫酸銨的兩價離子，硫酸銨的兩價離子，在溶液中搶走附在蛋在溶液中搶走附在蛋白質(zhì)表面白質(zhì)表面(非極性非極性)的水的水分子，使得非極性部分子，使得非極性部分相互吸引而聚集沉分相互吸引而聚集沉淀。淀。降低水活性，使溶液的降低水活性，使溶液的介電常數(shù)下降，增加蛋介電常數(shù)下降，增加蛋白質(zhì)溶質(zhì)分子之間的作白質(zhì)溶質(zhì)分子之間的作用力，而聚集在一起。用力，而聚集在一起

26、。其它其它說明說明對較低濃度緩沖液對較低濃度緩沖液進行透析是鹽溶的進行透析是鹽溶的反向過程。反向過程。非極性蛋白質(zhì)較早沉非極性蛋白質(zhì)較早沉淀下來；在硫酸銨中淀下來；在硫酸銨中蛋白質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定。蛋白質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定。部分蛋白質(zhì)變性；有助部分蛋白質(zhì)變性；有助沉淀的因素：蛋白質(zhì)分沉淀的因素：蛋白質(zhì)分子量大，緩沖液子量大，緩沖液pH值接值接近近pI；脂溶性蛋白質(zhì)的脂溶性蛋白質(zhì)的溶解度反而增加。溶解度反而增加。各種鹽析及沉淀法的比較各種鹽析及沉淀法的比較多價陽離子的堿性蛋白質(zhì)，如魚精蛋白，除能有多價陽離子的堿性蛋白質(zhì)，如魚精蛋白，除能有效地沉淀核酸類物質(zhì)外效地沉淀核酸類物質(zhì)外, ,還能沉淀某些蛋白質(zhì)，還能沉淀某

27、些蛋白質(zhì)，當(dāng)把當(dāng)把90mg90mg魚精蛋白加入部分純化的磷酸果糖激魚精蛋白加入部分純化的磷酸果糖激酶溶液（含有酶溶液（含有1g1g蛋白）時候，溶液中的酶蛋白便蛋白）時候，溶液中的酶蛋白便吸附魚精蛋白吸附魚精蛋白- -核酸沉淀物上。沉淀物用核酸沉淀物上。沉淀物用0.1mol/L0.1mol/L磷酸緩沖液洗脫后，收得的磷酸果糖激酶的純度磷酸緩沖液洗脫后，收得的磷酸果糖激酶的純度比原來提高了九倍。比原來提高了九倍。1 1、堿性蛋白質(zhì)、堿性蛋白質(zhì) 反應(yīng)是不可逆的，應(yīng)用受到了限制；反應(yīng)是不可逆的，應(yīng)用受到了限制； 在應(yīng)用多價陽離子物質(zhì)時，因其水溶液在應(yīng)用多價陽離子物質(zhì)時，因其水溶液PHPH值值為為2-3

28、2-3，所以要小心地中和后，再加到蛋白，所以要小心地中和后，再加到蛋白質(zhì)溶液中。質(zhì)溶液中。缺點：缺點：植物中特殊的蛋白質(zhì)，對糖蛋白中糖鏈的末端糖植物中特殊的蛋白質(zhì)，對糖蛋白中糖鏈的末端糖序列具有明顯、特異的凝集力。例如，伴刀豆球序列具有明顯、特異的凝集力。例如，伴刀豆球蛋白與含有葡萄糖、甘露糖等分子的糖蛋白能發(fā)蛋白與含有葡萄糖、甘露糖等分子的糖蛋白能發(fā)生特異的凝集沉淀作用，通過離心操作可把糖蛋生特異的凝集沉淀作用，通過離心操作可把糖蛋白和一般蛋白質(zhì)分開，獲得的凝集素白和一般蛋白質(zhì)分開，獲得的凝集素- -糖蛋白復(fù)糖蛋白復(fù)合物用單糖作抑制劑就能使其解離。合物用單糖作抑制劑就能使其解離。優(yōu)點：反應(yīng)條

29、件較溫和，專一性強。優(yōu)點：反應(yīng)條件較溫和，專一性強。 重金屬鹽如鉛鹽、汞鹽作為蛋白質(zhì)沉淀劑能重金屬鹽如鉛鹽、汞鹽作為蛋白質(zhì)沉淀劑能使蛋白質(zhì)或酶純化。重金屬會使蛋白質(zhì)變性，使蛋白質(zhì)或酶純化。重金屬會使蛋白質(zhì)變性，因此控制在較溫和的因此控制在較溫和的條件下進行，并要及時條件下進行，并要及時通過透析方法把蛋白質(zhì)和重金屬盡快分開。通過透析方法把蛋白質(zhì)和重金屬盡快分開。 優(yōu)點：優(yōu)點： 條件溫和，不易引起蛋白質(zhì)變性，而且沉淀較條件溫和，不易引起蛋白質(zhì)變性，而且沉淀較完全，應(yīng)用范圍頗廣。完全，應(yīng)用范圍頗廣。 缺點：缺點： 易受各種因子如易受各種因子如pHpH、離子強度、蛋白質(zhì)濃度及、離子強度、蛋白質(zhì)濃度及聚

30、合物分子量的影響。聚合物分子量的影響。沉淀作用較滿沉淀作用較滿意的聚合物是個分子量在意的聚合物是個分子量在400-400-60006000之間的聚乙二醇。之間的聚乙二醇。水溶性非離子型聚合物，可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。水溶性非離子型聚合物，可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。 當(dāng)從卡爾斯伯酵母菌提取當(dāng)從卡爾斯伯酵母菌提取-葡糖苷酶時，加葡糖苷酶時，加2020PEG 6000PEG 6000或或57%PEG40057%PEG400到置冰浴中并已盛到置冰浴中并已盛抽提液的離心管內(nèi)，立即在旋渦儀上振蕩混抽提液的離心管內(nèi)，立即在旋渦儀上振蕩混合再置冰浴合再置冰浴15-1815-18小時，小時，10000g10000

31、g離心離心1 1小時，小時，去上清液，沉淀物溶在去上清液，沉淀物溶在10mmo1/L10mmo1/L磷酸緩沖液磷酸緩沖液pHl6.8)pHl6.8)中。中。a-a-葡糖苷酶的回收率在葡糖苷酶的回收率在8080左左右。就右。就a-a-葡糖苷酶的純度而言，用葡糖苷酶的純度而言，用PEG400PEG400沉淀沉淀遠比遠比PEG6000PEG6000高。高。PEG400PEG400產(chǎn)生高專一性的分離產(chǎn)生高專一性的分離效果，有時可與葡萄糖凝膠層析效果，有時可與葡萄糖凝膠層析相比。相比。 根據(jù)各種蛋白質(zhì)在不同物理化學(xué)因子根據(jù)各種蛋白質(zhì)在不同物理化學(xué)因子( (如溫度、如溫度、酸堿度和有機溶劑等酸堿度和有機溶劑等) )作用下穩(wěn)定性不同的特作用下穩(wěn)定性不同的特點，用適當(dāng)?shù)倪x擇性沉淀法，即可使雜蛋白點，用適當(dāng)?shù)倪x擇性沉淀法，即可使雜蛋白變性沉淀，而欲分離的有效成分則存在于溶變性沉淀，而欲分離的有效成分則存在于溶液中液中( (或者發(fā)生可逆性沉淀或者發(fā)生可逆性沉淀) )，從而達到純化，從而達到純化有效成分的目的。有效成分的目的。 例如，從一種假單胞菌培養(yǎng)液純化堿性脂酶例如，從一種假單胞菌培養(yǎng)液純化堿性脂酶時，是采用改變酸堿度的選擇性沉淀法。即時，是采用改變酸堿度的選擇性沉淀法。即在培養(yǎng)液中加鹽酸酸調(diào)在培養(yǎng)液中加鹽酸酸調(diào)pHpH到到4.04.0，出現(xiàn)含堿性，出現(xiàn)含堿性脂酶