病毒學(xué)研究方法簡(jiǎn)介

1、生物安全實(shí)驗(yàn)室生物安全實(shí)驗(yàn)室 P1實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室研究的病毒危險(xiǎn)性較低，試驗(yàn)人員連口罩都不用研究的病毒危險(xiǎn)性較低，試驗(yàn)人員連口罩都不用帶，穿上白大褂就可以了，試驗(yàn)人員在這里很放松；帶，穿上白大褂就可以了，試驗(yàn)人員在這里很放松； P2實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室研究的是中度危險(xiǎn)的病原，像研究的是中度危險(xiǎn)的病原，像肝炎、流行性感冒肝炎、流行性感冒等等，要求戴防護(hù)性較好的口罩；等等，要求戴防護(hù)性較好的口罩； P3實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室研究的是高度危險(xiǎn)的病毒，傳染性很強(qiáng)，而且沒研究的是高度危險(xiǎn)的病毒，傳染性很強(qiáng)，而且沒有疫苗，試驗(yàn)人員的保護(hù)措施要比有疫苗，試驗(yàn)人員的保護(hù)措施要比P1/P2實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)密得多；實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)密得多； P4實(shí)驗(yàn)室

2、實(shí)驗(yàn)室全球級(jí)別最高的生物安全實(shí)驗(yàn)室，研究的是極度全球級(jí)別最高的生物安全實(shí)驗(yàn)室，研究的是極度危險(xiǎn)的病毒，如令人談之色變的危險(xiǎn)的病毒，如令人談之色變的埃博拉病毒、馬爾堡病毒埃博拉病毒、馬爾堡病毒，進(jìn)入，進(jìn)入這種實(shí)驗(yàn)室的工作人員，處于防護(hù)服的嚴(yán)密保護(hù)之下，連空氣都這種實(shí)驗(yàn)室的工作人員，處于防護(hù)服的嚴(yán)密保護(hù)之下，連空氣都不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)呼吸，紅色螺旋狀管子，是專門用來向室內(nèi)輸送不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)呼吸，紅色螺旋狀管子，是專門用來向室內(nèi)輸送新鮮空氣的，試驗(yàn)人員一進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，要先屏住呼吸，馬上接上新鮮空氣的，試驗(yàn)人員一進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，要先屏住呼吸，馬上接上這種管子，然后才能呼吸。這種管子，然后才能呼吸。根據(jù)微生物及其

3、毒素的危害程度不同，分為級(jí)，根據(jù)微生物及其毒素的危害程度不同，分為級(jí)，一級(jí)最低，四級(jí)最高。一級(jí)最低，四級(jí)最高。病毒學(xué)研究的主要方法病毒學(xué)研究的主要方法生物學(xué)特性測(cè)定生物學(xué)特性測(cè)定:在宿主上的反應(yīng)在宿主上的反應(yīng)癥狀、傳播癥狀、傳播等等病毒分離與培養(yǎng)病毒分離與培養(yǎng)：提純與純化、二元培養(yǎng)法：提純與純化、二元培養(yǎng)法光鏡與電鏡觀察光鏡與電鏡觀察：病毒粒子和病毒與相應(yīng)抗血病毒粒子和病毒與相應(yīng)抗血清的特異免疫吸附情況清的特異免疫吸附情況免疫學(xué)技術(shù)免疫學(xué)技術(shù)：以血清學(xué)和組織免疫化學(xué)方法檢測(cè)以血清學(xué)和組織免疫化學(xué)方法檢測(cè)帶毒情況、多克隆抗體、單克隆抗體帶毒情況、多克隆抗體、單克隆抗體分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)

4、：核酸分子雜交、核酸分子雜交、PCR等等一、生物學(xué)特性測(cè)定一、生物學(xué)特性測(cè)定 在宿主上的反應(yīng)在宿主上的反應(yīng)宿主范圍、癥狀表現(xiàn)、傳播方式宿主范圍、癥狀表現(xiàn)、傳播方式等等 病毒的理化性質(zhì)病毒的理化性質(zhì)病毒粒子的形態(tài)、大小、對(duì)理化因子的耐受性、病毒粒子的形態(tài)、大小、對(duì)理化因子的耐受性、體外存活期等體外存活期等 病毒接種方法病毒接種方法注射接種、病毒組織培養(yǎng)技術(shù)注射接種、病毒組織培養(yǎng)技術(shù)植物病毒植物病毒汁液摩擦接種、昆蟲介體接種、嫁汁液摩擦接種、昆蟲介體接種、嫁接接種、菟絲子接種法等接接種、菟絲子接種法等巨細(xì)胞病毒感染細(xì)胞的典型巨細(xì)胞病毒感染細(xì)胞的典型“貓頭鷹眼貓頭鷹眼”樣核內(nèi)包涵樣核內(nèi)包涵體體冠狀病

5、毒感染冠狀病毒感染“非典非典”X線胸部檢查可見肺部不同程度的片狀陰影，少線胸部檢查可見肺部不同程度的片狀陰影，少數(shù)病人進(jìn)展迅速，呈大片狀陰影，大多數(shù)為數(shù)病人進(jìn)展迅速，呈大片狀陰影，大多數(shù)為雙側(cè)改變，陰影吸收消散較慢。雙側(cè)改變，陰影吸收消散較慢。TMV transmission by an Apis sp. A severe mosaic symptom on tomato leaf (TMV)腿色斑腿色斑Chloroticspoting黃化黃化Yellowing病毒檢測(cè)病毒檢測(cè)二、病毒的分離與鑒定二、病毒的分離與鑒定提純提純extraction/純化純化purification病毒的分離與鑒定

6、病毒的分離與鑒定動(dòng)物接種動(dòng)物接種組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)標(biāo)本采集標(biāo)本采集標(biāo)本處理后接種標(biāo)本處理后接種雞胚接種雞胚接種卵黃囊膜卵黃囊膜尿囊液尿囊液羊膜腔液羊膜腔液絨毛尿囊膜絨毛尿囊膜觀察囊膜病變觀察囊膜病變血凝試驗(yàn)血凝試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)CPEEM包涵體包涵體空斑試驗(yàn)空斑試驗(yàn)紅細(xì)胞吸附紅細(xì)胞吸附中和試驗(yàn)中和試驗(yàn)觀察發(fā)病觀察發(fā)病抗原檢測(cè)抗原檢測(cè)抗體檢測(cè)抗體檢測(cè)病理檢查病理檢查 病毒的提純是將宿主中的病毒粒子與宿主細(xì)胞組分區(qū)分開來的過程。 原理是利用病毒的蛋白質(zhì)和大分子粒體的特性，及其與宿主細(xì)胞組分在理化特性上的差異將病毒粒子區(qū)分出來，并盡可能保持侵染力。 目的是確切地研究病毒理化、生物學(xué)特性、化學(xué)

7、組分、組成、增殖過程及機(jī)制，還可用于制備高效價(jià)的抗血清。 1953年，斯坦利第一次提取并結(jié)晶了 TMV，這是病毒學(xué)史上一個(gè)重要的里程碑。（一）病毒的純化與提純（一）病毒的純化與提純一般純化方法一般純化方法 動(dòng)物病毒的純化：動(dòng)物病毒的純化：從空斑、病斑分離，用終點(diǎn)稀釋法從空斑、病斑分離，用終點(diǎn)稀釋法 植物病毒的純化：植物病毒的純化： 如確定是一種病毒，且可機(jī)械摩擦接種，則如確定是一種病毒，且可機(jī)械摩擦接種，則接種到適當(dāng)寄主上；接種到適當(dāng)寄主上； 如可能有多種病毒，則要嫁接傳染，先將病如可能有多種病毒，則要嫁接傳染，先將病毒保存，然后試用蟲媒或其他方法分離。毒保存，然后試用蟲媒或其他方法分離。二、

8、病毒的分離與培養(yǎng)二、病毒的分離與培養(yǎng)1、差速離心和密度梯度離心、差速離心和密度梯度離心 差速離心：差速離心：交替使用高速和低速離心交替使用高速和低速離心高速離心（高速離心（4000080000g）使病毒沉淀，）使病毒沉淀，取沉淀取沉淀低速離心（約低速離心（約4000g）僅去除大的細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，）僅去除大的細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，取上清取上清 密度梯度離心：密度梯度離心：部分或完全根據(jù)顆粒在一個(gè)無對(duì)部分或完全根據(jù)顆粒在一個(gè)無對(duì)流介質(zhì)中的密度而獲得分離流介質(zhì)中的密度而獲得分離蔗糖蔗糖10%40%CsCl等等（三）病毒提純的技術(shù)（三）病毒提純的技術(shù)二、病毒的分離與培養(yǎng)二、病毒的分離與培養(yǎng)2、沉淀法、沉淀法

9、簡(jiǎn)便快速但粗糙易變性簡(jiǎn)便快速但粗糙易變性鹽析法鹽析法硫酸銨濃度達(dá)硫酸銨濃度達(dá)3050%飽和度時(shí)多數(shù)病毒沉淀飽和度時(shí)多數(shù)病毒沉淀等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀加醋酸或鹽酸加醋酸或鹽酸丙酮沉淀丙酮沉淀濃度達(dá)濃度達(dá)4070%聚乙二醇沉淀聚乙二醇沉淀濃度達(dá)濃度達(dá)48%乙醇沉淀乙醇沉淀濃度達(dá)濃度達(dá)20%沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸銨沉淀銨沉淀3、吸附法、吸附法磷酸鈣、離子交換樹脂、羧甲基纖維素磷酸鈣、離子交換樹脂、羧甲基纖維素4、酶處理、酶處理許多病毒抗許多病毒抗蛋白酶蛋白酶和和核酸酶核酸酶（三）病毒提純的技術(shù)（三）病毒提純的技術(shù)二、病毒的分離與培養(yǎng)二、病毒的分離與培養(yǎng)5、有機(jī)溶劑萃取、有

10、機(jī)溶劑萃取有機(jī)溶劑可溶掉脂肪、有色雜質(zhì)或非病毒的變有機(jī)溶劑可溶掉脂肪、有色雜質(zhì)或非病毒的變性蛋白，如脊髓灰質(zhì)炎病毒提純中用正丁醇：性蛋白，如脊髓灰質(zhì)炎病毒提純中用正丁醇：要考慮病毒對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性要考慮病毒對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性（三）病毒提純的技術(shù)（三）病毒提純的技術(shù)脂肪變性非病毒蛋白病毒水醇二、病毒的分離與培養(yǎng)二、病毒的分離與培養(yǎng)6、電泳法、電泳法普通電泳、密度梯度電泳、等電聚焦電泳等普通電泳、密度梯度電泳、等電聚焦電泳等7、柱層析法、柱層析法吸吸附：用離子交換或吸附法附：用離子交換或吸附法分子篩：瓊脂糖或葡聚糖制成凝膠柱分子篩：瓊脂糖或葡聚糖制成凝膠柱8、抗血清處理、抗血清處理針對(duì)宿主蛋白的

11、血清來沉淀雜蛋白針對(duì)宿主蛋白的血清來沉淀雜蛋白加病毒的抗血清形成病毒加病毒的抗血清形成病毒抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物（三）病毒提純的技術(shù)（三）病毒提純的技術(shù)二、病毒的分離與培養(yǎng)二、病毒的分離與培養(yǎng)要證明某種疾病是某一感染因子所引起則必須滿要證明某種疾病是某一感染因子所引起則必須滿足足Rivers法則：法則：從患病者體內(nèi)分離出病毒；從患病者體內(nèi)分離出病毒；在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或寄主細(xì)胞中可以培養(yǎng)；在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或寄主細(xì)胞中可以培養(yǎng)；證明這種培養(yǎng)物具有濾過性；證明這種培養(yǎng)物具有濾過性；在原始宿主或相關(guān)種內(nèi)能產(chǎn)生同樣的病癥；在原始宿主或相關(guān)種內(nèi)能產(chǎn)生同樣的病癥；能重新分離出病毒。能重新分離出病毒。 病毒的分離與鑒定組成

12、了病毒學(xué)診斷技術(shù)的主體。病毒的分離與鑒定組成了病毒學(xué)診斷技術(shù)的主體。 病毒分離病毒分離(virusisolation)是診斷病毒感染的是診斷病毒感染的“金標(biāo)金標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)”(goldstandard)。二、病毒的分離二、病毒的分離病毒的分離病毒的分離 組織培養(yǎng)組織培養(yǎng) 雞胚培養(yǎng)雞胚培養(yǎng) 動(dòng)物接種動(dòng)物接種組織培養(yǎng)：組織培養(yǎng)：原代細(xì)胞：原代細(xì)胞：新鮮組織新鮮組織+胰蛋白酶消化，分散胰蛋白酶消化，分散+培養(yǎng)液培養(yǎng)液成成單層細(xì)胞單層細(xì)胞二倍體細(xì)胞株二倍體細(xì)胞株：原代細(xì)胞傳代（原代細(xì)胞傳代（為二倍體細(xì)胞為二倍體細(xì)胞）傳代細(xì)胞系傳代細(xì)胞系：腫瘤組織或二倍體細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化腫瘤組織或二倍體細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化（非整倍體）（非

13、整倍體）二、病毒的分離與培養(yǎng)二、病毒的分離與培養(yǎng)卵黃囊接種：卵黃囊接種：用用58d雞胚，以細(xì)長(zhǎng)針由氣室端刺入卵黃雞胚，以細(xì)長(zhǎng)針由氣室端刺入卵黃囊，孵育后收集卵黃囊膜檢查。常用于一些嗜神經(jīng)病毒囊，孵育后收集卵黃囊膜檢查。常用于一些嗜神經(jīng)病毒羊膜腔：羊膜腔：用用1214d雞胚，將檢材注入羊膜腔，孵育后取羊雞胚，將檢材注入羊膜腔，孵育后取羊水檢查。常用于流感病毒的初次分離水檢查。常用于流感病毒的初次分離尿囊腔：尿囊腔：用用912d雞胚，將標(biāo)本接種于尿囊腔，孵育后取雞胚，將標(biāo)本接種于尿囊腔，孵育后取尿囊液檢查。常用于培養(yǎng)流感病毒和腮腺炎病毒等尿囊液檢查。常用于培養(yǎng)流感病毒和腮腺炎病毒等絨毛尿囊膜：絨毛

14、尿囊膜：用用1012d雞胚，無菌下開一小窗，將材料雞胚，無菌下開一小窗，將材料滴在絨毛尿囊膜上，孵育后觀察膜上有無斑點(diǎn)病滴在絨毛尿囊膜上，孵育后觀察膜上有無斑點(diǎn)病變。常用變。常用于培養(yǎng)單純皰疹病毒，天花病毒和痘病毒于培養(yǎng)單純皰疹病毒，天花病毒和痘病毒雞胚接種雞胚接種絨毛尿囊膜痘病毒特異性損傷絨毛尿囊膜痘病毒特異性損傷3.動(dòng)物接種動(dòng)物接種 常用動(dòng)物常用動(dòng)物小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病毒對(duì)動(dòng)物的敏感性不同，根據(jù)病毒種類不同病毒對(duì)動(dòng)物的敏感性不同，根據(jù)病毒種類加以選擇。加以選擇。 接種途徑接種途徑按病毒侵襲部位選擇相應(yīng)的接種途徑按病毒侵襲部位選擇相應(yīng)的接種途

15、徑： 乙型腦炎病毒及狂犬病毒乙型腦炎病毒及狂犬病毒小鼠腦內(nèi)接種小鼠腦內(nèi)接種 柯薩奇病毒柯薩奇病毒乳鼠腹腔接種乳鼠腹腔接種 乙肝病毒乙肝病毒黑猩猩靜脈注射黑猩猩靜脈注射 流感病毒流感病毒鼻腔滴種鼻腔滴種 用途用途分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清標(biāo)本制備標(biāo)本制備濃縮標(biāo)本有以下幾種方法：濃縮標(biāo)本有以下幾種方法：超速離心超速離心離心的時(shí)間和速度取決于病毒顆粒的大小和離心離心的時(shí)間和速度取決于病毒顆粒的大小和離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的半徑，一般是機(jī)轉(zhuǎn)頭的半徑，一般是30min到到3h沉淀的樣本用滅菌蒸沉淀的樣本用滅菌蒸餾水洗后再放到銅網(wǎng)上；餾水洗后再放到銅網(wǎng)上；超過濾法超過濾法用于

16、分子篩的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為用于分子篩的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為10000；接種細(xì)胞接種細(xì)胞接種細(xì)胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；接種細(xì)胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；免疫凝集免疫凝集如有特異抗血清，且病毒已知，也可用該法濃縮如有特異抗血清，且病毒已知，也可用該法濃縮病毒病毒1、正染法（超薄切片法、病組織）、正染法（超薄切片法、病組織）將細(xì)胞用戊二醛固定，然后脫水、包埋、切片、染色、觀察病毒顆粒，將細(xì)胞用戊二醛固定，然后脫水、包埋、切片、染色、觀察病毒顆粒，通常通常12d完成。完成。操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，但樣品可長(zhǎng)期保存，可觀察病毒粒子形態(tài)與發(fā)生過操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，但樣品可長(zhǎng)期保存，可觀察病毒粒子形態(tài)與發(fā)

17、生過程。程。2、負(fù)染法、負(fù)染法直接將病毒懸液直接將病毒懸液(也可用細(xì)胞也可用細(xì)胞)滴在銅網(wǎng)上，用重金屬滴在銅網(wǎng)上，用重金屬(通常用磷鎢酸通常用磷鎢酸)進(jìn)行染色，觀察病毒顆粒，進(jìn)行染色，觀察病毒顆粒，10-20min可出結(jié)果?？沙鼋Y(jié)果。原理：原理：負(fù)性染料不滲入病毒顆粒，而是將病毒顆粒包繞，由于負(fù)性染負(fù)性染料不滲入病毒顆粒，而是將病毒顆粒包繞，由于負(fù)性染料含重金屬使電子束不能穿透，病毒顆粒具有亮度，在周圍暗背景上料含重金屬使電子束不能穿透，病毒顆粒具有亮度，在周圍暗背景上顯示亮區(qū)顯示亮區(qū)較正染法顯示的圖像清晰，可顯示病毒的結(jié)構(gòu)。較正染法顯示的圖像清晰，可顯示病毒的結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：敏感性低，要求

18、病毒量在敏感性低，要求病毒量在107mL以上，同科病毒難于鑒別。以上，同科病毒難于鑒別。3、投影技術(shù)、投影技術(shù)4、膠體金標(biāo)記技術(shù)、與免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合、膠體金標(biāo)記技術(shù)、與免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合等等采用幾種電鏡技術(shù)觀采用幾種電鏡技術(shù)觀察病毒粒子的形態(tài)察病毒粒子的形態(tài)Orfvirus：口瘡病毒口瘡病毒(接觸性膿皰皮炎接觸性膿皰皮炎) )Ebolavirus埃博埃博拉病毒（正染技術(shù)）拉病毒（正染技術(shù)）Vacciniavirus痘苗病毒痘苗病毒（投影技術(shù)）（投影技術(shù)）負(fù)染技術(shù)負(fù)染技術(shù)美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心公布的一張未標(biāo)明日期的彩美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心公布的一張未標(biāo)明日期的彩色電子顯微照片。它顯示出色電子顯微照片。它顯示出H5N1型禽流感病毒（金型禽流感病毒（金黃色）在黃色）在MDCK細(xì)胞（綠色）培養(yǎng)液中的活動(dòng)狀態(tài)細(xì)胞（綠色）培養(yǎng)液中的活動(dòng)狀態(tài)電鏡技術(shù)的應(yīng)用電鏡技術(shù)的應(yīng)用 研究病毒形態(tài)、鑒定研究病毒形態(tài)、鑒定 觀察病毒的形態(tài)及形態(tài)發(fā)生學(xué)過程；亞顯微結(jié)構(gòu)；觀察病毒的形態(tài)及形態(tài)發(fā)生學(xué)過程；亞顯微結(jié)構(gòu)；病毒與宿主細(xì)胞的關(guān)系；病毒感染細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)病毒與宿主細(xì)胞的關(guān)系；病毒感染細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變；