dna提取的各種方法介紹

1、為了研究為了研究DNA分子在生命代謝中的作用，常常分子在生命代謝中的作用，常常需要從不同的生物材料中提取需要從不同的生物材料中提取DNA.由于由于DNA分子在生物體內(nèi)的分布及含量不同，要選擇適分子在生物體內(nèi)的分布及含量不同，要選擇適當(dāng)?shù)牟牧咸崛‘?dāng)?shù)牟牧咸崛NA。動(dòng)植物中，小牛胸腺動(dòng)植物中，小牛胸腺?動(dòng)物肝臟動(dòng)物肝臟?魚類精子，植魚類精子，植物種子的胚中都含有豐富的物種子的胚中都含有豐富的DNA。微生物中，谷氨酸菌體含微生物中，谷氨酸菌體含7%10%，面包酵母，面包酵母含含4%，啤酒酵母含，啤酒酵母含6%，大腸肝菌含，大腸肝菌含9%10%。從各種材料中提取從各種材料中提取DNA方法不同，分離提

2、取的方法不同，分離提取的難易程度也不同。難易程度也不同。對(duì)于低等生物。如從病毒中提取對(duì)于低等生物。如從病毒中提取DNA 比較容比較容易，多數(shù)病毒易，多數(shù)病毒DNA 分子量較小，提取時(shí)易保分子量較小，提取時(shí)易保持其結(jié)構(gòu)完整性。持其結(jié)構(gòu)完整性。從細(xì)菌及高等動(dòng)植物中提取從細(xì)菌及高等動(dòng)植物中提取DNA難度大一些。難度大一些。細(xì)菌細(xì)菌DNA 分子量較大，一般達(dá)分子量較大，一般達(dá)210 道爾頓。道爾頓。因此易被機(jī)械張力剪斷。細(xì)菌因此易被機(jī)械張力剪斷。細(xì)菌DNA，除核除核DNA 外，還有質(zhì)粒外，還有質(zhì)粒DNA 等。等。1、核酸的理化性質(zhì)、核酸的理化性質(zhì) RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色

3、類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。 天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA 時(shí)，先把DNP抽提出來，再把P除去，再除去細(xì)胞中的糖，RNA 及無機(jī)離子等，從中分離DNA 。 DNP和RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響而不同。DNP在低濃度鹽溶液中，幾乎不溶

4、解，如在0.14 mol/L的氯化鈉溶解度最低，僅為在水中溶解度的1%，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2倍。RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/L氯化鈉中溶解度較大。因此，在提取時(shí)， 常用此法分離這兩種核蛋白。細(xì)菌有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，首先要破碎經(jīng)胞。方細(xì)菌有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，首先要破碎經(jīng)胞。方 法有三種：法有三種： 機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、 勻漿法；勻漿法； 化學(xué)試劑法：用化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞；處理細(xì)胞； 酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可 使細(xì)胞壁破碎。

5、使細(xì)胞壁破碎。 2.細(xì)胞的破碎細(xì)胞的破碎由于高等動(dòng)物由于高等動(dòng)物DNA 主要存在于細(xì)胞核與線粒體中，主要存在于細(xì)胞核與線粒體中，所以提取時(shí)有兩個(gè)困難（高等植物與此類似）：所以提取時(shí)有兩個(gè)困難（高等植物與此類似）： 破碎細(xì)胞難；從處死動(dòng)物破碎細(xì)胞難；從處死動(dòng)物?分離組織器宮到分離組織器宮到破碎細(xì)胞費(fèi)時(shí)長。在此時(shí)期間破碎細(xì)胞費(fèi)時(shí)長。在此時(shí)期間DNA 可能會(huì)被可能會(huì)被DN ase降解，而動(dòng)物組織：特別是肌肉組織很難破碎降解，而動(dòng)物組織：特別是肌肉組織很難破碎,即使是較易破碎的肝即使是較易破碎的肝?腎等組織也往往使用組織腎等組織也往往使用組織勻漿器，易造成勻漿器，易造成DNA 斷裂。斷裂。 分子量大，

6、一般比細(xì)菌的大分子量大，一般比細(xì)菌的大23個(gè)數(shù)量級(jí)，個(gè)數(shù)量級(jí)，比病毒的大比病毒的大45個(gè)數(shù)量。對(duì)不同生物材料，要根個(gè)數(shù)量。對(duì)不同生物材料，要根據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x提取方法。據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x提取方法。3.DNA提取的幾種方法(1).濃鹽法 利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1M 氯 納提取化鈉抽提,得到的DNP粘液與含有少量辛醇的 氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA 鈉鹽沉淀出來. 也可用0.15 MNaCL液反復(fù)洗滌細(xì)胞破碎液除去RNP,再以1MNaC

7、L提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿-異醇法除去蛋白.兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些. 以稀鹽酸溶液提取DNA 時(shí),加入適量去污劑,如SDS可有助于蛋白質(zhì)與DNA 的分離。在提取過程中為抑制組織中的DNase對(duì)DNA 的降解作用,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑.通常用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉,并稱SSC溶液,提取DNA. （2）.陰離子去污劑法: 用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA .由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,因?yàn)殛庪x子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA.（3）.苯酚抽提法:

8、苯酚作為蛋白變性劑,同時(shí)抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時(shí),由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA 。此時(shí)DNA是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃漫漫繞成一團(tuán)，取出。此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài) .（ 4）.水抽提法: 利用核酸溶解于水的性質(zhì),將組織細(xì)胞破碎后,用低鹽溶液除去RNA，然后將沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,離心后收集上清液.在上清中加入固體氯化鈉調(diào)節(jié)至2.6M.加入2倍體積95%乙醇,立即用

9、攪拌法攪出.然后分別用66% ?80%和95%乙醇以及丙銅洗滌,最后在空氣中干燥,既得DNA樣品.此法提取的DNA中蛋白質(zhì)含量較高,故一般不用.為除蛋白可將此法加以改良,在提取過程中加入SDS. 1. 操作步驟: 取鮮豬脾,去脂、血,稱取10g,用預(yù)冷的1SSC溶液洗2次，剪碎。 按睥：1SSC=1; 5W/V 加入50ml預(yù)冷的1SSC，用高速組織搗碎機(jī)破碎8次,每次5秒,中間間隔30秒。 將勻漿液放在燒杯中， 于冰鹽浴中冷卻30分鐘。4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。充掉上清。沉淀物中再加2倍體積的1SSC攪勻，離心，棄上清，重復(fù)2次。 將所得沉淀懸于5倍體積的PH8.0、0.15MNaCL0

10、.1Na2MEDTA溶液中。邊攪拌邊漫漫滴加5%SDS最終濃度達(dá)1%為止。然后加入固體氯化鈉使其最終濃度達(dá)1mol/L，繼續(xù)攪60分鐘，以確保氯化鈉全溶。所得混合液倒入磨口塞的錐形瓶中，加入同體積氯仿異戊醇，激烈振蕩20分鐘，4000r離心20分鐘，上層水相取出后倒入燒杯，以同積氯仿異戊醇重復(fù)去蛋白2次。 取出水相于燒杯中，逐漸加入2倍體積95%乙醇，玻棒攪動(dòng)，DNA纖維繞于璃玻棒上后擠干，用70%乙醇洗DNA纖維2次，用95%乙醇洗一次，再用乙醚洗一次，取出并擠干。 2. 實(shí)驗(yàn)材料，儀器和試劑： （1） 實(shí)驗(yàn)材料：新鮮豬脾： （2）儀器：量筒：110、3100燒杯：2100，2250；磨口錐

11、形瓶：1250、1500；吸管：11、110；滴管、玻棒、離心機(jī)、電動(dòng)攪拌器、臺(tái)秤、剪刀、鑷子。 （3） 試劑： 20SSC：175.2gNaCL，88.2g檸檬酸鈉2H2O，PH=7.0加水至1000ml； 1SSC，0.1SSC由做相應(yīng)的稀釋得來； NaCL-Na2EDTA液：8.77gNaCL，3.72gNa2EDTA溶于800ml蒸餾水中，用固體NaOH調(diào)PH=8后定容至1000； 5%SDS（W/V）：6gSDS溶于100ml45%乙醇中； 氯仿-異戊醇=24：1（體積比） 其他:95%乙醇，鹽冰. 數(shù)據(jù):DNA重,產(chǎn)率: 待測液中測得的核酸g數(shù) DNA%= 100 待測液中制品的g

12、數(shù) 強(qiáng)酸、加熱條件下，可以使DNA中的嘌呤堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，而產(chǎn)生嘌呤堿基，脫氧核糖與嘧啶核苷酸。其中2脫氧核糖在酸性環(huán)境中成為羥基酮基戊醛，此物與二苯胺反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，在595nm處有最大吸收。DNA在40-400g范圍內(nèi)光密度與DNA濃度成正比。在反應(yīng)液中加入少量乙醛可提高靈敏度，而且其他化合物的干擾也顯著降低。當(dāng)樣品含少量RNA時(shí)不影響測定，而蛋白質(zhì)、多種糖及其衍生物芳香，羥基醛都能與二 苯 胺 形 成 各 種 有 色 物 質(zhì) ， 干 擾 測 定。 、二苯胺試劑：使用前稱取0.8g二苯胺（需在70%乙醇試劑中重結(jié)晶2次)，溶于180ml冰乙酸中，再加入8ml過氯酸（60%

13、以上），混勻待用，臨用前加入0.8ml 1.6%乙醛溶液，所配試劑應(yīng)為無色。 每組需56ml 共需2800ml 、DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液：（須經(jīng)定磷法確定其濃度）取標(biāo)準(zhǔn)DNA以0.01N NAOH配成200微克毫升的標(biāo)準(zhǔn)液。 每組需12ml 共需600ml 、1.6%乙醛：取47%乙醛3.4ml，加重蒸水定容至100ml（放于冰箱中，一周之內(nèi)可以使用）。 共需70ml 、(測樣品液：準(zhǔn)確稱取豬脾DNA或用紫外分光法中剩下的DNA液配成10微克毫升的溶液。 每組需4ml 共需200ml 操作方法： 1. DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定： 取10支試管，分成2組，依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mlDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。添加蒸餾水，使之都成為2ml。另取2只試管，各加2ml蒸餾水作為對(duì)照。然后各加入4ml二苯胺試劑，混勻。于60 恒溫水浴中保溫1h，冷卻后于595nm處進(jìn)行比色測定。取兩管平均值，以DNA濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為