第三章 吸附層析

1、 第三章第三章 吸附層析吸附層析 層析又稱為層析又稱為色譜或色層色譜或色層，是俄國植物學(xué)家，是俄國植物學(xué)家茨維茨維特特在分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)并最先應(yīng)用的一種分離在分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)并最先應(yīng)用的一種分離純化方法。其純化方法。其總的原理總的原理是根據(jù)各種被分離組分在是根據(jù)各種被分離組分在固定相和流動(dòng)相的固定相和流動(dòng)相的分配系數(shù)分配系數(shù)不同達(dá)到分離的目的。不同達(dá)到分離的目的。 層析法層析法根據(jù)層析類型根據(jù)層析類型分，可分為柱層析、紙層析和分，可分為柱層析、紙層析和薄層層析；薄層層析；根據(jù)具體分離原理根據(jù)具體分離原理分，可分為吸附層析、分分，可分為吸附層析、分配層析、疏水層析、離子交換層析、親和層析、凝

2、膠過配層析、疏水層析、離子交換層析、親和層析、凝膠過濾層析等具體層析方法濾層析等具體層析方法 吸附層析（吸附層析（absorption chromatographyabsorption chromatography）又又稱色層法或色譜法；是根據(jù)各種被分離組分在固稱色層法或色譜法；是根據(jù)各種被分離組分在固定相和流動(dòng)相的分配系數(shù)不同達(dá)到分離的目的一定相和流動(dòng)相的分配系數(shù)不同達(dá)到分離的目的一類分離純化方法。類分離純化方法。吸附層析的概念吸附層析的概念 教學(xué)目的教學(xué)目的掌握掌握基本原理和操作方法基本原理和操作方法 吸附柱層析吸附柱層析薄層層析薄層層析聚酰胺薄層層析聚酰胺薄層層析 層析方法的類型層析方法

3、的類型 第一節(jié)第一節(jié) 吸附柱層析吸附柱層析 吸附柱層析是以吸附柱層析是以固體吸附劑固體吸附劑為固定相制為固定相制備成色譜柱，以備成色譜柱，以有機(jī)溶劑或緩沖液有機(jī)溶劑或緩沖液為流動(dòng)相，為流動(dòng)相，用于分離純化的一種層析方法用于分離純化的一種層析方法 。吸附柱層析的概念吸附柱層析的概念吸附層析的吸附層析的固定相固定相極性極性: :如羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁、人造沸石等如羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁、人造沸石等非極性：如活性碳等非極性：如活性碳等流動(dòng)相通常為有機(jī)溶劑或緩沖液流動(dòng)相通常為有機(jī)溶劑或緩沖液一、常一、常 用用 術(shù)術(shù) 語語 1 1固定相固定相 固定相是由層析基質(zhì)組成的。其基質(zhì)包括固體物固定相是由層

4、析基質(zhì)組成的。其基質(zhì)包括固體物質(zhì)質(zhì)( (如吸附劑、離子交換劑如吸附劑、離子交換劑) )和液體物質(zhì)和液體物質(zhì)( (如固定在如固定在纖維素或硅膠上的溶液纖維素或硅膠上的溶液) )，這些物質(zhì)，這些物質(zhì)能與相關(guān)的化能與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆性的吸附、溶解和交換作用合物進(jìn)行可逆性的吸附、溶解和交換作用n2 2流動(dòng)相流動(dòng)相n 在層析過程中推動(dòng)固定相上的物質(zhì)向一定在層析過程中推動(dòng)固定相上的物質(zhì)向一定方向移動(dòng)的液體或氣體。在柱層析中又稱為方向移動(dòng)的液體或氣體。在柱層析中又稱為洗洗脫劑或洗滌劑脫劑或洗滌劑；在薄層層析中又稱為；在薄層層析中又稱為展開劑展開劑3 3層析層析 以基質(zhì)為固定相以基質(zhì)為固定相( (柱狀或薄

5、層狀柱狀或薄層狀) )，以液體或，以液體或氣體為流動(dòng)相，使有效成分和雜質(zhì)在這兩個(gè)相中氣體為流動(dòng)相，使有效成分和雜質(zhì)在這兩個(gè)相中連續(xù)多次地進(jìn)行分配、吸附或交換，最終使混合連續(xù)多次地進(jìn)行分配、吸附或交換，最終使混合物得到分離的過程。物得到分離的過程。4 4操作容量操作容量 是反映基質(zhì)（固定相）對(duì)某種成分的結(jié)合能是反映基質(zhì)（固定相）對(duì)某種成分的結(jié)合能力的指標(biāo)；它表示在特定條件下，某種成分與基力的指標(biāo)；它表示在特定條件下，某種成分與基質(zhì)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量，質(zhì)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量，一般以每克一般以每克( (或毫升或毫升) )基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾基質(zhì)結(jié)合某種成分的

6、毫摩爾數(shù)或毫克數(shù)來表示。數(shù)或毫克數(shù)來表示。其數(shù)值大，表明基質(zhì)對(duì)某種其數(shù)值大，表明基質(zhì)對(duì)某種成分的結(jié)合力強(qiáng)；否則反之。成分的結(jié)合力強(qiáng)；否則反之。5 5床體積床體積( (V Vt t) ) 是指膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有是指膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積的體積( (V Vt t) )。它是基質(zhì)的外水體積它是基質(zhì)的外水體積( (V Vo o) )和內(nèi)水體積和內(nèi)水體積( (V Vi i) )以及自身體積以及自身體積( (V Vg g) )的總的總和，詳見圖和，詳見圖3-13-1，即，即V=VV=Vo o+V+Vi i+V+Vg gn6洗脫體積洗脫體積(Ve)n 是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液

7、中是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)到最大值時(shí)的流動(dòng)相體積。用出現(xiàn)濃度達(dá)到最大值時(shí)的流動(dòng)相體積。用V Ve e 表示表示( (見圖見圖3-73-7中中OB) OB) 7 7外水體積外水體積( (V Vo o) ) 外水體積指基質(zhì)顆粒之間體積的總和外水體積指基質(zhì)顆粒之間體積的總和8 8內(nèi)水體積內(nèi)水體積( (V Vi i) ) 內(nèi)水體積是指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和內(nèi)水體積是指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和 9基質(zhì)體積基質(zhì)體積(Vg) 基質(zhì)體積是指基質(zhì)自身所具有的體積?；|(zhì)體積是指基質(zhì)自身所具有的體積。 V Vo o、V Vi i和和V Vg g都是隨著床體積和基質(zhì)性質(zhì)變化而都是隨著床體積和基質(zhì)性

8、質(zhì)變化而變化的變化的1010膨脹度膨脹度 在一定溶液中，單位重量的基質(zhì)充分溶脹后所占有的體積在一定溶液中，單位重量的基質(zhì)充分溶脹后所占有的體積（用（用V V表示）。即每克溶脹基質(zhì)所具有的床體積表示）。即每克溶脹基質(zhì)所具有的床體積 一般親水性基質(zhì)的膨脹度比疏水性的大一般親水性基質(zhì)的膨脹度比疏水性的大1111分配系數(shù)分配系數(shù) 是指一組分在固定相與流動(dòng)相中含量的比值，常用是指一組分在固定相與流動(dòng)相中含量的比值，常用K K表示表示12.12.遷移率遷移率 指一組分在相同時(shí)間內(nèi)，在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相移指一組分在相同時(shí)間內(nèi)，在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相移動(dòng)距離之比值。常用動(dòng)距離之比值。常用R Rf f

9、表示表示 二、基本原理二、基本原理 利用被分離樣品中利用被分離樣品中不同組分與吸附劑之間吸附能力不同組分與吸附劑之間吸附能力的的差異（或各組分的分配系數(shù)不同）進(jìn)行分離。吸附能力大差異（或各組分的分配系數(shù)不同）進(jìn)行分離。吸附能力大（或分配系數(shù)大）的組分在柱子上的保留時(shí)間長(zhǎng)，吸附能力（或分配系數(shù)大）的組分在柱子上的保留時(shí)間長(zhǎng)，吸附能力?。ɑ蚍峙湎禂?shù)小）的組分很快被洗脫。?。ɑ蚍峙湎禂?shù)?。┑慕M分很快被洗脫。 混合物在層析柱中分離的過程實(shí)質(zhì)上是吸附與解吸附的過混合物在層析柱中分離的過程實(shí)質(zhì)上是吸附與解吸附的過程程三、吸三、吸 附附 劑劑 （一）吸附劑的選擇（一）吸附劑的選擇1.1.具備條件：具備條件：

10、表面積大、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本表面積大、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低廉等低廉等2.2.選擇原則：由吸附劑本身和被吸附物質(zhì)的理化性質(zhì)而定。選擇原則：由吸附劑本身和被吸附物質(zhì)的理化性質(zhì)而定。根據(jù)根據(jù)“相似相溶相似相溶”原理，為了便于解吸附（洗脫），對(duì)于原理，為了便于解吸附（洗脫），對(duì)于極性強(qiáng)的分離物，應(yīng)選擇極性小的吸附劑；而對(duì)于極性弱極性強(qiáng)的分離物，應(yīng)選擇極性小的吸附劑；而對(duì)于極性弱的分離物則選擇極性強(qiáng)的吸附劑。的分離物則選擇極性強(qiáng)的吸附劑。（二）吸附劑的性質(zhì)（二）吸附劑的性質(zhì)2020世紀(jì)世紀(jì)5050年代初期，年代初期，TiseliusTiselius等用制備的羥基磷等用制備的羥基磷灰石

11、灰石 CaCa5 5(P0(P04 4) )3 3OHOH2 2（HAHA）分離蛋白質(zhì)。目前國內(nèi)）分離蛋白質(zhì)。目前國內(nèi)已有商品出售已有商品出售 1.羥基磷灰石羥基磷灰石 （1）性質(zhì)）性質(zhì) 吸附容量高吸附容量高穩(wěn)定性好（穩(wěn)定性好（T T8585，pH5.510.0pH5.510.0均可使用）均可使用）使用廣泛（可用于制備和純化使用廣泛（可用于制備和純化propro、酶、核酸等）、酶、核酸等）分離效果好分離效果好HAHA的的CaCa基團(tuán)與生物分子表面的負(fù)電荷基團(tuán)的作用，基團(tuán)與生物分子表面的負(fù)電荷基團(tuán)的作用，對(duì)分離起重要作用；而對(duì)分離起重要作用；而POPO4 4基團(tuán)與生物分子表面的正基團(tuán)與生物分子表

12、面的正電荷的作用僅起次要作用電荷的作用僅起次要作用u使用使用HA作為固定相基質(zhì)時(shí)應(yīng)注意作為固定相基質(zhì)時(shí)應(yīng)注意HAHA為干粉時(shí)，需事先浸泡膨脹達(dá)到為干粉時(shí)，需事先浸泡膨脹達(dá)到23ml/g23ml/g后，按后，按1616加加入緩沖液懸浮，除去細(xì)小的顆粒入緩沖液懸浮，除去細(xì)小的顆粒HAHA懸浮液需用旋渦振蕩器混合，因?yàn)槠渌麛嚢杵魅绱虐?、懸浮液需用旋渦振蕩器混合，因?yàn)槠渌麛嚢杵魅绱虐?、玻棒等易破壞其晶體結(jié)構(gòu)玻棒等易破壞其晶體結(jié)構(gòu)忌用檸檬酸緩沖液和忌用檸檬酸緩沖液和pHpH5.55.5的緩沖液處理的緩沖液處理色譜柱再生時(shí)，先用色譜柱再生時(shí)，先用1 mol/L NaCl1 mol/L NaCl洗滌，然后用

13、洗滌，然后用4 4倍床體倍床體積的平衡緩沖液沖洗即可積的平衡緩沖液沖洗即可細(xì)顆粒細(xì)顆粒HAHA的操作容量和分辨率均較大顆粒高，但須采用較的操作容量和分辨率均較大顆粒高，但須采用較大直徑的柱子大直徑的柱子2.2.硅膠硅膠（1）性質(zhì)）性質(zhì)含水量：含水量高，則吸附性（活性）小，當(dāng)含水量：含水量高，則吸附性（活性）小，當(dāng)其表面游離水含量其表面游離水含量17%17%時(shí)，其結(jié)合力很?。淮藭r(shí)時(shí)，其結(jié)合力很?。淮藭r(shí)僅能作為分配層析的固定相僅能作為分配層析的固定相粒度：粒度小，則分離效果較好（如用粒度：粒度小，則分離效果較好（如用200400200400目的硅膠能有效地分離多種主物的有效成分）目的硅膠能有效地分

14、離多種主物的有效成分）（2 2）活化：）活化：110110烘烤烘烤0.51h0.51h?；罨罅⒓词褂没蚨唐谫A存?；罨罅⒓词褂没蚨唐谫A存與干燥器中與干燥器中四、洗脫劑四、洗脫劑條件條件 純度較高純度較高穩(wěn)定性好穩(wěn)定性好能較完全地洗脫下被分離的成分能較完全地洗脫下被分離的成分黏度小黏度小易和所需的成分分開易和所需的成分分開選擇洗脫劑的順序應(yīng)從極性小選擇洗脫劑的順序應(yīng)從極性小 大大 一般，一般，pro或核酸被極性強(qiáng)的或核酸被極性強(qiáng)的HA吸附后，要用含有吸附后，要用含有鹽梯度的緩沖液洗脫；而甾體、色素等化合物被極性較鹽梯度的緩沖液洗脫；而甾體、色素等化合物被極性較弱的硅膠吸附后，則可用有機(jī)溶劑洗脫

15、。弱的硅膠吸附后，則可用有機(jī)溶劑洗脫。五、層析柱的制備和層析操作五、層析柱的制備和層析操作（一）層析柱（一）層析柱 層析柱是下端為細(xì)口并帶有篩板的玻管。柱子的直徑層析柱是下端為細(xì)口并帶有篩板的玻管。柱子的直徑與長(zhǎng)度之比一般為與長(zhǎng)度之比一般為110110- -140140；吸附劑顆粒極細(xì)時(shí)，宜選用；吸附劑顆粒極細(xì)時(shí)，宜選用大比例（粗）的層析柱，反之用細(xì)層析柱，這樣可節(jié)省時(shí)間大比例（粗）的層析柱，反之用細(xì)層析柱，這樣可節(jié)省時(shí)間和提高分辨率。層析柱的床體積由吸附劑的量和膨脹度決定和提高分辨率。層析柱的床體積由吸附劑的量和膨脹度決定n 吸附劑的用量主要由吸附劑自身的操作容量和分離物吸附劑的用量主要由吸

16、附劑自身的操作容量和分離物中各成分的性質(zhì)決定（一般為被分離樣品的中各成分的性質(zhì)決定（一般為被分離樣品的3030- -5050倍）。倍）。n當(dāng)操作容量小時(shí)，則吸附劑用量要大；另外，當(dāng)樣品中各當(dāng)操作容量小時(shí)，則吸附劑用量要大；另外，當(dāng)樣品中各組分的性質(zhì)相似，難以分開時(shí)，應(yīng)加大吸附劑的用量，有組分的性質(zhì)相似，難以分開時(shí)，應(yīng)加大吸附劑的用量，有時(shí)甚至超過時(shí)甚至超過100100倍。倍。（二）吸附劑的用量（二）吸附劑的用量（三）裝柱（三）裝柱1.干法裝柱干法裝柱 直接加吸附劑至柱中，然后倒入溶劑，此法直接加吸附劑至柱中，然后倒入溶劑，此法不易排盡氣泡，容易導(dǎo)致層析不均勻不易排盡氣泡，容易導(dǎo)致層析不均勻2.

17、濕法裝柱濕法裝柱 先加適量溶劑至柱內(nèi)，排走空氣，然后將預(yù)先浸泡先加適量溶劑至柱內(nèi)，排走空氣，然后將預(yù)先浸泡好的吸附劑攪均，隨即將此混懸液傾入柱中（圖好的吸附劑攪均，隨即將此混懸液傾入柱中（圖3-53-5）；）；待其自然沉淀至柱高的待其自然沉淀至柱高的1/4 1/4 - - 1/3 1/3 時(shí)，打開下端出口，時(shí)，打開下端出口，讓溶劑慢慢流出，使柱子上端懸浮液徐徐下降至需要的讓溶劑慢慢流出，使柱子上端懸浮液徐徐下降至需要的高度；并用高度；并用2 2- -3 3倍量的洗脫劑流過層析柱，使其達(dá)到平衡倍量的洗脫劑流過層析柱，使其達(dá)到平衡注：注：吸附劑表面要平整，應(yīng)一直浸泡在溶劑液面以下，嚴(yán)吸附劑表面要平

18、整，應(yīng)一直浸泡在溶劑液面以下，嚴(yán)防產(chǎn)生氣泡。濕法裝柱均勻，不易留有氣泡防產(chǎn)生氣泡。濕法裝柱均勻，不易留有氣泡（四）上樣和洗脫（四）上樣和洗脫經(jīng)平衡好的層析柱，當(dāng)平衡液到達(dá)固定相表面時(shí)，經(jīng)平衡好的層析柱，當(dāng)平衡液到達(dá)固定相表面時(shí)，用滴管輕輕地將待分離樣品液加置固定相表面（注意用滴管輕輕地將待分離樣品液加置固定相表面（注意避免沖動(dòng)基質(zhì)，且樣品液體積應(yīng)小于床體積的避免沖動(dòng)基質(zhì)，且樣品液體積應(yīng)小于床體積的1/21/2）；）；待樣品液進(jìn)入固定相時(shí)，用滴管加洗脫劑，并在上端待樣品液進(jìn)入固定相時(shí)，用滴管加洗脫劑，并在上端連接洗脫劑瓶連續(xù)洗脫，同時(shí)下端與部分收集器接通，連接洗脫劑瓶連續(xù)洗脫，同時(shí)下端與部分收集

19、器接通，分級(jí)收集。分級(jí)收集。n將收集的每管溶液進(jìn)行濃縮和活性測(cè)定。以管號(hào)或洗脫體積將收集的每管溶液進(jìn)行濃縮和活性測(cè)定。以管號(hào)或洗脫體積為橫坐標(biāo)，每管樣品的濃度或活度為縱坐標(biāo)，若層析峰無重疊，為橫坐標(biāo)，每管樣品的濃度或活度為縱坐標(biāo)，若層析峰無重疊，則各成分能完全分離（圖則各成分能完全分離（圖3-73-7）n為了獲得滿意分離效果，洗脫速度恰當(dāng)控制（若太快，洗脫為了獲得滿意分離效果，洗脫速度恰當(dāng)控制（若太快，洗脫物在兩相中平衡不完全；太慢，則洗脫物會(huì)擴(kuò)散；結(jié)果都會(huì)導(dǎo)物在兩相中平衡不完全；太慢，則洗脫物會(huì)擴(kuò)散；結(jié)果都會(huì)導(dǎo)致分離度下降）致分離度下降）n分離出的樣品經(jīng)濃縮或凍干處理后，可進(jìn)行純度測(cè)定及保存

20、分離出的樣品經(jīng)濃縮或凍干處理后，可進(jìn)行純度測(cè)定及保存 加加 樣樣 操操 作作 示示 意意 圖圖（五）柱子再生（五）柱子再生各種層析柱，其再生方法因固定相不同而異各種層析柱，其再生方法因固定相不同而異(1)純化生命物質(zhì)純化生命物質(zhì)72： 天然的雙鏈天然的雙鏈(ds)和熱變性單鏈和熱變性單鏈(ss)小牛胸腺小牛胸腺DNA在在HA層析柱層析柱的分離圖譜的分離圖譜 六、實(shí)例應(yīng)用六、實(shí)例應(yīng)用(2)分離蛋白質(zhì)的亞基分離蛋白質(zhì)的亞基114 14C-組氨酸標(biāo)記的兔球蛋白亞基在組氨酸標(biāo)記的兔球蛋白亞基在HA層析柱的分離圖譜層析柱的分離圖譜 第二節(jié)第二節(jié) 薄薄 層層 層層 析析 薄層層析薄層層析( (thin layer chromatographythin layer chromatography，TLC)TLC)是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固定相，以液體為流動(dòng)相的一種層析方法定相，以液體為流動(dòng)相的一種層析方法薄層層析的概念薄層層析的概念 1 1展層時(shí)間短