生化技術(shù)：3吸附層析

1、 第三章第三章 吸吸 附附 層層 析析 層析又稱為色譜或色層，是俄國植物學(xué)家茨層析又稱為色譜或色層，是俄國植物學(xué)家茨維特在分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)并最先應(yīng)用的一種分維特在分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)并最先應(yīng)用的一種分離純化方法。其總的原理是離純化方法。其總的原理是根據(jù)各種被分離組分根據(jù)各種被分離組分在固定相和流動(dòng)相的在固定相和流動(dòng)相的分配系數(shù)分配系數(shù)不同不同達(dá)到分離的目達(dá)到分離的目的的 層析法根據(jù)其層析類型，可分為柱層析、紙層析法根據(jù)其層析類型，可分為柱層析、紙層析和薄層層析；根據(jù)具體分離原理分，可分為層析和薄層層析；根據(jù)具體分離原理分，可分為吸附層析、分配層析、疏水層析、離子交換層析、吸附層析、分配層析、疏

2、水層析、離子交換層析、親和層析、凝膠過濾層析等具體層析方法親和層析、凝膠過濾層析等具體層析方法 吸附層析（吸附層析（absorption chromatography）又稱色層法又稱色層法或色譜法；是根據(jù)各種被分離組分在固定相和流動(dòng)相的或色譜法；是根據(jù)各種被分離組分在固定相和流動(dòng)相的分配系數(shù)分配系數(shù)不同達(dá)到分離的目的一類分離純化方法不同達(dá)到分離的目的一類分離純化方法吸附層析的概念吸附層析的概念 目目 的的掌握掌握吸附柱層析、薄層層析及聚酰胺薄層層析的基本原理和操作方法吸附柱層析、薄層層析及聚酰胺薄層層析的基本原理和操作方法 層層 析析 方方 法法 的的 類類 型型 第一節(jié)第一節(jié) 吸吸 附附 柱

3、柱 層層 析析 吸附柱層析是以吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相固體吸附劑為固定相制備成色譜制備成色譜柱，以柱，以有機(jī)溶劑或緩沖液為流動(dòng)相有機(jī)溶劑或緩沖液為流動(dòng)相，用于分離純化的，用于分離純化的一種層析方法一種層析方法 吸附柱層析的概念吸附柱層析的概念吸附層析吸附層析的固定相的固定相極性極性:如羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁、人造沸石等如羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁、人造沸石等非極性：如活性碳等非極性：如活性碳等流動(dòng)相通常為有機(jī)溶劑或緩沖液流動(dòng)相通常為有機(jī)溶劑或緩沖液一、常一、常 用用 術(shù)術(shù) 語語 1固定相固定相 固定相是由層析基質(zhì)組成的。其基質(zhì)包括固體物質(zhì)固定相是由層析基質(zhì)組成的。其基質(zhì)包括固體物質(zhì)(如

4、吸如吸附劑、離子交換劑附劑、離子交換劑)和液體物質(zhì)和液體物質(zhì)(如固定在纖維素或硅膠上的如固定在纖維素或硅膠上的溶液溶液)，這些物質(zhì)，這些物質(zhì)能與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆性的吸附、溶能與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆性的吸附、溶解和交換作用解和交換作用2流動(dòng)相流動(dòng)相 在層析過程中推動(dòng)固定相上的物質(zhì)向一定方向移動(dòng)的液在層析過程中推動(dòng)固定相上的物質(zhì)向一定方向移動(dòng)的液體或氣體。在柱層析中又稱為洗脫劑或洗滌劑；在薄層層體或氣體。在柱層析中又稱為洗脫劑或洗滌劑；在薄層層析中又稱為展開劑析中又稱為展開劑3層析層析 以基質(zhì)為固定相以基質(zhì)為固定相(柱狀或薄層狀柱狀或薄層狀)，以液體或氣體為流動(dòng)，以液體或氣體為流動(dòng)相，使有效成

5、分和雜質(zhì)在這相，使有效成分和雜質(zhì)在這兩個(gè)相中連續(xù)多次地進(jìn)行兩個(gè)相中連續(xù)多次地進(jìn)行分分配、吸附或交換配、吸附或交換，最終使混合物得到分離，最終使混合物得到分離的過程的過程4操作容量操作容量 是反映基質(zhì)（固定相）對(duì)某種成分的結(jié)合能力的指標(biāo)是反映基質(zhì)（固定相）對(duì)某種成分的結(jié)合能力的指標(biāo)；它表示在特定條件下，某種成分與基質(zhì)反應(yīng)達(dá)到平衡；它表示在特定條件下，某種成分與基質(zhì)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量，一般以每克時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量，一般以每克(或毫升或毫升)基基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)或毫克數(shù)來表示。質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)或毫克數(shù)來表示。其數(shù)值大其數(shù)值大，表明基質(zhì)對(duì)某種成分的結(jié)合力強(qiáng)；

6、否則反之，表明基質(zhì)對(duì)某種成分的結(jié)合力強(qiáng)；否則反之5床體積床體積(Vt) 是指膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所是指膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積占有的體積(Vt)。它是基質(zhì)的外水體積它是基質(zhì)的外水體積(Vo)和內(nèi)水體積和內(nèi)水體積(Vi)以及自身體積以及自身體積(Vg)的的總和，詳見圖總和，詳見圖3-1，即，即V=Vo+Vi+Vg6洗脫體積洗脫體積(Ve) 是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)到最大值時(shí)的流動(dòng)相到最大值時(shí)的流動(dòng)相體積。用體積。用Ve 表示表示(見圖見圖3-7中中OB) 7外水體積外水體積(Vo) 外水體積指基質(zhì)顆粒之間體積的總和外

7、水體積指基質(zhì)顆粒之間體積的總和 8內(nèi)水體積內(nèi)水體積(Vi) 內(nèi)水體積是指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和內(nèi)水體積是指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和 9基質(zhì)體積基質(zhì)體積(Vg) 基質(zhì)體積是指基質(zhì)自身所具有的體積?；|(zhì)體積是指基質(zhì)自身所具有的體積。 Vo、Vi和和Vg都是隨著床體積和基質(zhì)性質(zhì)變化而變都是隨著床體積和基質(zhì)性質(zhì)變化而變化的化的10膨脹度膨脹度 在一定溶液中，單位重量的基質(zhì)充分溶脹后所占有的體積在一定溶液中，單位重量的基質(zhì)充分溶脹后所占有的體積（用（用V表示）。即每克溶脹基質(zhì)所具有的床體積表示）。即每克溶脹基質(zhì)所具有的床體積 一般親水性基質(zhì)的膨脹度比疏水性的大一般親水性基質(zhì)的膨脹度比疏水性的大11分配系數(shù)

8、分配系數(shù) 是指一組分在固定相與流動(dòng)相中含量的比值，常用是指一組分在固定相與流動(dòng)相中含量的比值，常用K表示表示12.遷移率遷移率 指一組分在相同時(shí)間內(nèi)，在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相移指一組分在相同時(shí)間內(nèi)，在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相移動(dòng)距離之比值。常用動(dòng)距離之比值。常用Rf表示表示 二、基本原理二、基本原理 利用被分離樣品中不同組分與吸附劑之間利用被分離樣品中不同組分與吸附劑之間吸附能力吸附能力的差異的差異（或各組分的分配系數(shù)不同）進(jìn)行分離。吸附能力大（或分（或各組分的分配系數(shù)不同）進(jìn)行分離。吸附能力大（或分配系數(shù)大）的組分在柱子上的保留時(shí)間長(zhǎng)，吸附能力小（或配系數(shù)大）的組分在柱子上的保留時(shí)間長(zhǎng)，吸

9、附能力?。ɑ蚍峙湎禂?shù)?。┑慕M分很快被洗脫分配系數(shù)小）的組分很快被洗脫 混合物在層析柱中分離的過程實(shí)質(zhì)上是吸附與解吸附的混合物在層析柱中分離的過程實(shí)質(zhì)上是吸附與解吸附的過程過程三、吸三、吸 附附 劑劑 （一）吸附劑的選擇（一）吸附劑的選擇1.具備條件：具備條件：表面積大、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本表面積大、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低廉等低廉等2.選擇原則：選擇原則：由吸附劑本身和被吸附物質(zhì)的理化性質(zhì)而定。由吸附劑本身和被吸附物質(zhì)的理化性質(zhì)而定。根據(jù)根據(jù)“相似相溶相似相溶”原理，為了便于解吸附（洗脫），對(duì)于原理，為了便于解吸附（洗脫），對(duì)于極性強(qiáng)的分離物，應(yīng)選擇極性小的吸附劑；而對(duì)于極性弱極

10、性強(qiáng)的分離物，應(yīng)選擇極性小的吸附劑；而對(duì)于極性弱的分離物則選擇極性強(qiáng)的吸附劑的分離物則選擇極性強(qiáng)的吸附劑（二）吸附劑的性質(zhì)（二）吸附劑的性質(zhì)2020世紀(jì)世紀(jì)5050年代初期，年代初期，TiseliusTiselius等用制備的羥基磷等用制備的羥基磷灰石灰石 CaCa5 5(P0(P04 4) )3 3OHOH2 2（HAHA）分離蛋白質(zhì)。目前國內(nèi)）分離蛋白質(zhì)。目前國內(nèi)已有商品出售已有商品出售 1.羥基磷灰石羥基磷灰石 （1）性質(zhì)）性質(zhì) 吸附容量高吸附容量高穩(wěn)定性好（穩(wěn)定性好（T85，pH5.510.0均可使用）均可使用）使用廣泛（可用于制備和純化使用廣泛（可用于制備和純化pro、酶、核酸等）、

11、酶、核酸等）分離效果好分離效果好HA的的Ca基團(tuán)基團(tuán)與生物分子表面的與生物分子表面的負(fù)電荷基團(tuán)負(fù)電荷基團(tuán)的作用，的作用，對(duì)分離起重要作用；而對(duì)分離起重要作用；而PO4基團(tuán)與生物分子表面的正基團(tuán)與生物分子表面的正電荷的作用僅起次要作用電荷的作用僅起次要作用u使用使用HA作為固定相基質(zhì)時(shí)應(yīng)注意作為固定相基質(zhì)時(shí)應(yīng)注意HA為干粉時(shí)，需事先浸泡膨脹達(dá)到為干粉時(shí)，需事先浸泡膨脹達(dá)到23ml/g后，按后，按1 6加加入緩沖液懸浮，除去細(xì)小的顆粒入緩沖液懸浮，除去細(xì)小的顆粒HA懸浮液需用旋渦振蕩器混合，因?yàn)槠渌麛嚢杵魅绱虐?、懸浮液需用旋渦振蕩器混合，因?yàn)槠渌麛嚢杵魅绱虐?、玻棒等易破壞其晶體結(jié)構(gòu)玻棒等易破壞其晶

12、體結(jié)構(gòu)忌用檸檬酸緩沖液和忌用檸檬酸緩沖液和pH5.5的緩沖液處理的緩沖液處理色譜柱再生時(shí)，先用色譜柱再生時(shí)，先用1 mol/L NaCl洗滌，然后用洗滌，然后用4倍床體倍床體積的平衡緩沖液沖洗即可積的平衡緩沖液沖洗即可細(xì)顆粒細(xì)顆粒HA的操作容量和分辨率均較大顆粒高，但須采用的操作容量和分辨率均較大顆粒高，但須采用較大直徑的柱子較大直徑的柱子2. 2.硅膠硅膠（1）性質(zhì)）性質(zhì) 含水量：含水量：含水量高，則吸附性（活性）小，當(dāng)含水量高，則吸附性（活性）小，當(dāng)其表面游離水含量其表面游離水含量17%時(shí)，其結(jié)合力很小；此時(shí)，其結(jié)合力很?。淮藭r(shí)僅能作為分配層析的固定相時(shí)僅能作為分配層析的固定相粒度：粒度：

13、粒度小，則分離效果較好（如用粒度小，則分離效果較好（如用200400目的硅膠能有效地分離多種生物的有效成分）目的硅膠能有效地分離多種生物的有效成分）（2）活化：）活化：110烘烤烘烤0.51h。活化后立即使用或短期貯存。活化后立即使用或短期貯存與干燥器中與干燥器中四、洗脫劑四、洗脫劑條件條件 純度較高純度較高穩(wěn)定性好穩(wěn)定性好能較完全地洗脫下被分離的成分能較完全地洗脫下被分離的成分黏度小黏度小易和所需的成分分開易和所需的成分分開選擇洗脫劑的順序應(yīng)從極性小選擇洗脫劑的順序應(yīng)從極性小 大大 一般，一般，pro或核酸被極性強(qiáng)的或核酸被極性強(qiáng)的HA吸附后，要用含有吸附后，要用含有鹽梯度的緩沖液洗脫；而甾

14、體、色素等化合物被極性較鹽梯度的緩沖液洗脫；而甾體、色素等化合物被極性較弱的硅膠吸附后，則可用有機(jī)溶劑洗脫弱的硅膠吸附后，則可用有機(jī)溶劑洗脫五、層析柱的制備和層析操作五、層析柱的制備和層析操作（一）層析柱（一）層析柱 層析柱是下端為細(xì)口并帶有篩板的玻管。柱子的直徑與層析柱是下端為細(xì)口并帶有篩板的玻管。柱子的直徑與長(zhǎng)度之比一般為長(zhǎng)度之比一般為1 101 40；吸附劑顆粒極細(xì)時(shí)，宜選用大；吸附劑顆粒極細(xì)時(shí)，宜選用大比例（粗）的層析柱，反之用細(xì)層析柱，這樣可節(jié)省時(shí)間和比例（粗）的層析柱，反之用細(xì)層析柱，這樣可節(jié)省時(shí)間和提高分辨率。層析柱的床體積由吸附劑的量和膨脹度決定提高分辨率。層析柱的床體積由吸附

15、劑的量和膨脹度決定（二）吸附劑的用量（二）吸附劑的用量 吸附劑的用量主要由吸附劑自身的操作容量和分離物中吸附劑的用量主要由吸附劑自身的操作容量和分離物中各成分的性質(zhì)決定（一般為被分離樣品的各成分的性質(zhì)決定（一般為被分離樣品的3050倍）倍） 當(dāng)操作容量小時(shí)，則吸附劑用量要大；另外，當(dāng)樣品中當(dāng)操作容量小時(shí)，則吸附劑用量要大；另外，當(dāng)樣品中各組分的性質(zhì)相似，難以分開時(shí)，應(yīng)加大吸附劑的用量，有各組分的性質(zhì)相似，難以分開時(shí)，應(yīng)加大吸附劑的用量，有時(shí)甚至超過時(shí)甚至超過100倍倍（三）裝柱（三）裝柱1.干法裝柱干法裝柱直接加吸附劑至柱中，然后倒入溶劑直接加吸附劑至柱中，然后倒入溶劑此法不易排盡氣泡，容易導(dǎo)

16、致層析不均勻此法不易排盡氣泡，容易導(dǎo)致層析不均勻2.濕法裝柱濕法裝柱先加適量溶劑至柱內(nèi)，排走空氣，然后將預(yù)先浸先加適量溶劑至柱內(nèi)，排走空氣，然后將預(yù)先浸泡好的吸附劑攪均，隨即將此混懸液傾入柱中泡好的吸附劑攪均，隨即將此混懸液傾入柱中（圖（圖3-5）；待其自然沉淀至柱高的）；待其自然沉淀至柱高的1/4 1/3 時(shí)，時(shí)，打開下端出口，讓溶劑慢慢流出，使柱子上端懸打開下端出口，讓溶劑慢慢流出，使柱子上端懸浮液徐徐下降至需要的高度；并用浮液徐徐下降至需要的高度；并用23倍量的洗脫倍量的洗脫劑流過層析柱，使其達(dá)到平衡劑流過層析柱，使其達(dá)到平衡注：注：吸附劑表面要平整，應(yīng)一直浸泡在溶劑液面以下，嚴(yán)吸附劑表

17、面要平整，應(yīng)一直浸泡在溶劑液面以下，嚴(yán)防產(chǎn)生氣泡。濕法裝柱均勻，不易留有氣泡防產(chǎn)生氣泡。濕法裝柱均勻，不易留有氣泡（四）上樣和洗脫（四）上樣和洗脫經(jīng)平衡好的層析柱，當(dāng)平衡液到達(dá)固定相表面時(shí)，用滴管輕輕地經(jīng)平衡好的層析柱，當(dāng)平衡液到達(dá)固定相表面時(shí)，用滴管輕輕地將待分離樣品液加置固定相表面（注意避免沖動(dòng)基質(zhì)，且樣品液體將待分離樣品液加置固定相表面（注意避免沖動(dòng)基質(zhì)，且樣品液體積應(yīng)小于床體積的積應(yīng)小于床體積的1/2）；待樣品液進(jìn)入固定相時(shí)，用滴管加洗脫劑，）；待樣品液進(jìn)入固定相時(shí)，用滴管加洗脫劑，并在上端連接洗脫劑瓶連續(xù)洗脫，同時(shí)下端與部分收集器接通，分并在上端連接洗脫劑瓶連續(xù)洗脫，同時(shí)下端與部分收

18、集器接通，分級(jí)收集級(jí)收集將收集的每管溶液進(jìn)行濃縮和活性測(cè)定。以管號(hào)或洗脫體積為橫將收集的每管溶液進(jìn)行濃縮和活性測(cè)定。以管號(hào)或洗脫體積為橫坐標(biāo)，每管樣品的濃度或活度為縱坐標(biāo)，若層析峰無重疊，則各成坐標(biāo)，每管樣品的濃度或活度為縱坐標(biāo)，若層析峰無重疊，則各成分能完全分離（圖分能完全分離（圖3-7）為了獲得滿意分離效果，洗脫速度恰當(dāng)控制（若太快，洗脫物在為了獲得滿意分離效果，洗脫速度恰當(dāng)控制（若太快，洗脫物在兩相中平衡不完全；太慢，則洗脫物會(huì)擴(kuò)散；結(jié)果都會(huì)導(dǎo)致分離度兩相中平衡不完全；太慢，則洗脫物會(huì)擴(kuò)散；結(jié)果都會(huì)導(dǎo)致分離度下降）下降）分離出的樣品經(jīng)濃縮或凍干處理后，可進(jìn)行純度測(cè)定及保存分離出的樣品經(jīng)濃

19、縮或凍干處理后，可進(jìn)行純度測(cè)定及保存 加加 樣樣 操操 作作 示示 意意 圖圖（五）柱子再生（五）柱子再生各種層析柱，其再生方法因固定相不同而異各種層析柱，其再生方法因固定相不同而異(1)純化生命物質(zhì)純化生命物質(zhì)72： 天然的雙鏈天然的雙鏈(ds)和熱變性單鏈和熱變性單鏈(ss)小牛胸腺小牛胸腺DNA在在HA層析柱層析柱的分離圖譜的分離圖譜 六、實(shí)例應(yīng)用六、實(shí)例應(yīng)用(2)分離蛋白質(zhì)的亞基分離蛋白質(zhì)的亞基114 14C-組氨酸標(biāo)記的兔球蛋白亞基在組氨酸標(biāo)記的兔球蛋白亞基在HA層析柱的分離圖譜層析柱的分離圖譜 第二節(jié)第二節(jié) 薄薄 層層 層層 析析 薄層層析薄層層析(thin layer chromatography，TLC)是以是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固定相，以液體基質(zhì)為固定相，以液體為流動(dòng)相的一種層析方法為流動(dòng)相的一種層析方法薄