復(fù)方骨肽原溶液高分子量物質(zhì)檢查方法研究 20140604

1、復(fù)方骨肽原溶液高分子量物質(zhì)檢查方法研究常州方圓制藥有限公司 芳園QC小組一、 概況（一）產(chǎn)品介紹復(fù)方骨肽原溶液為淡黃褐色至黃褐色澄明液體。主要為健康的豬或牛四肢骨與全蝎經(jīng)提取制成的滅菌水溶液，主要活性成分為多肽。目前，以復(fù)方骨肽原溶液為原料制成的制劑臨床上主要用于骨折的治療，以及風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的輔助治療。（二）QC小組簡介1、小組概況芳園QC小組成立于2015年8月，由檢測中心人員本著自愿參加的原則組成，自成立以來一直以“提高產(chǎn)品質(zhì)量控制水平，完善質(zhì)量管理體系”為宗旨，不斷進(jìn)行有目的、有計(jì)劃的QC創(chuàng)新活動(dòng)。表1 小組概況表小組名稱芳園QC小組成立時(shí)間2015.08課題名稱復(fù)方骨肽原

2、溶液高分子量物質(zhì)檢查方法研究課題類型創(chuàng)新型注冊號小組長王亮小組成員4人活動(dòng)日期2015.092016.03出勤率100%2、小組成員表表2 小組成員一覽表序號姓名文化程度職務(wù)職稱組內(nèi)分工1王亮本科儀器組班長助理工程師組長數(shù)據(jù)整理2酈莎莎大專檢驗(yàn)員助理工程師具體實(shí)施數(shù)據(jù)分析3宋曉霞本科檢驗(yàn)員助理工程師具體實(shí)施數(shù)據(jù)分析4王薇本科檢驗(yàn)員助理工程師具體實(shí)施成果發(fā)表人3、小組活動(dòng)計(jì)劃表3 活動(dòng)計(jì)劃表活動(dòng)內(nèi)容和階段9月10月11月12月1月2月選題、培訓(xùn)P提出方案并制定最佳方案制訂對策對策實(shí)施D效果確認(rèn)C鞏固措施A總結(jié)和展望二、選題理由復(fù)方骨肽原溶液中的高分子量物質(zhì)是引起過敏的主要物質(zhì)，復(fù)方骨肽原溶液的生

3、產(chǎn)工藝中，有對其高分子量物質(zhì)過濾截留裝置，為了提高產(chǎn)品的安全性，控制產(chǎn)品中高分子量物質(zhì)，增加高分子量物質(zhì)檢查項(xiàng)，并根據(jù)實(shí)際樣品的測定情況，暫定供試品中分子量大于10000的組分不得過5.0%。 三、目標(biāo)設(shè)定及可行性分析（一）目標(biāo)設(shè)定建立復(fù)方骨肽原溶液高分子量物質(zhì)檢驗(yàn)方法，以達(dá)到進(jìn)一步控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的。（二）可行性分析公司支持：公司多次派檢驗(yàn)員參加各類檢驗(yàn)知識和儀器操作等方面的培訓(xùn)，多次舉辦相關(guān)會議。技術(shù)保障：小組成員具有多年的儀器分析經(jīng)驗(yàn)，且具有較強(qiáng)的開拓創(chuàng)新意識。小組成員4人中3人本科學(xué)歷，1人大專學(xué)歷，專業(yè)均為藥物分析等相關(guān)專業(yè)，理論基礎(chǔ)扎實(shí)。小組成員具有嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的工作態(tài)度，優(yōu)良的團(tuán)隊(duì)合

4、作精神，對于疑難問題能集體共謀對策。儀器保障：目標(biāo)可以實(shí)現(xiàn)！具備研究和檢測所需的液相色譜儀、超純水制備儀等。且這些設(shè)備均為知名品牌的廠家。四、提出方案并確定最佳方案（一）提出方案1、檢測方法的初步確定檢驗(yàn)方法確定采用分子排阻色譜法對復(fù)方骨肽原溶液中分子按照大小進(jìn)行分離檢測。分子排阻色譜法一般選用親水硅膠或凝膠為填充劑，這些凝膠表面分布著不同孔徑尺寸的孔，樣品分子進(jìn)入色譜柱后，它們中的不同組分按其分子大小進(jìn)入相應(yīng)的孔內(nèi)，大于所有孔徑的分子將不能進(jìn)去，在色譜柱中保留比較差，最早被流動(dòng)相洗脫出去，表現(xiàn)為保留時(shí)間較短；小于所有孔徑的分子能自由進(jìn)入填充劑，滯留時(shí)間較長，表現(xiàn)為保留時(shí)間較長，其余的分子按大

5、小依次被洗脫。2、色譜柱選擇選擇供試品分子大小相適應(yīng)的色譜柱填充劑，粒徑相對小，pH耐受力符合要求。3、流動(dòng)相的選擇多肽液相色譜通常使用的流動(dòng)相為含酸性或中性介質(zhì)的甲醇-水或乙腈-水，或用甲醇與緩沖鹽溶液做流動(dòng)相。在測定多肽時(shí)如果出峰效果不理想的話，可以再流動(dòng)相中加入少量的三氟乙酸可改善出峰效果。4、系統(tǒng)適用性包括理論塔板數(shù)、分離度、靈敏度、重復(fù)性、拖尾因子等。5、結(jié)果計(jì)算經(jīng)色譜分離的多肽分子通常以線性形式分離，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分子量（M）的對數(shù)對應(yīng)的保留時(shí)間（t）制得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程lgM=a+bt，供試品中大于10000分子量的分布時(shí)間即可以計(jì)算，以峰面積歸一化法對多肽分布情況進(jìn)行積分，保留時(shí)間

6、前段為大于10000分子量多肽分布段，保留時(shí)間后段為小于10000分子量多肽分布段，計(jì)算出復(fù)方骨肽原溶液大于10000分子量組分含量。（二）制訂方案小組成員根據(jù)本部門目前現(xiàn)有HPLC級試劑的實(shí)際情況以及日常檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，對小組成員意見整理后制定了下列方案：方案內(nèi)容綜合分析評估結(jié)論可行性 (25分)合理性(25分)實(shí)施周期 (25分)分)預(yù)期效果(25分)分)總分 (100分)儀器選擇安捷倫高效液相色譜儀目前有兩臺，配置齊全，但使用頻繁，幾乎為其他產(chǎn)品專用。251010550不選島津高效液相色譜儀目前有一臺，配置齊全，但偶爾使用，頻次為2月/次。25 25 20 20 90 選擇色譜柱選擇TSK g

7、el G 2000SW剛性的球型硅膠為基質(zhì),在其表面通過共價(jià)鍵合親水基團(tuán)而成，孔徑125Å，粒徑5m，7.8×300mm，耐受流速 0.5-1.0ml/min，分子量 5,000-150,000 ；pH 2.5-7.52020 20 1575不選Zenix SEC-100表面鍵合親水薄膜的硅膠，孔徑100Å，粒徑3m，7.8×300mm，耐受流速 0.5-1.0ml/min，分子量 100-100,000 ；pH 2-8.525252020 90選擇 通過總結(jié)，決定采用島津高效液相色譜儀，選用Zenix SEC-100色譜柱進(jìn)行復(fù)方骨肽原溶液高分子量物質(zhì)

8、檢查方法的研究。五、制定對策方案分解對策目標(biāo)措施地點(diǎn)人員完成日期色譜條件的確定選擇酸性或中性介質(zhì)的甲醇-水或乙腈-水為流動(dòng)相，考慮添加三氟乙酸適量各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能較好分離，核糖核酸酶A理論塔板數(shù)應(yīng)大于5000查閱資料選取最佳色譜條件液相室王亮2015.10.15系統(tǒng)適用性試驗(yàn)設(shè)計(jì)適用性試驗(yàn)溶液進(jìn)行測試各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均完全分離，分離度應(yīng)大于1.5配制適用性試驗(yàn)溶液進(jìn)行測試液相室王亮2015.10.20線性確定選擇對照溶液進(jìn)樣以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分子量（M）的對數(shù)對應(yīng)的保留時(shí)間（t）制得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，相關(guān)系數(shù)大于0.99配制1份對照溶液，進(jìn)樣，以峰面積和濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)液相室王亮2013.11.30

9、重復(fù)性試驗(yàn)選擇對照溶液進(jìn)樣各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間RSD2.0%配制含四種不同高分子量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合液進(jìn)樣，計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間RSD液相室王亮酈莎莎2013.12.20中間精密度試驗(yàn)不同時(shí)間、不同人員測試RSD10%2名檢驗(yàn)員、2臺氣相色譜儀對同一批樣品進(jìn)行乙醇、乙酸乙酯殘留量的檢測液相室王亮酈莎莎2014.01.10六、對策措施對策一、確定色譜條件1、色譜條件色譜柱：DB-5， 30m×0.32mm×0.5m氣體流速：氮?dú)?.0ml/min（恒流模式）；氫氣30ml/min；空氣300ml/min；尾吹氣為氮?dú)?0ml/min柱溫：50（保持3min）10/min8015/

10、min250（5min）進(jìn)樣口溫度：150檢測器溫度：260分流比：1:1頂空條件： 頂空瓶溫度80；定量環(huán)溫度95；傳輸線溫度110；進(jìn)樣瓶平衡時(shí)間25min；振搖off；增壓0.4min；定量環(huán)填充時(shí)間0.20min；定量環(huán)平衡時(shí)間0.10min；進(jìn)樣時(shí)間1.00min；GC總循環(huán)時(shí)間35min。2、儀器梅特勒-托利多 AG285 分析天平、Agilent7890A系統(tǒng)，7694E頂空進(jìn)樣器3、溶液配制(1) 稀釋液：甲苯:二甲亞砜 = 2:1(2) 對照貯備液： 精密稱取乙醇、乙酸乙酯各0.1g，加入100ml容量瓶（瓶內(nèi)預(yù)先加入約30ml稀釋液）中，用稀釋液定容至刻度，搖勻。 精密移取

11、溶液 10ml，置50ml容量瓶中，用稀釋液定容至刻度，搖勻即得對照貯備液。(3)供試品溶液：精密稱取地氯雷他定供試品0.12g，置20ml頂空瓶中，精密加入3ml稀釋液，密封，溶解并搖勻。平行配制兩份。(4) 系統(tǒng)適用性溶液：精密移取對照貯備液3ml，置20ml頂空進(jìn)樣瓶中密封，平行配制5份。按照上述色譜條件，取系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)樣，結(jié)果如下表：進(jìn)樣次數(shù)12345峰面積RSD乙醇峰面積83.1484.7881.3979.4985.283.0%乙酸乙酯126.57128.48126.28123.75129.081.7%從上表看出，乙醇、乙酸乙酯峰面積的RSD均小于10%，達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。對策二：

12、專屬性試驗(yàn)定位溶液：用毛細(xì)管取乙醇、乙酸乙酯、甲苯、二甲亞砜各適量，分別置20ml頂空瓶中，密封備用。專屬性試驗(yàn)溶液：精密移取稀釋液、對照液各3ml，置20ml頂空瓶中密封。按照測定條件分別用各定位溶液、稀釋液、對照液進(jìn)樣，得到如下圖譜： 從上面各圖看出，各峰峰型對稱，乙醇、乙酸乙酯的分離度達(dá)到了22.91，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1.5，并與甲苯、二甲亞砜完全分離，達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。對策三：線性及范圍的確定精密稱取乙醇0.1050g、乙酸乙酯0.1009g，加入同一100ml容量瓶（瓶內(nèi)預(yù)先加入約30ml稀釋液）中，用稀釋液定容至刻度，搖勻，得線性試驗(yàn)貯備液。按照下表的順序精密移取相應(yīng)量的線性試驗(yàn)貯備液于相應(yīng)

13、的容量瓶中，用稀釋液定容至刻度，再精密移取這些溶液3ml于20ml頂空瓶中，密閉，搖勻，得線性試驗(yàn)系列溶液。濃度水平(%)濃度(g/ml)線性試驗(yàn)貯備液(ml)容量瓶(ml)份數(shù)乙醇乙酸乙酯140294.00282.527253120252.00242.166253100210.00201.801050380168.00161.44850360126.00121.0865034084.0080.7245032042.0040.3625031021.0020.181503510.5010.090.5503用上述溶液進(jìn)樣，每個(gè)濃度進(jìn)樣三針，結(jié)果見下表：表4 乙醇檢驗(yàn)結(jié)果記錄濃度水平乙醇濃度峰面積平

14、均峰面積信噪比5%10.501.910%21.009.329.323.720%42.0019.2919.4418.9719.239.240%84.0038.1436.8037.6337.5260%126.0057.3957.2055.8556.8180%168.0079.4074.4972.6175.50100%210.0091.4091.1291.0588.61120%252.00108.63104.34109.84107.60140%294.00118.22127.64129.78125.21表5 乙酸乙酯檢驗(yàn)結(jié)果記錄濃度水平乙酸乙酯濃度峰面積平均峰面積信噪比5%10.092.110%20

15、.1811.8211.824.220%40.3624.1224.4323.9824.1810.240%80.7248.2547.3348.1647.9160%121.0873.2172.8371.9872.6780%161.4499.4996.7495.1597.13100%201.80119.64119.40119.92117.77120%242.16144.44140.65144.66143.25140%282.52166.82172.89173.76171.16以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得到回歸方程和線性圖如下：從上述圖譜看出，乙醇在42.00g/ml294.00g/ml范圍內(nèi)，相

16、關(guān)系數(shù)為0.9992，乙酸乙酯在40.36g/ml282.52g/ml范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.9995，均大于0.99，達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。對策四、檢測限的確定對線性試驗(yàn)項(xiàng)下的圖表進(jìn)行結(jié)果分析，將S/N =2時(shí)對應(yīng)的濃度確定為檢測限，結(jié)果如下表：名稱S/N峰面積濃度乙醇1.94.5977110.50g/ml乙酸乙酯2.15.6050510.09g/ml從上表看出，乙醇的檢測限為10.50g/ml，乙酸乙酯的檢測限為10.09g/ml。對策五、回收率試驗(yàn)配制80%、100%、120% 3個(gè)濃度水平的乙醇、乙酸乙酯對照溶液，加入已知乙醇、乙酸乙酯濃度的地氯雷他定樣品（20130801）中，每個(gè)濃度3份，

17、進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見下表：濃度水平樣品乙醇?xì)埩?%)檢出乙醇含量(%)扣除樣品乙醇后的含量(%)理論含量(%)回收率(%)80%00.38160.38160.389497.990.42030.42030.3923107.150.39960.39960.3859103.54100%0.50850.50850.4903103.700.49010.49010.4891100.200.52910.52910.5001105.79120%0.57110.57110.587697.190.59610.59610.5874101.480.61540.61540.5942 103.56濃度水平樣品乙酸

18、乙酯殘留(%)檢出乙酸乙酯含量(%)扣除樣品乙酸乙酯后的含量(%)理論含量(%)回收率(%)80%0.12460.50790.38340.392997.570.53380.40920.3958103.390.52070.39610.3894101.71100%0.62340.49880.4947100.820.61860.49410.4936100.110.64590.52140.5047103.31120%0.70780.58330.592398.480.72280.59820.5927100.930.73900.61500.5996102.57從上表看出，乙醇、乙酸乙酯的回收率均在80%1

19、20%間，達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。對策六、重復(fù)性試驗(yàn)平行配制100%濃度水平的對照液6份，進(jìn)樣，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果見下表：序號乙醇峰面積乙酸乙酯乙醇RSD乙酸乙酯RSD191.40119.645.6%4.1%291.12119.40391.05119.92488.97118.73578.81108.16690.33120.75 從上表看出，乙醇峰面積的RSD為5.6%，乙酸乙酯峰面積的RSD為4.1%，均小于10%，達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。對策七、中間精密度試驗(yàn)在不同時(shí)間由2名檢驗(yàn)員，分別在2臺氣相色譜儀(7890A、6890N)上，對同一批地氯雷他定（20130801）進(jìn)行檢驗(yàn)，每次試驗(yàn)均配制6份供試

20、品溶液，計(jì)算乙醇、乙酸乙酯的含量，結(jié)果見下表：表6 同一檢驗(yàn)員、不同儀器的檢驗(yàn)結(jié)果樣品名稱色譜儀型號乙醇/乙酸乙酯含量(%)平均含量(%)不同儀器RSD(%)乙醇7890A00000006890N0000000乙酸乙酯7890A0.12990.12380.12900.12490.11800.13080.12610.56890N0.12650.12710.13220.12350.12000.12260.1253表7 同一檢驗(yàn)員、同一儀器、不同時(shí)間的檢驗(yàn)結(jié)果樣品名稱時(shí)間乙醇/乙酸乙酯含量(%)平均含量(%)不同時(shí)間RSD(%)乙醇2014.1.500000002014.1.90000000乙酸乙酯

21、2014.1.50.12900.12450.12550.12650.11950.13010.12650.42014.1.90.12550.12800.13200.12600.12050.12300.1258表8 同一儀器、不同檢驗(yàn)員的檢驗(yàn)結(jié)果樣品名稱檢驗(yàn)員乙醇/乙酸乙酯含量(%)平均含量(%)不同人員RSD(%)乙醇王亮0000000酈莎莎0000000乙酸乙酯王亮0.12850.12550.12650.12400.12000.13000.12580.7酈莎莎0.12580.12600.12600.12800.12900.12650.1269從上表看出，乙醇均未檢出；乙酸乙酯的檢驗(yàn)結(jié)果，同一檢驗(yàn)員、不同儀器的RSD為0.5%，同一檢驗(yàn)員、同一儀器、不同時(shí)間的RSD為0.4%，同一儀器、不同檢驗(yàn)員的RSD為0.7% ，均遠(yuǎn)小于10%，達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。對策八、耐用性試驗(yàn)通過改變流速、進(jìn)樣口溫度、檢測器溫度，用對照液進(jìn)樣，觀察出峰情況，結(jié)果如下：流速(ml/min)進(jìn)樣口溫度()檢測器溫度()乙醇、乙酸乙酯分離度乙醇、乙酸乙酯、甲苯、二甲亞砜分離情況11.015026021.16完全分離21.215026022.81完全分離30.81