第10章吸光光度法講述

1、第第10章章 吸光光度法吸光光度法10.1 概述概述10.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理10.3 分光光度計(jì)分光光度計(jì)10.4 顯色反應(yīng)及影響因素顯色反應(yīng)及影響因素10.5 光度分析法的設(shè)計(jì)光度分析法的設(shè)計(jì)10.6 吸光光度法的誤差吸光光度法的誤差10.7 常用的吸光光度法常用的吸光光度法10.8 吸光光度法的應(yīng)用吸光光度法的應(yīng)用吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法，屬于分子吸收光譜分析方法度法，屬于分子吸收光譜分析方法 基于外層電子躍遷基于外層電子躍遷10.1 概述概述n吸收光譜吸收光譜n發(fā)射光譜發(fā)射光譜n散射光譜散射光譜n分

2、子光譜分子光譜n原子光譜原子光譜10.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理1 吸收光譜產(chǎn)生的原因吸收光譜產(chǎn)生的原因 光光: :一種電磁波一種電磁波, ,波粒二象性波粒二象性 光譜名稱波長范圍X射線0.110nm遠(yuǎn)紫外光10200nm近紫外光200400nm可見光400750nm近紅外光0.752.5um中紅外光2.55.0um遠(yuǎn)紅外光5.01000um微波0.1100cm無線電波11000m當(dāng)光子的能量與分子的當(dāng)光子的能量與分子的 E匹配時(shí)，匹配時(shí)，就會(huì)吸收光子就會(huì)吸收光子 E=hu u=hc/l la 躍遷類型躍遷類型 價(jià)電子躍遷價(jià)電子躍遷：*, *; n*, n* E (h) 順序:

3、n* n*104)c. 產(chǎn)物的化學(xué)組成穩(wěn)定產(chǎn)物的化學(xué)組成穩(wěn)定d. 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定e. 反應(yīng)和產(chǎn)物有明顯的顏色差別反應(yīng)和產(chǎn)物有明顯的顏色差別 ( l l60nm)沒有顏色的化合物，需要通過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)定量沒有顏色的化合物，需要通過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)定量生成有色化合物再測(cè)定生成有色化合物再測(cè)定 顯色反應(yīng)顯色反應(yīng)1 顯色反應(yīng)顯色反應(yīng)NNN NSO3HHO3SOHH O As32AsOOOHMO絡(luò)合反應(yīng)絡(luò)合反應(yīng)氧化還原反應(yīng)氧化還原反應(yīng)2 顯色反應(yīng)類型顯色反應(yīng)類型NNFe2+3NHHOOCCOOH+ VO3-+ H+NNCOOHCOOHHOOCHOOC+ VO2+ H O2離子締合反應(yīng)離子締合反應(yīng)CCO

4、OHNN(C H )22 5(C H )22 5H+O-AuCl4.成鹽反應(yīng)成鹽反應(yīng) (CH3)2NCHSCOCCHNS(CH3)2NCCOCCHNS+ AgAgS褪色反應(yīng)褪色反應(yīng) Zr(IV)-偶氮胂偶氮胂III絡(luò)合物測(cè)定草酸絡(luò)合物測(cè)定草酸吸附顯色反應(yīng)吸附顯色反應(yīng) 達(dá)旦黃測(cè)定達(dá)旦黃測(cè)定Mg(II),Mg(OH)2吸附達(dá)旦黃呈紅色吸附達(dá)旦黃呈紅色 3 顯色劑顯色劑無機(jī)顯色劑無機(jī)顯色劑: 過氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀過氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀NNNNSO3HHO3SOHOHAsO H32H O As32有機(jī)顯色劑：有機(jī)顯色劑： 偶氮類：偶氮胂偶氮類：偶氮胂III三苯甲烷類三苯甲烷類 三苯甲烷酸性染

5、料三苯甲烷酸性染料 鉻天菁鉻天菁S S OCH3COOHHOCClClSO3HCH3COOH 三苯甲烷堿性染料三苯甲烷堿性染料 結(jié)晶紫結(jié)晶紫 CN(CH3)2(H3C)2NN(CH3)2鄰菲羅啉類：新亞銅靈鄰菲羅啉類：新亞銅靈 NNCH3CH3肟類：丁二肟肟類：丁二肟 CCCH3NNOHHOCH34 多元絡(luò)合物多元絡(luò)合物混配化合物混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O 離子締合物離子締合物 AuCl4-羅丹明B金屬離子金屬離子-配體配體-表面活性劑體系表面活性劑體系 Mo-水楊基熒光酮-CTMAB 5 影響因素影響因素a 溶液酸度（溶液酸度（pH值及緩沖溶液）值及緩

6、沖溶液）u 影響顯色劑的平衡濃度及顏色，改變lu 影響待測(cè)離子的存在狀態(tài)，防止沉淀u 影響絡(luò)合物組成形式形式 pH max(nm) 形式形式 pH max(nm)H4L+ 1.2 462-465 Sn4+ 1.0 530H3L 4.8-5.2 462,490 Ga3+ 5.0 550H2L- 8.4-9.0 512HL2- 11.4-12.0 532-538pH對(duì)苯芴酮及其絡(luò)合物的顏色影響對(duì)苯芴酮及其絡(luò)合物的顏色影響 b 顯色劑的用量顯色劑的用量稍過量，處于平臺(tái)區(qū)稍過量，處于平臺(tái)區(qū) c 顯色反應(yīng)時(shí)間顯色反應(yīng)時(shí)間針對(duì)不同顯色反應(yīng)確定顯示時(shí)間 顯色反應(yīng)快且穩(wěn)定；顯色反應(yīng)快但不穩(wěn)定； 顯色反應(yīng)慢，穩(wěn)

7、定需時(shí)間；顯色反應(yīng)慢但不穩(wěn)定d 顯色反應(yīng)溫度顯色反應(yīng)溫度加熱可加熱可加快反應(yīng)速度，導(dǎo)致顯色劑或產(chǎn)物分解e 溶劑溶劑f 干擾離子干擾離子 有機(jī)溶劑，提高靈敏度、顯色反應(yīng)速率有機(jī)溶劑，提高靈敏度、顯色反應(yīng)速率消除辦法：消除辦法： 提高酸度，加入隱蔽劑，改變價(jià)態(tài)提高酸度，加入隱蔽劑，改變價(jià)態(tài) 選擇合適參比選擇合適參比 褪色空白褪色空白(鉻天菁鉻天菁S測(cè)測(cè)Al，氟化銨褪色，消除鋯、鎳、鈷干擾，氟化銨褪色，消除鋯、鎳、鈷干擾) 選擇適當(dāng)波長選擇適當(dāng)波長 10.5 光度分析法的設(shè)計(jì)光度分析法的設(shè)計(jì)1. 選擇顯色反應(yīng)選擇顯色反應(yīng)2. 選擇顯色劑選擇顯色劑3. 優(yōu)化顯色反應(yīng)條件優(yōu)化顯色反應(yīng)條件4. 選擇檢測(cè)波

8、長選擇檢測(cè)波長5. 選擇合適的濃度選擇合適的濃度6. 選擇參比溶液選擇參比溶液7. 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線建立標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量條件選擇測(cè)量條件選擇1 測(cè)定波長選擇測(cè)定波長選擇選擇原則：選擇原則：“吸收最大，干擾最小吸收最大，干擾最小”靈敏度選擇性2 測(cè)定濃度控制測(cè)定濃度控制控制濃度控制濃度 吸光度吸光度A：0.20.8減少測(cè)量誤差減少測(cè)量誤差3 參比溶液選擇參比溶液選擇儀器調(diào)零儀器調(diào)零消除吸收池壁和溶液對(duì)入射光的反射消除吸收池壁和溶液對(duì)入射光的反射 扣除干擾扣除干擾試劑空白試劑空白試樣空白試樣空白褪色空白褪色空白 4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作標(biāo)準(zhǔn)曲線制作0123456780.000.050.100.150.200.25

9、0.300.35Aconcentration理論基礎(chǔ)：朗伯理論基礎(chǔ)：朗伯-比爾定律比爾定律 相同條件下相同條件下測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度溶液的吸光度AAc 作圖作圖10.6 吸光光度法的誤差吸光光度法的誤差非單色光引起的偏移非單色光引起的偏移物理化學(xué)因素：非均勻介質(zhì)及化學(xué)反應(yīng)物理化學(xué)因素：非均勻介質(zhì)及化學(xué)反應(yīng)吸光度測(cè)量的誤差吸光度測(cè)量的誤差 對(duì)朗伯對(duì)朗伯-比爾定律的偏移比爾定律的偏移1 非單色光引起的偏移非單色光引起的偏移復(fù)合光由復(fù)合光由l l1和和l l2組成，對(duì)于濃度不同的溶液組成，對(duì)于濃度不同的溶液a和和b,引起的吸光度的偏差不一樣，濃度大，復(fù)合光引引起的吸光度的偏差

10、不一樣，濃度大，復(fù)合光引起的誤差大，故在高濃度時(shí)線性關(guān)系向下彎曲。起的誤差大，故在高濃度時(shí)線性關(guān)系向下彎曲。 非均勻介質(zhì)非均勻介質(zhì) 膠體，懸浮、乳濁等對(duì)光產(chǎn)生散射，使實(shí)測(cè)膠體，懸浮、乳濁等對(duì)光產(chǎn)生散射，使實(shí)測(cè)吸光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系上彎吸光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系上彎2 物理化學(xué)因素物理化學(xué)因素離解、締合、異構(gòu)等離解、締合、異構(gòu)等如：如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H+2CrO42- PAR的偶氮醌腙式的偶氮醌腙式 化學(xué)反應(yīng)化學(xué)反應(yīng)吸光度標(biāo)尺刻度不均勻吸光度標(biāo)尺刻度不均勻3 吸光度測(cè)量的誤差吸光度測(cè)量的誤差A(yù)0.434 ，T36. 8% 時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小

11、A=0.20.8, T=1565%，相對(duì)誤差，相對(duì)誤差4% dc/c= dA/A=dT/TlnT Er=dc/c100= dA/A100=dT/TlnT100令令ST=0.01,計(jì)算計(jì)算T不同值時(shí)的不同值時(shí)的Sc/c，當(dāng)，當(dāng)TlnT對(duì)對(duì)T進(jìn)行進(jìn)行微分時(shí)，其值為零時(shí)，微分時(shí)，其值為零時(shí)，Sc/c最小，此時(shí)最小，此時(shí)T=0.368。1.示差吸光光度法示差吸光光度法目的：提高光度分析的準(zhǔn)確度和精密度目的：提高光度分析的準(zhǔn)確度和精密度 解決高解決高(低低)濃度組分濃度組分(i.e. A在在0.20.8以外以外)問題問題分類：高吸光度差示法、低吸光度差示法、分類：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差

12、示吸光度法精密差示吸光度法特點(diǎn)：特點(diǎn)： 以標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白以標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白原理：原理： A相對(duì)相對(duì) = A = e ebcx- e ebc0= e eb c準(zhǔn)確度：讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)展準(zhǔn)確度：讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)展, 相對(duì)誤差減少相對(duì)誤差減少, c0愈接近愈接近c(diǎn)x, 準(zhǔn)確度提高愈顯著準(zhǔn)確度提高愈顯著10.7 常用的吸光光度法常用的吸光光度法例：硫脲還原硫氰酸鹽比色法測(cè)定鋼鐵中的鉬。酸例：硫脲還原硫氰酸鹽比色法測(cè)定鋼鐵中的鉬。酸溶，硫酸高氯酸介質(zhì)中，硫脲還原鐵（溶，硫酸高氯酸介質(zhì)中，硫脲還原鐵（III）為鐵）為鐵(II),除干擾，還原鉬（除干擾，還原鉬（VI）為五價(jià)，）為五價(jià)，2.00mg/100ml的的鉬標(biāo)準(zhǔn)溶

13、液為參比溶液，用鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的鉬標(biāo)的鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制工作曲線和測(cè)定樣品溶液的吸光準(zhǔn)溶液，繪制工作曲線和測(cè)定樣品溶液的吸光度度,480nm測(cè)定測(cè)定A。 2.雙波長吸光光度法雙波長吸光光度法 目的：解決渾濁樣品光度分析目的：解決渾濁樣品光度分析 消除背景吸收的干擾消除背景吸收的干擾 多組分同時(shí)檢測(cè)多組分同時(shí)檢測(cè) 原理：原理： A = Al l1-Al l2 = （e el l1- e el l2）b c 波長對(duì)的選擇：波長對(duì)的選擇： a.等吸光度點(diǎn)法，等吸光度點(diǎn)法，b.系數(shù)倍率法系數(shù)倍率法選選l l1為參比波長為參比波長, l l2為測(cè)量波長為測(cè)量波長

14、得得 Al l1= e e xl l1bcx + e e yl l1bcy Al l2= e e xl l2bcx+ e e yl l2bcy A=Al l2-Al l1= (e e x2bcx+e e yl l2bcy)-(e e xl l1bcx+e e yl l1bcy)在等吸光度的位置在等吸光度的位置(G, F), e e yl l2 e e yl l1，則上式成為，則上式成為 A=(e e xl l2- e e xl l1）bcx A與與cx成正比成正比, 可用于測(cè)定可用于測(cè)定例例,苯酚與苯酚與2,4,6-三氯苯酚三氯苯酚(y)混合物中混合物中苯酚苯酚(x)的雙波長分光光度法測(cè)定。的

15、雙波長分光光度法測(cè)定。3.導(dǎo)數(shù)吸光光度法導(dǎo)數(shù)吸光光度法 目的：提高分辨率目的：提高分辨率 去除背景干擾去除背景干擾 原理：原理： dnA/dl ln l l 10.8 吸光光度法的應(yīng)用吸光光度法的應(yīng)用1 測(cè)定弱酸和弱堿的離解常數(shù)測(cè)定弱酸和弱堿的離解常數(shù) AHB和AB-分別為有機(jī)弱酸HB在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性時(shí)的吸光度，它們此時(shí)分別全部以HB或B-形式存在。HB H+ + B- H+B-Ka = HBpKa=pH+ lg HBB-A=AHB+AB-pKa=pH+ lg AB- - AA- AHBlg AB- - AA- AHB對(duì)對(duì)pH作圖即可求得作圖即可求得pKa 2 絡(luò)合物組成確定絡(luò)合物組成確定 飽和

16、法（摩爾比法）飽和法（摩爾比法）制備一系列含釕制備一系列含釕3.010-5 mol/L (固定不變固定不變)和不和不同濃度（小于同濃度（小于12.010-5 mol/L）的）的PDT溶液，按溶液，按實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)驗(yàn)條件，485nm測(cè)定吸光度測(cè)定吸光度,作圖。作圖。PDT:Ru=2:1等摩爾連續(xù)變化法等摩爾連續(xù)變化法固定固定M+L,改變改變M,獲得一系列吸光度值，吸獲得一系列吸光度值，吸光度最大的值所對(duì)應(yīng)的光度最大的值所對(duì)應(yīng)的M與與L的比值，即獲得的比值，即獲得M:L比值。比值。Co(III)與與3，5二氯二氯PADAT的比值為的比值為1:2平衡移動(dòng)法平衡移動(dòng)法固定固定M,不斷改變不斷改變L，以，以lgMLn/M為縱坐標(biāo)，為縱坐標(biāo)，lgL為橫坐標(biāo)，作圖，斜率為橫坐標(biāo)，作圖，斜率n即是絡(luò)合物中即是絡(luò)合物中L:M的的比值；縱軸上的截距比值；縱軸上的截距l(xiāng)gK是絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)。是絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)。lgK+nlgL=lg(MLn/M) MLn K = MLnlgK+nlgL=lgA/(Amax-A)3 分析應(yīng)用分析應(yīng)用 痕量金屬分析痕量金屬分析臨床分析臨床分析食品分析食品分析人有了知識(shí)，就會(huì)具備各種分析能力，人有了知識(shí)，就會(huì)具備各種分析能力，明辨是非的能力。明辨是非的能力。所以我們要勤懇讀書，廣泛閱讀