熒光成像動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

1、熒光成像動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)熒光成像動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)v 20世紀(jì)顯微光學(xué)及熒光標(biāo)記技術(shù)迅速發(fā)展，熒光顯微鏡已泛用于活細(xì)胞成像，研究活細(xì)胞中動(dòng)力學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞內(nèi)化學(xué)分子鑒定、定量及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。現(xiàn)在單細(xì)胞圖像分析已成為化學(xué)和生物學(xué)科之間新的交叉學(xué)科領(lǐng)。熒光的種類(lèi) 自發(fā)熒光（不加染色）自發(fā)熒光（不加染色）v 有些物質(zhì)不加染色，也能發(fā)出熒光（自發(fā)熒光或原發(fā)熒光）有些物質(zhì)不加染色，也能發(fā)出熒光（自發(fā)熒光或原發(fā)熒光）但在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中，只有很少物質(zhì)具有自發(fā)熒光。但在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中，只有很少物質(zhì)具有自發(fā)熒光。 二次熒光（用化學(xué)染色）二次熒光（用化學(xué)染色）v 非熒光性的物質(zhì)（蛋白質(zhì)、炭水化合物）用熒光色素染色，非熒光性的

2、物質(zhì)（蛋白質(zhì)、炭水化合物）用熒光色素染色，由熒光色素產(chǎn)生熒光（二次熒光），以便進(jìn)行觀察。對(duì)特由熒光色素產(chǎn)生熒光（二次熒光），以便進(jìn)行觀察。對(duì)特定物體選擇合適的熒光色素，該物體就能和周?chē)慕M織或定物體選擇合適的熒光色素，該物體就能和周?chē)慕M織或細(xì)胞區(qū)別出來(lái)而可以觀察到。細(xì)胞區(qū)別出來(lái)而可以觀察到。 活細(xì)胞熒光成像的注意事項(xiàng)動(dòng)態(tài)檢測(cè)的靈敏度、速度及細(xì)胞的存活力使用不同波長(zhǎng)光觀察的細(xì)胞圖像以及增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度等細(xì)胞的厚薄觀察過(guò)程的快慢1.共聚焦熒光顯微鏡成像檢測(cè) 激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(laser scanning confocal microscopy,LSCM)是一種利用計(jì)算機(jī)、激光和圖像處理技術(shù)獲

3、得生物樣品三維數(shù)據(jù)、目前最先進(jìn)的分子細(xì)胞生物學(xué)的分析儀器。主要用于觀察活細(xì)胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子的生物學(xué)變化，定量分析，以及實(shí)時(shí)定量測(cè)定等原理 傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場(chǎng)光源，標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射或散射光的干擾；激光掃描共聚焦顯微鏡采用點(diǎn)光源照射樣本，在焦平面上形成一個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡搜集，并沿原照射光路回送到由雙色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測(cè)器。光源和探測(cè)器前方都各有一個(gè)針孔，分別稱(chēng)為照明針孔和探測(cè)針孔。焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點(diǎn)被擋在探測(cè)針孔之外不能成像，這樣得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)切面，避免了

4、非焦平面上雜散光線的干擾，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點(diǎn)，因此能得到整個(gè)焦平面上清晰的共聚焦圖像。共聚焦激光顯微鏡分析細(xì)胞凋亡過(guò)程 近年來(lái),光學(xué)顯微鏡技術(shù)中的一個(gè)最引人注目的成就是雙光子激發(fā)現(xiàn)象(two2photon excitation ,簡(jiǎn)稱(chēng)TPE) 在共焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scan2ning microscopy ,簡(jiǎn)稱(chēng)CLSM) 中的廣泛應(yīng)用。 目前,雙光子共焦激光掃描顯微鏡已成為半導(dǎo)體制造和檢測(cè)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和三維高密度存儲(chǔ)及其微細(xì)加工的重要工具,為開(kāi)拓新學(xué)科和促進(jìn)科學(xué)研究領(lǐng)域向更高層次發(fā)展起到了非常重要的作用. 利用雙光子共焦激光掃描顯微鏡的特點(diǎn)揭示

5、了許多新現(xiàn)象和新規(guī)律.2.多光子熒光顯微鏡成像監(jiān)測(cè)雙光子熒光顯微鏡 由于單光子激發(fā)的線性過(guò)程,在整個(gè)激發(fā)光路里的樣品都由于激發(fā)而發(fā)出熒光,而對(duì)于雙光子激發(fā)而言,只有在焦點(diǎn)處的微小區(qū)域內(nèi)樣品才能吸收足夠的雙光子而發(fā)出熒光. 多光子熒光顯微鏡優(yōu)點(diǎn)與局限 局限v 只能對(duì)熒光成像；v 由于紅外和近紅外光源的使用，樣品可能受到熱損傷；v 分辨率略有降低；v 受昂貴的超快激光器限制，目前多光子掃描顯微鏡的成本較高。3、全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像監(jiān)測(cè) 全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM)也稱(chēng)消逝場(chǎng)熒光顯微鏡(evanescent field fluorescence microscope),提供了一種非常接近表面的

6、成像方法 全內(nèi)反射熒光顯微鏡 是全內(nèi)反射熒光法的直接應(yīng)用，其具有兩種類(lèi)型，棱鏡型和物鏡型。棱鏡型成像系統(tǒng)的隱失場(chǎng)是通過(guò)入射光經(jīng)棱鏡發(fā)生全反射產(chǎn)生的，而物鏡型的是通過(guò)入射光經(jīng)物鏡本身全反射產(chǎn)生。隱失波激發(fā)生物樣品的熒光分子，熒光分子所發(fā)射的熒光經(jīng)過(guò)物鏡成像到照相機(jī)或CCD上實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品的記錄。兩種類(lèi)型的全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像系統(tǒng)，1）為棱鏡型，2）為物鏡型。 優(yōu)勢(shì)u獨(dú)特的全內(nèi)反射熒光功能u動(dòng)態(tài)掃描儀可精確定位激光束，并決定消散視野的準(zhǔn)確穿透深度。u使用一些特殊的熒光軟件如徠卡 AF7000 熒光軟件可全面控制全內(nèi)反射熒光系統(tǒng)，包括校準(zhǔn)與所有顯微鏡功能，確保減少培訓(xùn)的時(shí)間以盡快投入到科學(xué)研究中。

7、u完全集成的全內(nèi)反射熒光系統(tǒng)可與徠卡顯微系統(tǒng)有限公司的高級(jí)熒光工作站結(jié)合使用，以在有多位用戶(hù)的實(shí)驗(yàn)室中，滿(mǎn)足各種成像需要。u高質(zhì)量圖像 全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的消逝波激發(fā)樣全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的消逝波激發(fā)樣品，由于消逝波強(qiáng)度成指數(shù)衰減，使激發(fā)區(qū)域限定在樣品品，由于消逝波強(qiáng)度成指數(shù)衰減，使激發(fā)區(qū)域限定在樣品表面的一薄層范圍內(nèi)，因此具有其它光學(xué)成像技術(shù)無(wú)法比表面的一薄層范圍內(nèi)，因此具有其它光學(xué)成像技術(shù)無(wú)法比擬的高信噪比。擬的高信噪比。 當(dāng)今世界上研究單分子科學(xué)最具前途的新型生物光學(xué)顯微當(dāng)今世界上研究單分子科學(xué)最具前途的新型生物光學(xué)顯微技術(shù)之一技術(shù)之一 可用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)

8、熒光分子的直接探測(cè)?？捎脕?lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)熒光分子的直接探測(cè)。4、熒光成像及電化學(xué)聯(lián)合監(jiān)測(cè) 在實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)單細(xì)胞中，熒光成像及微電極化學(xué)監(jiān)測(cè)法各有特長(zhǎng)，但也各有不足之處。若將兩種方法聯(lián)合監(jiān)測(cè)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，必將取得更深層次的結(jié)果。 倒置熒光顯微鏡是近代發(fā)展起來(lái)的新式熒光顯微鏡，就其光路來(lái)分有兩種：一是透射式熒光顯微鏡，激發(fā)光源是通過(guò)聚光鏡穿過(guò)標(biāo)本材料來(lái)激發(fā)熒光的。二是落射式熒光顯微鏡，這是近代發(fā)展起來(lái)的新式熒光顯微鏡，特點(diǎn)是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。 微流控芯片 又稱(chēng)微全分析系統(tǒng)(micro total analytical system, TAS)原型

9、是20世紀(jì)90年代初開(kāi)展的芯片毛細(xì)管電泳，是21世紀(jì)最為重要的前沿技術(shù)之一 采用微電子工業(yè)和半導(dǎo)體制造業(yè)中的一些精細(xì)加工工藝，在硅片、玻片和塑料等表面經(jīng)過(guò)必要的化學(xué)處理后，加工出微細(xì)（微米尺寸）結(jié)構(gòu)，制作成一塊幾平方厘米的芯片，化學(xué)或者生物化學(xué)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程可微縮到該芯片上進(jìn)行，用于生物樣品分離、反應(yīng)、分析，是一種新型的生物芯片。微流控分析芯片實(shí)驗(yàn)室的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 芯片實(shí)驗(yàn)室由進(jìn)樣系統(tǒng)、樣品過(guò)濾和抽提機(jī)械、流體系統(tǒng)、閥系統(tǒng)、電泳等分離系統(tǒng)以及檢測(cè)系統(tǒng)等部分組成，大體可分為三個(gè)部分：不同功能的微流控芯片、芯片微流體運(yùn)行控制裝置及信號(hào)采集的控制與檢測(cè)裝置。細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)運(yùn)輸運(yùn)輸清洗清洗破碎破碎樣品樣品純化純化電泳電泳分離分離突出特色p將細(xì)胞的操縱、傳輸、進(jìn)樣、定位溶胞反應(yīng)、分離及檢測(cè)等均集成在微流控芯片上完成, 采用微泵及微閥控制可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。p電泳分離時(shí)間大大減少典型的毛細(xì)管電泳分析單細(xì)胞效率為8-10 細(xì)胞d/微流控芯片高通量單細(xì)胞分析已達(dá)到7-12 細(xì)胞/min較