第六章親和分離技術

1、第六章 親和分離技術 生物大分子之間的特異性結合作用稱為生物親和作用（bioaffinity），簡稱親和作用，如抗原與抗體、酶與酶原（或抑制劑、底物）、核酸與互補堿基鏈等。 利用親和作用純化生物大分子的生化分離技術稱為親和分離技術，它是基于固定相的配基與生物分子間的特殊生物親和能力的不同來進行相互分離的。 第一節(jié) 親和技術發(fā)展 1910年有人發(fā)現(xiàn)不溶性淀粉可以選擇性吸附生物組織抽提液中的-淀粉酶，這是親和分離法的最初應用及報道。 1951年Campbell等利用半抗原（對氨苯甲基）修飾纖維素制備的載體為親和吸附介質從血清中純化了抗體，這是人們開始有意識利用生物親和作用純化蛋白質的研究。 由于親

2、和吸附介質制備技術的障礙，親和分離技術的實用化進程進展緩慢。 1967年Axen和Cuatrecasas等開發(fā)了利用溴化腈活化瓊脂糖凝膠制備親和吸附介質的方法，才使親和分離技術從研究走向實用。 20世紀80年代以后，親和技術與其他分離技術如膜分離、萃取技術、電泳技術、色譜技術等相結合，相繼出現(xiàn)了親和色譜、膜親和過濾、親和萃取、親和電泳等新型的親和分離技術。其中最典型的是親和色譜技術。第二節(jié) 親和分離原理一、生物親和作用 affinity（親和）一詞源于拉丁語的affinitus，原意為結婚或親緣關系，因此在化學或生物化學中，affinity可以理解為分子之間的結合作用。 實際上，親和作用不止限

3、于生物物質之間，對于簡單的化合物，如Na+和Cl-通過靜電作用相互吸引的現(xiàn)象也是一種親和作用。因此，親和作用是自然界普遍存在的現(xiàn)象，只是生物分子間的親和作用具有更高的選擇性。 生物物質，特別是酶和抗體等蛋白質，具有識別特定物質并與該物質的分子相結合的能力。這種識別并結合的能力具有排他性，即生物分子能夠區(qū)分結構和性質非常接近的其他分子，選擇性地與其中某一種分子相結合。 生物親和作用是生命誕生、維持與延續(xù)的重要基礎，而親和分離技術則是人類利用生物親合作用的方式。親和作用的本質：鎖鑰理論 參與親和作用的兩個分子（或物質）中，其中之一為蛋白質的情況占絕大多數(shù)，或者兩者均為蛋白質。蛋白質是高分子化合物，

4、種類繁多、結構復雜，其參與親和作用的機理尚不完全清楚，一般認為是蛋白質的立體結構中含有某些參與親和結合的部位，這些結合部位呈凹陷或凸起狀，能與該蛋白質發(fā)生親和作用的分子恰好可以進入到此凹陷結構中，或者該蛋白質的凸起部位恰好能夠進入與其發(fā)生親和作用的分子的凹陷部位，就像鑰匙和鎖孔的關系一樣。 具有親和作用的分子對之間具有鑰匙和鎖孔的關系是產生親和作用的必要條件，但并不充分，除此之外，要想發(fā)生親和作用還需要分子或原子水平的各種相互作用。（1）靜電作用（2）氫鍵（3）疏水性相互作用（4）配位鍵（5）弱共價鍵 靜電作用：近距離產生較大的作用力，但應與其它因素結合才能具有親和識別作用。 氫鍵：分子中的氧

5、原子和氮原子，可形成氫鍵作用。與原子間距離有關，應較近。 疏水性相互作用：需兩分子都具有疏水性基團。 配位鍵：咪唑基（組氨酸）和Zn2、Cu2、Ni2等產生配位鍵，形成金屬螯合結構。 弱共價鍵：可逆共價鍵，結合力較弱。二、影響親和作用的因素1、離子強度 離子強度影響靜電引力、氫鍵作用、疏水相互作用等。離子強度越大，靜電力和氫鍵力都降低，而疏水作用增強。2、pH值 在適當?shù)膒H下，親和結合作用較高，在其它pH下，親和作用減弱或完全破壞。 如：當?shù)鞍踪|的結合部位存在羧基時，在pH值等于該羧基的pKa時，該羧基的50%帶負電荷，當pH值高于pKa一個pH單位時，該羧基的90%帶負電荷，當pH值低于p

6、Ka一個pH單位時，該羧基的10%帶負電荷。3、抑制氫鍵形成的物質 脲和鹽酸胍的存在可抑制氫鍵的形成，但容易使蛋白質變性。4、溫度 溫度升高，靜電力、氫鍵、金屬配位鍵減弱，疏水力增強。5、離液離子 SCN-，I-，ClO4-等離子半徑較大的離液陰離子（破壞水化作用）存在時，疏水性親和作用降低。6、螯合劑 加入螯合劑（如EDTA），去除金屬離子，破壞配位鍵，會使親和作用消失。三、親和作用體系 將親和體系中的一種分子與固體粒子共價偶聯(lián)，可特異性結合另一種分子（目標產物） ，使其從混合物中高選擇性地分離純化。 一般將被固定的分子稱為其親和結合對象的配基（ligand），用L表示。Kd：解離常數(shù) Ke

7、q：結合常數(shù)Keq越大，親和結合作用越強。Keq一般為104108 L/mol，最高（生物素抗生物蛋白）可達到1015 L/mol 。 親和配基必須具備的條件(選擇原則) ：（1）專一性識別或特異性作用必須是可逆的 配基與被分離生物大分子之間的專一性識別或特異性作用，必須是可逆的。（2）結合常數(shù)要適當 配基與被分離分子之間結合力要有足夠高，以能形成穩(wěn)定的復合物；同時結合又不能太強，否則洗脫困難。（3）穩(wěn)定性好，可進行化學改性（4）固定到載體上后配基的專一性識別或特異性作用不發(fā)生明顯的變化。 專一性和特異性決定著分離純化的產品純度，相互作用的強弱決定著吸附和解吸的難易程度。配基的類型： 單專一性

8、的小分子配基 基團專一性的小分子親和配基 專一性的大分子親和配基 免疫親和配基 基團專一性的大分子親和配基（1）酶的抑制劑 小分子抑制劑有芐脒（benzamidine）、精氨酸和賴氨酸等。（2）抗體 利用抗原與抗體間特異性結合的親和技術稱為免疫親和技術。 抗體與抗原之間的Keq一般為1071012 L/mol。 因此，利用免疫親和法是高度純化蛋白質類生物大分子的有效手段。（3）A蛋白 Protein A為分子量約42 kD的蛋白質，與IgG具有很強的親和作用，結合部位為IgG分子的Fc片段。A蛋白分子上含有5個Fc片段可結合部位。 不同IgG的Fc片段的結構非常相似，因此A蛋白可作為各種抗體的

9、親和配基，但不同抗體的結合常數(shù)有所不同。 A蛋白與抗體結合并不影響抗體與抗原的結合能力，因此A蛋白也可用于分離抗原-抗體的免疫復合體。（4）凝集素 凝集素（lectin）是與糖特異性結合的蛋白質（酶和抗體除外）的總稱。 伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，con A） 可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的分析、純化。pH5.6時con A為二聚體，分子量為52 kD；pH5.6時為四聚體，分子量為102 kD，兩個亞基（subunit）之間通過二硫鍵結合。因此，在利用con A為配基的親和分離技術中，操作條件應當適宜。（5）輔酶和磷酸腺苷 脫氫酶和激酶與輔酶之間具有親和結合作用

10、。 輔酶主要有NAD（nicotinamide adenine dinucleotide）、 NADP（NAD phosphate）和ATP（adenosine triphosphate）等。 這些輔酶可用做脫氫酶和激酶的親和配基。 AMP（adenosine 5-monophosphate）、 ADP（adenosine 2，5-diphosphate）的腺苷部分與上述輔酶的結構類似，可用做這些酶的親和配基。（6）三嗪類色素 Triazine dyes是一類分子內含有三嗪環(huán)的合成染料，與NAD的結合部位相同，又稱為生體模擬色素（biomimetic dye）。 除脫氫酶和激酶外，三嗪類色素還

11、與血清白蛋白、 干擾素、核酸酶和糖解酶等具有很高的親和力。Cibacron Blue F3GA ：（7）過渡金屬離子 Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等過渡金屬離子可通過與亞胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（TED）形成螯合金屬鹽固定在固定相粒子表面，用做親和吸附蛋白質的配基。（8）組氨酸 組氨酸可與蛋白質發(fā)生親和結合作用：靜電和疏水性相互作用均有可能參與親和結合。 在鹽濃度較低和pH約等于目標蛋白質pI的溶液中，固定化組氨酸的親和吸附作用最強，隨著鹽濃度增大，親和吸附作用降低。（9）肝素 肝素（heparin）是存在于哺乳動物的肝、肺、腸等臟器中的酸性多糖類物質，分子量一般為5至30

12、 kD，具有抗凝血作用。 肝素與脂蛋白、脂肪酶、甾體受體、限制性核酸內切酶、抗凝血酶、凝血蛋白質等具有親和作用，可用作這些物質的親和配基。 肝素的親和結合作用在中性pH和低濃度鹽溶液中較強，隨著鹽濃度的增大結合作用降低。親和配基的選擇（1）組合化學肽庫選擇親和配基 目標肽反義肽組合合成親和篩選優(yōu)選序列（2）噬菌體展示技術 目標蛋白可結合噬菌體擴增多輪篩選單克隆群體氨基酸序列（3）SELEX技術 隨機序列PCR擴增特異性結合重復篩選間隔臂 當配基的分子量較小的時候，如果將其直接固定到載體上，會由于空間位阻的影響，配基與生物大分子不能發(fā)生有效的結合。 這時需要在配基和載體之間引入一個間臂分子，使配

13、基和生物大分子發(fā)生有效作用。引入間臂分子最常用的方法: 先將間臂分子氨烷基化合物NH2(CH2)nCOOH、 NH2(CH2)n NH2連接到載體上。 然后將親和配基連接在間臂分子上。 羧基和氨基在碳二亞胺的作用下可以縮合形成酰胺鍵。 間臂的長度是很重要的因素，太短，效果不明顯；太長，間隔臂容易彎曲，結合效果會下降。實驗結果表明，一般引入46個亞甲基時，間臂分子效果較好，常用的間臂分子為-氨基己酸、1，6-二氨基己烷。 載體要求：（1）具有親水、多孔結構；（2）含有可活化的反應基團；（3）理化性質穩(wěn)定，不因共價偶聯(lián)反應的條件及吸附條件的變化而發(fā)生變化；（4）非特異吸附小。 多糖類的凝膠過濾介質

14、表面含有大量可活化的羥基可作為親和配基的載體。 表面具有氨基的聚丙烯酰胺類的載體也常作為親和配基的載體。 還可采用一些無機載體如硅膠和多孔玻璃。 常用載體纖維素 (cellulose)瓊脂糖凝膠 葡聚糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它載體殼聚糖 (Chitosan)（1）纖維素纖維素結構緊密、均一性差，不利于大分子的滲入。非特異性吸附力較強，空間位阻。主要用于分離與核酸有關的物質。（2）瓊脂糖凝膠瓊脂糖濃度有2%、4%、6%，商品為Sepharose 2B、4B和6B（Pharmacia）。保持吸附物質活性，能迅速活化并接上各種功能基團，結構疏松孔徑大，流速快。穩(wěn)定

15、性好，能在pH314中應用。（3）葡聚糖凝膠： 葡聚糖凝膠孔徑太小，偶聯(lián)配基后，孔徑更小，應用受到限制。 （4）聚丙烯酰胺凝膠： Bio-gel P 有供化學反應的酰胺基，能制得配基含量較高的親和柱，適用于親和勢比較低的系統(tǒng)。 pH過高或過低的溶液中酰胺基易水解。（5）多孔玻璃珠： 化學與物理穩(wěn)定性較好，機械強度高。 缺點：親水性不強，對蛋白質尤其是堿性蛋白質有非特異性吸附，化學活性基團少。（6）其它載體殼聚糖第三節(jié) 親和分離技術的應用一、親和分離過程 1、配基固定化：配基與載體偶聯(lián)，結合成具有特異親和性的分離介質。 2、吸附樣品：親和層析介質選擇性吸附生物活性物質。 3、樣品解吸：選擇適宜的

16、條件使被吸附物活性物質解吸。 目標產物的洗脫方法有特異性洗脫和非特異性洗脫。（1）特異性洗脫劑含有與親和配基或目標產物具有親和結合作用的小分子化合物，通過與親和配基或目標產物的競爭性結合，洗脫目標產物。例如：Lys和Arg均為t-PA（組織纖溶酶原激活劑，一種糖蛋白）的抑制劑，利用固定化Lys為配基親和分離t-PA時，可用Arg溶液進行洗脫。 利用con A為配基的目標產物可用葡萄糖溶液洗脫。 特異性洗脫法的洗脫條件溫和，有利于保護目標產物的生物活性，另外，由于僅特異性洗脫目標產物，對于特異性較低的親和體系（例如，用三嗪類色素為配基時）或非特異性吸附較嚴重的物系，特異性洗脫法有利于提高目標產物

17、的純度。 （2）非特異性洗脫通過調節(jié)洗脫液的pH、離子強度、離子種類或溫度等降低目標產物的親和吸附作用。二、親和分離技術1、親和色譜 利用偶聯(lián)有親和配基的層析介質為固定相，根據生物分子之間的親和作用進行物質分離的色譜方法。與固定床吸附操作類似，其過程包括： 進料（feedstock loading） 雜質清洗（contaminant washing） 目標產物洗脫（target product elution） 色譜柱再生（column regeneration） 對大多數(shù)親和層析，一步可以達到很高的純化倍數(shù)。 特異性高的親和層析洗脫只出一個峰，對親和作用選擇性較低的分離，可用梯度和階梯洗脫分

18、離目標產物 親和層析的基本特點：（1）純化過程簡單、迅速，且分離效率高（2）特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子（3）純化倍數(shù)大，產物純度高（4）必須針對某一分離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件（5）價格相對較昂貴；（6）在洗脫中，交聯(lián)在層析介質上的配基可能脫落并進入產品中，從而造成不良影響，如抗體、染料等配基。親和色譜的配體 理想的配體應符合下面的要求：（1）極低的非特異性吸附。（2）高度的親水性。（3）較好的理化穩(wěn)定性。（4）大量的化學基團能被有效地活化，而且容易和配體結合。（5）適當?shù)亩嗫仔?。一般親和吸附劑采用的配體有纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、交聯(lián)瓊

19、脂糖、多孔玻璃珠等。 根據配體對待分離物質的親和性的不同，可以將其分為兩類：特異性配體（specific ligand）和通用性配體（general ligand）。 特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質等生物大分子結合的配體。如生物素和親和素、抗原和抗體、酶和它的抑制劑、激素受體等，它們結合都具有很高的特異性，用這些物質作為配體都屬于特異性配體。配體的特異性是保證親和層析高分辨率的重要因素，但尋找特異性配體一般是比較困難的，尤其對于一些性質不很了解的生物大分子，要找到合適的特異性配體通常需要大量的實驗。 通用性配體一般是指特異性不是很強，能和某一類的蛋白質等生物大分子結合的配體，如各

20、種凝集素（lectine）可以結合各種糖蛋白，核酸可以結合RNA、結合RNA的蛋白質等。通用性配體對生物大分子的專一性雖然不如特異性配體，但通過選擇合適的洗脫條件也可以得到很高的分辨率。而且這些配體還具有結構穩(wěn)定、偶聯(lián)率高、吸附容量高、易于洗脫、價格便宜等優(yōu)點，所以在實驗中得到了廣泛的應用。配基的濃度：（1）對親和勢比較低的時候（Kd10-4mol/L），增加配基濃度有利于吸附。（2）增加親和柱的長度來提高吸附率。（3）配基濃度太高使吸附力太強，洗脫困難。（4）理想的配基濃度為1-10mol/L。配基偶聯(lián)的位置：（1）配基固定化時，其不參與親和結合的部位與載體進行偶聯(lián)。（2）腺嘌呤N6-氨基接

21、到載體上，對脫氫酶和甘油激酶有吸附力。（3）磷酸基接到載體上，對甘油醛-3-磷酸脫氫酶有吸附力。配基分子的大小：（1）選用大分子配基。（2）小分子物質作為配基，載體和配基間插入一個“手臂”以消除空間障礙。介質活化與耦聯(lián)： 基質的活化是指通過對基質進行一定的化學處理，使基質表面上的一些化學基團轉變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結合的活性基團。常用方法：（1）溴化氰活化法（2）環(huán)氧基活化法 上面兩種方法是比較常用的方法，另外還有甲苯磺酰氯法、雙功能試劑法。（1）溴化氰活化法 溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化過程主要是生成亞胺碳酸活性基團，它可以和伯氨(NH2)反應，主要生成異脲衍生物。反應如下： 這種方

22、法的缺點是溴化氰活化法的基質和配體偶聯(lián)后生成的異脲衍生物中氨基的pKa10.4，所以通常會帶一定的正電荷，從而使基質可能有陰離子離子交換作用，增大了非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。另外溴化氰活化的基質與配體結合不夠穩(wěn)定，尤其是當與小配體結合時，可能會出現(xiàn)配體脫落現(xiàn)象。另外溴化氰有劇毒、易揮發(fā)，所以操作不便。（2）環(huán)氧基活化法 在熱的濃堿溶液中，多糖類化合物與環(huán)氧氯丙烷作用生成環(huán)氧化合物； 在堿性條件下，其環(huán)氧化合物又能與氨基酸或蛋白質上氨基偶聯(lián)。 這種活化方法的優(yōu)點是活化后不引入電荷基團，而且基質與配體形成的NC、OC 和SC 鍵都很穩(wěn)定，所以配體與基質結合緊密，親和吸附劑使用壽命長，而且

23、便于在親和層析中使用較強烈的洗脫手段，另外這種處理方法沒有溴化氰的毒性。它的缺點是用環(huán)氧氯丙烷活化的基質在與配體偶聯(lián)時需要堿性條件，pH 為9-13，溫度為20-40。這樣的條件對于一些比較敏感的配體可能不適用。 常見的親和色譜：（1）核苷酸及輔酶親和色譜（2）固定化金屬離子親和色譜（3）染料親和色譜（4）免疫親和色譜（5）基團專一性大分子親和色譜（1）核苷酸及輔酶親和色譜：指將核苷酸（或輔酶）作為親和配基固定在色譜介質上進行親和色譜的技術，主要利用核苷酸特別是輔酶因子和蛋白質之間的專一性識別達到分離純化目的。（2）固定化金屬離子親和色譜：蛋白質上的氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基

24、和色氨酸的吲哚基，有利于蛋白質與固定化金屬離子結合，從而達到分離的目的。金屬離子如鋅和銅。將活化的介質與金屬螯合劑偶聯(lián)，再用金屬離子溶液處理制成金屬螯合親和層析柱。（3）染料親和色譜：有機染料具有類似于NAD+的結構，需核苷酸類物質為輔酶的酶，對染料具有一定親和力，染料共價偶聯(lián)到瓊脂糖載體上，能制得親和層析柱，染料親和層析已成功的分離純化了多種酶。（4）免疫親和色譜：抗原和抗體的作用具有高度的專一性, 并且它們的結合親和力極強。因此用適當?shù)姆椒▽⒖乖蚩贵w結合到吸附劑上, 便可有效地分離和純化免疫物質。 特點：分離效率高，成本高，而且蛋白質親和配基不穩(wěn)定，容易降解。（5）基團專一性大分子親和色

25、譜：指用對某一類結構相近的物質有親和性的大分子作為親和配基偶聯(lián)在色譜介質上進行的色譜技術。例如：蛋白A親和色譜 伴刀豆球蛋白A親和色譜 肝素親和色譜親和色譜技術的應用：（1）t-PA的純化酶的抑制劑為親和配基（2）干擾素的純化免疫親和色譜（3）脫氫酶的純化色素親和色譜（4）淀粉酶抑制劑的純化固定化金屬離子親和色譜（5）基因重組融合蛋白的純化2、親和過濾（膜分離） 將親和層析和膜過濾技術結合運用，包括親和錯流過濾和親和膜分離。（1）親和錯流過濾（Affinity Cross Flow Filtration：ACFF）: 是將親和層析與超濾技術結合，高分子底物經專一可逆的親和反應后，用膜進行錯流過

26、濾，兼有親和層析與膜過濾的優(yōu)點。親和錯流過濾過程： 基質是聚合物組成的內核，親和配基連接在內核表面。配基對提取的目標物進行專一可逆的吸附，形成復合體； 用膜對混合液進行錯流過濾，復合體因分子巨大可被保留，雜質隨液體透過膜，目標物與其它成分分離。 親和錯流過濾特點：以壓差為傳質推動力，速度快，易于放大；純化水平可接近或達到親和色譜；制備親和過濾介質所用的載體一般為水溶性聚合物或無孔微粒，無內擴散傳質阻力，目標分子的親和結合速度快；與固定床型親和色譜相比，親和過濾操作中目標分子與親和過濾介質的接觸在全混槽中進行，最多只能達到一級吸附平衡，相當于色譜過程的一個理論塔板。采用多級串聯(lián)親和過濾操作可彌補

27、這一缺點。（2）親和膜分離： 親和膜利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質親和純化目標蛋白質，是固定床親和層析的變型。 將一張微濾膜比喻為一個固定床，膜厚為床層高度。 親和膜優(yōu)點：傳質阻力小，達到吸附平衡的時間短；配基利用率高，配基用量低；壓降小，流速快；設備體積小。 親和配基固定在膜孔表面，流體在對流透過膜的過程中目標蛋白質與配基接觸而被吸附。 親和膜吸附原理示意圖 親和色譜操作速度有限。一般采用徑向放大的方式，才能保證色譜柱的處理量。 如果色譜柱的體積一定，降低柱高而增大柱徑即“短粗”型親和色譜柱有利于提高分離速度。3、親和萃取 利用偶聯(lián)親和配基的PEG為成相聚合物進行的雙水相萃取，在親和

28、配基的親和結合作用下促進目標產物在PEG相（上相）的分配，提高目標產物的分配系數(shù)和選擇性。體系：PEG/Dextran，PEG/無機鹽 近幾年來，僅在PEG上可接的配基就有十多種，分離純化的物質達幾十種，產物的分配系數(shù)成百上千倍的提高，如用磷酸酯PEG磷酸鹽雙水相體系萃取-干擾素，分配系數(shù)由原來的1左右提高到630。4、親和反膠團萃?。╝ffinity-based reversed micellar extraction）：是指在反膠團相中除通常的表面活性劑（如AOT）以外，添加另一種親水頭部為目標分子的親和配基的助表面活性劑（cosurfactant），通過親和配基與目標分子的親和結合作用，促進目標產物在反膠團相的分配，提高目標產物的分配系數(shù)和反膠團萃取分離的選擇性的分離方法。5、親和沉淀