課題3 分解纖維素的微生物得分離

1、課題課題3 分解纖維素的微分解纖維素的微生物得分離生物得分離439班 1組學習目標* 簡述纖維素酶的種類和作用* 從土壤中分離出分解纖維素的微生物* 討論這類微生物的應用價值纖維素纖維素纖維素（cellulose）是由葡萄糖組成的大分子多糖，不溶于水及一般有機溶劑，是植物細胞壁的主要成分。纖維素是世界上最豐富的天然有機物，占植物界碳含量的50以上。棉花的纖維素含量接近100%；一般木材中，纖維素占4050%。食物中的纖維素（即膳食纖維）對人體的健康有重要的作用。纖維素也是重要的造紙原料。此外，以纖維素為原料的產(chǎn)品也廣泛用于塑料、炸藥、電工及科研器材等方面。組成C,H,O三種元素 葡萄糖(單糖)

2、(C6H12O6) 纖維素(C6H10O5)n性質(zhì)纖維素為白色無氣味的纖維狀結(jié)構物質(zhì)，不溶于水，也不溶于一般有機溶劑。與淀粉一樣，纖維素不具有還原性，但在強酸強堿或稀酸加壓下能進行水解反應，產(chǎn)生葡萄糖，故其水解產(chǎn)物具有還原性。用途纖維素可用于造紙，紡織，制造炸藥等。分布棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物，此外，木材，亞麻，作物秸稈等也富含纖維素?；咀饔美w維素的主要生理作用是吸附大量水分，增加糞便量，促進腸蠕動，加快糞便的排泄，使致癌物質(zhì)在腸道內(nèi)的停留時間縮短，對腸道的不良刺激減少，從而可以預防腸癌發(fā)生。溶解性 常溫下，纖維素既不溶于水，又不溶于一般的有機溶劑，如酒精、乙醚、丙酮、苯等。它

3、也不溶于稀堿溶液中。因此，在常溫下，它是比較穩(wěn)定的，這是因為纖維素分子之間存在氫鍵。纖維素水解在一定條件下，纖維素與水發(fā)生反應。反應時氧橋斷裂，同時水分子加入，纖維素由長鏈分子變成短鏈分子，直至氧橋全部斷裂，變成葡萄糖。纖維素氧化纖維素不溶于水和乙醇、乙醚等有機溶劑，能溶于銅氨Cu(NH3）4（OH）2溶液和銅乙二胺NH2CH2CH2NH2Cu（OH）2溶液等。水可使纖維素發(fā)生有限溶脹，某些酸、堿和鹽的水溶液可滲入纖維結(jié)晶區(qū)，產(chǎn)生無限溶脹，使纖維素溶解。纖維素加熱到約150時不發(fā)生顯著變化 ，超過這溫度會由于脫水而逐漸焦化。纖維素與較濃的無機酸起水解作用生成葡萄糖等，與較濃的苛性堿溶液作用生成

4、堿纖維素，與強氧化劑作用生成氧化纖維素。柔順性纖維素柔順性很差，是剛性的，因為（1）它分子有極性，分子鏈之間相互作用力很強；（2）纖維素中的六元吡喃環(huán)結(jié)構致使內(nèi)旋轉(zhuǎn)困難；（3）其分子內(nèi)和分子間都能形成氫鍵特別是分子內(nèi)氫鍵致使糖苷鍵不能旋轉(zhuǎn)從而使其剛性大大增加。膳食纖維人類膳食中的纖維素主要含于蔬菜和粗加工的谷類中，雖然不能被消化吸收，但有促進腸道蠕動，利于糞便排出等功能。草食動物則依賴其消化道中的共生微生物將纖維素分解，從而得以吸收利用。食物纖維素包括粗纖維、半粗纖維和木質(zhì)素。食物纖維素是一種不被消化吸收的物質(zhì)，過去認為是“廢物”，現(xiàn)在認為它在保障人類健康，延長生命方面有著重要作用。因此，稱它

5、為第七種營養(yǎng)素。膳食纖維素，一般采用從天然食物（魔芋、燕麥、蕎麥、蘋果、仙人掌、胡蘿卜等）中提取的多種類型的高純度膳食纖維。膳食纖維素的主要功能為：1、治療糖尿病 膳食纖維可提高胰島素受體的敏感性，提高胰島素的利用率；膳食纖維能包裹食物的糖分，使其逐漸被吸收，有平衡餐后血糖的作用，從而達到調(diào)節(jié)糖尿病患者的血糖水平，治療糖尿病的作用。2、預防和治療冠心病 血清膽固醇含量的升高會導致冠心病。膽固醇和膽酸的排出與膳食纖維有著極為密切的關系。膳食纖維可與膽酸結(jié)合，而使膽酸迅速排出體外，同時膳食纖維與膽酸結(jié)合的結(jié)果，會促使膽固醇向膽酸轉(zhuǎn)化，從而降低了膽固醇水平。3、降壓作用 膳食纖維能夠吸附離子，與腸道

6、中的鈉離子、鉀離子進行交換，從而降低血液中的鈉鉀比值，從而起到降血壓的作用4、抗癌作用 自七十年代以來，膳食纖維在抗癌方面的研究報道日益增多，尤其是膳食纖維與消化道癌的關系。早期在印度的調(diào)查顯示，生活在印度北部人們膳食纖維的食用量大大高于南部，而結(jié)腸癌的發(fā)病率也大大低于南部。根據(jù)這個調(diào)查結(jié)果，科學家做了更加深入的研究，發(fā)現(xiàn)膳食纖維防治結(jié)腸癌有以下幾點原因：結(jié)腸中一些腐生菌能產(chǎn)生致癌物質(zhì)，而腸道中一些有益微生物能利用膳食纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸，這類短鏈脂肪酸能抑制腐生菌的生長；膽汁中的膽酸和鵝膽酸可被細菌代謝為細胞的致癌劑和致突變劑，膳食纖維能束縛膽酸等物質(zhì)并將其排出體外，防止這些致癌物質(zhì)的產(chǎn)生；膳

7、食纖維能促進腸道蠕動，增加糞便體積，縮短排空時間，從而減少食物中致癌物與結(jié)腸接觸的機會；腸道中的有益菌能夠利用膳食纖維產(chǎn)生丁酸，丁酸能抑制腫瘤細胞的生長增殖，誘導腫瘤細胞向正常細胞轉(zhuǎn)化，并控制致癌基因的表達。5、減肥治療肥胖癥 膳食纖維取代了食物中一部分營養(yǎng)成份的數(shù)量，而使食物總攝取量減少。膳食纖維促增加唾液和消化液的分泌，對胃起到了填充作用，同時吸水膨脹，能產(chǎn)生飽腹感而抑制進食欲望。膳食纖維與部分脂肪酸結(jié)合，這種結(jié)合使得當脂肪酸通過消化道時，不能被吸收，因此減少了對脂肪的吸收率。6、治療便秘 膳食纖維具有很強的持水性，其吸水率高達10倍。它吸水后使腸內(nèi)容物體積增大，大便變松變軟，通過腸道時會

8、更順暢更省力。與此同時，膳食纖維作為腸內(nèi)異物能刺激1腸道的收縮和蠕動，加快大便排泄，起到治便秘的功效。7、清除外源有害物質(zhì) 膳食纖維對陽離子有較強的結(jié)合和交換能力，能吸附結(jié)合有機化合物，可以作為某些環(huán)境污染物質(zhì)最后的屏障，防止它們最終侵害人體，起到解毒作用。目前已發(fā)現(xiàn)膳食纖維對鈣、汞、鉛、高濃度銅、鋅，特別是有機陽離子具有清除能力?？墒顾鼈兊臐舛扔芍卸舅竭_到安全水平。此外，不溶性膳食纖維可縮短糞便在腸道的停留時間，稀釋有害物質(zhì)在腸道中的濃度，減少有害物如黃曲霉毒素、亞硝胺、酚、多環(huán)芳烴等在腸道的滯留時間，從而減少人體對它們的吸收。水溶性膳食纖維被人體消化吸收，進入大腸內(nèi)為雙歧桿菌所利用，促進

9、雙歧桿菌增殖。雙歧桿菌能分解致癌物亞硝胺，并能提高巨噬細胞的吞噬能力，增加人體免疫功能和對腫瘤的抵抗力。纖維素酶纖維素酶纖維素酶，是由多種水解酶組成的一個復雜酶系，自然界中很多真菌都能分泌纖維素酶。習慣上，將纖維素酶分成三類：C1酶、Cx酶和葡糖苷酶。C1酶是對纖維素最初起作用的酶，破壞纖維素鏈的結(jié)晶結(jié)構。Cx酶是作用于經(jīng)C1酶活化的纖維素、分解-1，4-糖苷鍵的纖維素酶。葡糖苷酶可以將纖維二糖、纖維三糖及其他低分子纖維糊精分解為葡萄糖。纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中。細菌、真菌、動物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。一般用于生產(chǎn)的纖維素酶來自于真菌，比較典型的有木酶屬(Trichoderma)、曲

10、霉屬（Aspergillus）和青霉屬(Penicillium）。纖維二糖纖維二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纖維素纖維素 在在2支支20mL的試管中，分別放入的試管中，分別放入16cm的濾紙條，再分別加入的濾紙條，再分別加入pH為為4.8、物質(zhì)的量、物質(zhì)的量濃度為濃度為0.1mol/L的的醋酸醋酸-醋酸鈉緩沖液醋酸鈉緩沖液10mL、11mL。在加入。在加入10mL緩沖液的試管中加入緩沖液的試管中加入1mL纖維素酶（纖維素酶（7080U/mL）。將二支試管）。將二支試管固定在固定在50mL的錐形瓶中，在搖床上以的錐形瓶中，在搖床上以140r/min的轉(zhuǎn)速振蕩

11、反應的轉(zhuǎn)速振蕩反應1h，觀察結(jié)果。，觀察結(jié)果。1U表示表示1個酶活力單位，是指在溫度為個酶活力單位，是指在溫度為25，其他反應條件，其他反應條件，如如pH等，均為最適的情況下，在等，均為最適的情況下，在1min內(nèi)轉(zhuǎn)化內(nèi)轉(zhuǎn)化1mmol的底物所的底物所需的酶量。需的酶量。底物：酶所作用和催化的化合物。底物：酶所作用和催化的化合物。 濾濾紙紙崩崩潰潰法法在一支試管中添加纖維素酶，在一支試管中添加纖維素酶，另一支試管不添加纖維素酶；另一支試管不添加纖維素酶；思考思考1實驗分析：實驗分析：P27的小的小實驗是如何構成對照的？實驗是如何構成對照的？土壤土壤取樣取樣選擇選擇培養(yǎng)培養(yǎng)梯度梯度稀釋稀釋將樣品涂將

12、樣品涂布到鑒別布到鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基挑選挑選菌落菌落什么什么樣的樣的環(huán)境環(huán)境取樣取樣? 培養(yǎng)的目的培養(yǎng)的目的? ? 選擇培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的特點特點? ?挑選什挑選什么樣的么樣的菌落菌落? ?鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基的特點的特點? ?如何鑒別如何鑒別? ?根據(jù)根據(jù)：微生物：微生物對生存環(huán)境的對生存環(huán)境的要求，到相應要求，到相應環(huán)境中去找；環(huán)境中去找；目的：目的：增加纖維素增加纖維素分解菌的濃度，分解菌的濃度，以以確保能夠從樣品中確保能夠從樣品中分離到所需要的微分離到所需要的微生物；生物；剛果紅染色法剛果紅染色法實驗設計實驗設計思考：本實驗的流程與課題思考：本實驗的流程與課題2 2中的實驗流程有哪些中

13、的實驗流程有哪些異同？異同？ 本實驗流程與課題本實驗流程與課題2 2的流程的區(qū)別如下。課的流程的區(qū)別如下。課題題2 2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌得到菌落。本課題通過落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，到增殖后，再將菌液涂布在鑒別培養(yǎng)基上。其再將菌液涂布在鑒別培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。他步驟基本一致。 生物與環(huán)境的互相依存關系生物與環(huán)境的互相依存關系，在富含纖維素，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從的環(huán)境中纖維素

14、分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。境。將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實際上是人工設置纖維素分解菌生存的集中，實際上是人工設置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應將濾紙埋于深約適宜環(huán)境。一般應將濾紙埋于深約10cm10cm左右的左右的土壤中。土壤中。 具體步驟具體步驟稱取土樣20g無菌條件下加入裝有30mL選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中錐形瓶置于搖床上30振蕩培養(yǎng)12d培養(yǎng)液變渾濁吸取一定量培養(yǎng)液（如5mL)轉(zhuǎn)移至另一新鮮選擇培養(yǎng)基中搖床上振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)液變渾濁培養(yǎng)基組成提供主要的

15、營養(yǎng)物質(zhì)纖維素粉 5g碳源（能源）NaNO3 1g氮源、無機鹽KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g無機鹽酵母膏 0.5g生長因子、碳源、氮源水解酪素 0.5g氮源、生長因子溶解后，蒸餾水定容至1000mL水提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。可用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照,或者將纖或者將纖維素改為葡萄糖。維素改為葡萄糖。有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生

16、物可以大量繁殖。分解纖維素的微生物可以大量繁殖。101102103104105106 纖維素分解菌的篩選纖維素分解菌的篩選1、篩選纖維素分解菌的方法、篩選纖維素分解菌的方法_。該方法可以通過該方法可以通過_反應直接篩選。反應直接篩選。2、其原理是：剛果紅可以與纖維素形成、其原理是：剛果紅可以與纖維素形成_，當纖維素被，當纖維素被_分解后，分解后，紅色復合物無法形成，出現(xiàn)以紅色復合物無法形成，出現(xiàn)以_為中心的為中心的_，可以通過，可以通過_ 來篩選纖維素分解菌。來篩選纖維素分解菌。剛果紅染色法剛果紅染色法顏色顏色紅色復合物紅色復合物纖維素酶纖維素酶纖維素分解菌纖維素分解菌 透明圈透明圈是否產(chǎn)生透

17、明圈是否產(chǎn)生透明圈剛果紅剛果紅棕紅色粉末，溶于水呈黃紅色，溶于乙醇呈橙色，極微溶于丙酮，幾乎不溶于乙醚；最大吸收波長(pH 7.3) 488nm(E1%1cm595)；半數(shù)致死量(大鼠，靜脈)190mg/kg其他名稱：棉紅 直接大紅；直接剛果紅；煮大紅；直接朱紅；二苯基-4，4-二（偶氮-2-）-1-氨基萘-4-磺酸鈉酸堿指示劑，pH 3.0(藍紫)5.0(紅)；檢測胃液中的鹽酸和紙張酸度；檢定硼酸、氰化物；生物培養(yǎng)基的添加劑；生物染色，如胚胎切片、植物粘蛋白、纖維素、彈性組織等染色可根據(jù)是否可根據(jù)是否產(chǎn)生產(chǎn)生透明圈透明圈來篩選纖維來篩選纖維素分解菌素分解菌培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)CMC-

18、Na 510g碳源酵母膏 1g碳源、氮源、生長因子KH2PO4 0.25g無機鹽土豆汁 100mL碳源、生長因子瓊脂 15g凝固劑上述物質(zhì)溶解后，加蒸餾水定容至1000mL氫元素、氧元素鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基方法一：在長出菌落的培養(yǎng)基上，覆蓋質(zhì)量濃度為1mg/mL的CR溶液，1015min后，倒去CR溶液，加入物質(zhì)的量濃度為1mol/L的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液，此時，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會出現(xiàn)透明圈。方法二：配制質(zhì)量濃度為10mg/mL的CR溶液，滅菌后，按照每200mL培養(yǎng)基加入1mL的比例加入CR溶液，混勻后倒平板。等培養(yǎng)基上長出菌落后，產(chǎn)

19、生纖維素酶的菌落周圍將會出現(xiàn)明顯的透明圈。方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考： 漂洗作用漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。這兩種方法各有哪些優(yōu)點和不同？挑選產(chǎn)生透明圈的菌落挑選產(chǎn)生透明圈的菌落 挑取產(chǎn)生挑取產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，明顯的透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。一般即為分解纖維素的菌落。 接種到接種到纖維素分解菌的纖維素分解菌的選擇選擇培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在基上，在30300 0C C 37370 0C C培養(yǎng)，可獲得純培養(yǎng)，可獲得純培養(yǎng)。培養(yǎng)。選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基的區(qū)別

20、選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基的區(qū)別選擇培養(yǎng)基上的菌類，有2種或兩種以上時，只有適應環(huán)境(選擇培養(yǎng)基的基底)的菌種才能存活。鑒別培養(yǎng)基上的菌類，有兩種或兩種以上時，在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學藥品，使培養(yǎng)后會發(fā)生某種變化，從而區(qū)別不同類型的微生物(但培養(yǎng)基上的各個菌種均不死亡)。 成分中有了青霉素，那肯定是選擇培養(yǎng)基(青霉素是抗菌素的一種，是從青霉菌培養(yǎng)液中提制的分子中含有青霉烷、能破壞細菌的細胞壁并在細菌細胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素。既然青霉素的作用是殺菌，那么實驗對象必然是細菌，普通的細菌必然死亡，只能是具有抗性的存活下來，所以是選擇培養(yǎng)基)，因為成分中有糖類，所以同化類型為異養(yǎng)型(成分中加

21、入了糖類，那么就表明這種細菌需要糖類物質(zhì)，否則成分里就不會有，糖類是能源物質(zhì)，說明了這些細菌需要外界提供能量，是異養(yǎng)型的。)，培養(yǎng)細菌，可能為了選出具有抗青霉素能力的細菌突變體。 比較項目比較項目分解尿素的細菌分解尿素的細菌纖維素分解菌纖維素分解菌選選擇擇培培養(yǎng)養(yǎng)基基原理原理培養(yǎng)基培養(yǎng)基類型類型目的目的將細菌涂布在只有將細菌涂布在只有尿素做氮源的選擇尿素做氮源的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上將細菌培養(yǎng)在只有將細菌培養(yǎng)在只有纖維素粉做碳源的纖維素粉做碳源的選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株篩選菌株選擇培養(yǎng)，增加濃度選擇培養(yǎng)，增加濃度比較比較項目項目分解尿素的細菌分解尿

22、素的細菌纖維素分解菌纖維素分解菌鑒鑒定定培培養(yǎng)養(yǎng)基基原理原理現(xiàn)象現(xiàn)象方法方法脲酶檢測法脲酶檢測法剛果紅染色法剛果紅染色法在細菌分解尿素的化學反應在細菌分解尿素的化學反應中，細菌合成的脲酶將尿素中，細菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，的堿性增強，pHpH升高。在培升高。在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如果果pHpH升高指示劑會變紅升高指示劑會變紅剛果紅可以與纖維素形成剛果紅可以與纖維素形成紅色復合物，當纖維素被紅色復合物，當纖維素被纖維素酶催化分解后紅色纖維素酶催化分解后紅色復合物無法形成，培養(yǎng)基復合物無法形成，培養(yǎng)基上就會出現(xiàn)以纖維

23、素分解上就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈菌為中心的透明圈觀察菌落周圍是否有紅色的觀察菌落周圍是否有紅色的環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現(xiàn)觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來篩選纖維素分解菌透明圈來篩選纖維素分解菌四、結(jié)果分析與評價四、結(jié)果分析與評價 1.1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落出菌落 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。培養(yǎng)基制作合格。 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。了分解纖維素的微生物。 2.2.分離的結(jié)果是否一致