衍生化技術(shù)-hplc培訓(xùn)資料

1、衍生化技術(shù)-HPLC化學(xué)衍生化的目的化學(xué)衍生化的目的:通過合適的化學(xué)反應(yīng),生成特殊衍生化物，1. 改變待測物的色譜色譜保留特性以改善分離度；2. 改變待測物的檢測特性，以增加其對檢測器的響 應(yīng)（例：紫外標(biāo)記、熒光標(biāo)記、電化學(xué)標(biāo)記） ；3. 生成穩(wěn)定的衍生化物，改善待測物的不穩(wěn)定性（例：-SH基團(tuán)易氧化的問題可通過?；瘉斫鉀Q）。HPLC化學(xué)衍生化分類 在線化學(xué)衍生化 是否與HPLC系統(tǒng)聯(lián)機(jī) 離線化學(xué)衍生化 柱前衍生化 發(fā)生衍生化發(fā)應(yīng)的先后 柱后衍生化柱前衍生化 在色譜分離前，預(yù)先將樣品制成適當(dāng)?shù)难苌?，然后再進(jìn)入色譜柱進(jìn)行分離檢測。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：（1）對用作流動相的溶劑體系沒有限制；（2）反應(yīng)條件

2、，反應(yīng)速率不受限制； （3）通過選擇合適的試劑以及萃取方法，可以 消除許多干擾；（4）過量溶劑、試劑容易除去；（5）轉(zhuǎn)變成合適的衍生物，可使分離度改進(jìn)。缺點(diǎn)缺點(diǎn):（1）操作過程繁瑣，容易影響定量準(zhǔn)確性。（2）當(dāng)一個復(fù)雜組分樣品經(jīng)過衍生化反應(yīng) 后，有可能產(chǎn)生多種衍生化產(chǎn)物給色 譜分離帶來困難。 柱后衍生化 將樣品先注入色譜柱，按選定的色譜條件使樣品組分得以分離，當(dāng)各個組分從色譜柱流出后，分別與衍生化試劑相遇，在一定的反應(yīng)條件下，生成具有某種檢測特性的衍生化產(chǎn)物再進(jìn)入檢測器。 要求：要求：（1）對流動相的選擇更嚴(yán)格，必須考慮衍生化 試劑、反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度，以及它們與流 動相可能發(fā)生的副反應(yīng)；（2）

3、由于在高效液相色譜中采用高流速，因此 反應(yīng)速率必須很快（小于30s）；（3）檢測器對衍生化試劑不能有響應(yīng)。 柱后衍生流程圖柱后衍生流程圖如下： 紫外衍生化 熒光衍生化 電化學(xué)衍生化 手性衍生化 固定化酶反應(yīng)器（IMER）一、一、紫外衍生反應(yīng)紫外衍生反應(yīng) 在液相色譜法中，紫外吸收檢測器是最常見的一種高靈敏度檢測器。但很多化合物在紫外可見光譜區(qū)無吸收，而不能被檢測。將它們與帶有紫外吸收基團(tuán)的衍生試劑在在一定條件下發(fā)生反應(yīng)，由于反應(yīng)產(chǎn)物帶有發(fā)色基團(tuán)而能被檢測。 苯甲酰氯及其衍生物可與胺類化合物反應(yīng)生成強(qiáng)紫外吸收的苯甲酸酯類衍生物。 反應(yīng)式： 二、熒光衍生反應(yīng)熒光衍生反應(yīng) 在液相色譜法中，熒光檢測器是

4、一種高靈敏度、高選擇性的檢測器，比紫外檢測器的靈敏度要高10到1000倍，因此，為了檢測痕量非熒光物質(zhì)，常將它與熒光衍生化試劑反應(yīng)，生成熒光物質(zhì)，然后用熒光檢測器檢測 例、福多司坦血藥濃度測定方法的建立例、福多司坦血藥濃度測定方法的建立福多司坦的藥理作用福多司坦的藥理作用 福多司坦福多司坦(S-（3羥基丙基）羥基丙基）-L-半胱氨酸半胱氨酸, Fudosteine) 為新的具有粘液活性的半胱氨酸衍生物，祛痰效果極強(qiáng)為新的具有粘液活性的半胱氨酸衍生物，祛痰效果極強(qiáng)，而毒副作用極?。?，而毒副作用極?。?對大鼠和小鼠對大鼠和小鼠LD5010g/kg），化），化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。 獲準(zhǔn)的適應(yīng)癥：

5、獲準(zhǔn)的適應(yīng)癥：咳嗽，慢性支氣管炎，支氣管擴(kuò)張癥，塵肺病，咳嗽，慢性支氣管炎，支氣管擴(kuò)張癥，塵肺病，肺氣腫，非定型抗酸菌癥等疾患的祛痰。肺氣腫，非定型抗酸菌癥等疾患的祛痰。 例、福多司坦血藥濃度測定方法的建立例、福多司坦血藥濃度測定方法的建立 2 2、半胱氨酸結(jié)構(gòu)式：半胱氨酸結(jié)構(gòu)式：1、福多司坦結(jié)構(gòu)式、福多司坦結(jié)構(gòu)式: : 結(jié)結(jié) 構(gòu)構(gòu) 特特 點(diǎn)點(diǎn)HOCH2CH2CH2SCH2CHCOOHNH2 HSCH2CHCOOHNH2 3、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 為半胱氨酸衍生物；為半胱氨酸衍生物； 沒有強(qiáng)的紫外吸收，沒有強(qiáng)的紫外吸收， 沒有熒光；沒有熒光； 分子量小，極性大。分子量小，極性大。例、福多司坦

6、血藥濃度測定方法的建立例、福多司坦血藥濃度測定方法的建立福多司坦結(jié)構(gòu)式福多司坦結(jié)構(gòu)式: :HOCH2CH2CH2SCH2CHCOOHNH2 伯氨基伯氨基羧基羧基 參考氨基酸的測定方法，選擇合適的衍參考氨基酸的測定方法，選擇合適的衍生化試劑衍生化后測定。生化試劑衍生化后測定。在流動相中掃描福多司坦衍生化在流動相中掃描福多司坦衍生化產(chǎn)物的激發(fā)波長為產(chǎn)物的激發(fā)波長為338 nm，發(fā)，發(fā)射波長為射波長為450 nm；例、福多司坦血藥濃度測定方法的建立例、福多司坦血藥濃度測定方法的建立 HHOOHOCH2CH2CH2SCH2CHCOOHNH2OHCH2CH2SHNSCH2CH2OHCHCOOHCH2SC

7、H2CH2CH2OHPH+10.4反應(yīng)過程：反應(yīng)過程：取代基熒光團(tuán)（試劑分子母體）反應(yīng)基團(tuán)膽磺酰肼 DNS-H熒光衍生化試劑的分類：（四）羧酸類化合物的衍生試劑鄰苯二甲醛鄰苯二甲醛 OPA4-氯氯-7-硝基硝基-2,1,3-苯并惡二唑苯并惡二唑 NBD-Cl熒光素異硫氰酸酯熒光素異硫氰酸酯FITCFMOC芴代甲氧基酰氯芴代甲氧基酰氯 6-氨喹啉基琥珀酰亞胺碳酸酯氨喹啉基琥珀酰亞胺碳酸酯AQC羰基氯類： FMOC, CEOC磺酰氯類: DNs-Cl鹵代三嗪類: EDTN 1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN） 肼類肼類 DNs-H CEOC-HDNs-H CEOC-H 氨基類氨基類 氨基甲

8、基芘氨基甲基芘 （四）羧酸類化合物的衍生試劑: 溴甲基類 BrMMC 哌嗪基類 DBD-Pz 重氮甲烷基類 ADAM 其它類 9-(2-羥乙基)-吖啶酮 HEA4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素 (ADMC)7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃9-蒽重氮甲烷9-蒽重氮甲烷(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素)三、三、電化學(xué)衍生反應(yīng)電化學(xué)衍生反應(yīng) 指樣品與某些試劑反應(yīng)，生成具有電化學(xué)活性的衍生物，以便在電化學(xué)檢測器上有較高的響應(yīng)。環(huán)境介質(zhì)對電化學(xué)反應(yīng)有很大影響，如離子強(qiáng)度、pH值和溶劑組成等 。常用的電化學(xué)衍生化試劑常用的電化學(xué)衍生化試劑 ： 還原衍生試劑 最常用的還原衍生試劑是帶硝基的芳香化合物。 這些帶硝基的衍生物能分別與羥基、氨基、羧基、羰基化合物反應(yīng)生成具有電化學(xué)活性的衍生物。盡管這些衍生物都可用紫外檢測器，但電化學(xué)檢測的靈敏度高，選擇性更好。氧化衍生試劑 氧化衍生基團(tuán)有芳氨基、酚羥基等。氧化衍生反應(yīng)時，氧不干擾測定。許多紫外和熒光衍生試劑同樣可用于電化學(xué)衍生。 四、手性衍生化手性衍生化 用手性試劑與外消旋體反應(yīng)，在分子內(nèi)導(dǎo)入另一手性中心，柱前衍生反應(yīng)生成一對非對映異構(gòu)體，兩者間無鏡相關(guān)系，物理化學(xué)性質(zhì)不同，可用常規(guī)的色譜分離條件進(jìn)行分離。 選用該法分離通常基于以下原因：選用該法分離通?；谝韵略颍?不宜直接拆分，如游離胺類