[emuch]第18章__色譜法導論

1、第第18章章 色譜法導論色譜法導論18.1. 概論概論18.1.1. 分離科學的形成分離科學的形成1.蒸餾器與蒸餾設備2.沉淀、結晶、電解、萃取等分離技術 3.精餾、區(qū)域熔煉等 4.色譜與電泳18.1.2. 分離與色譜法分離與色譜法 分離（separation）是一種假定的（hypothetical）狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，物質完全被分開（isolation），就是說，含有n種化學組分的混合物被分成n種純的形式，并把它們置于n個獨立容器中。 困難：一是被分離組分在分離過程中再混合；二是被分離組分的濃度稀釋或分子離散。 色譜分離是基于混合物各組分在兩相中分布系數的差異，當兩相作相對移動時，被分離物質

2、在兩相間進行連續(xù)、多次分配，組分分配系數微小差異導致遷移速率差異，實現組分分離。 dcbadcba18.1.2. 分離與色譜法分離與色譜法 分析分離常在極微小體系內完成，如毛細管、芯片式的微通道。 分離分析的微型化，即微分離（microseparation）技術是當前的發(fā)展趨勢之一。 色譜亦是高效制備分離方法。與分析分離相比，制備分離處理的樣品或物料量要大得多，其目的也不盡相同。按分離目的和處理物料量可分為小規(guī)模實驗室制備分離和大規(guī)模工業(yè)制備分離。 經典柱色譜、制備色譜、萃取、精餾、結晶 精餾、萃取、吸附、吸收、膜分離18.1.3. 分離方法分類分離方法分類. 按相的類型分類1

3、8.1.3. 分離方法分類分離方法分類. 按分離機理分類18.1.3. 分離方法分類分離方法分類.按分離過程推動力分類18.1.4.色譜法分類色譜法分類. 按固定相的形態(tài)分類柱色譜：填充柱、整體柱、毛細管或開管柱平面色譜：薄層色譜和紙色譜. 按色譜動力學過程分類淋洗色譜法置換色譜法迎頭色譜法18.1.4.色譜法分類色譜法分類.按兩相的物理形態(tài)、分離機理等分類18.1.5.色譜法與其他分離、分析方法比較色譜法與其他分離、分析方法比較.與精餾、萃取分離比較1. 色譜、精餾與萃取同屬平衡分離方法。2. 色

4、譜法與精餾、萃取分離比較具有速度快、效率和選擇性高的特點。3. 精餾不能分離沸點相同的組分，萃取不能分離在溶劑中溶解度相同的組分；色譜法可分離沸點、溶解度相同的組分，可分離物理、化學性質相近，其他分離方法不能或難以分離的組分。 4. 精餾、萃取可分離物理化學性質差別較大的組分，儀器分析色譜法每次處理樣品量少。 5. 多級萃取和色譜法分離過程中分離組分被稀釋。18.1.5.色譜法與其他分離、分析方法比較色譜法與其他分離、分析方法比較.與化學分析方法比較1. 不受化學性質限制，是一種分離分析方法。2. 化學分析本身不具備分離功能，簡單、快速。3. 化學分析一般不適用于分析多組分的混

5、合物。 4. 化學分析定量方法簡易；色譜法定量測定較復雜。 18.1.5.色譜法與其他分離、分析方法比較色譜法與其他分離、分析方法比較.與光譜、質譜分析方法比較1. 光譜、質譜主要是物質定性鑒定分析方法，色譜法本質上不具備定性分析功能。2. 色譜法最主要的特點是適用于多組分復雜混合物分離分析。 3. 色譜儀器的價格相對比分子光譜、質譜儀器低得多，適用范圍和領域更廣。 4. 一般來說色譜檢測器比分子光譜法靈敏度更高，比質譜靈敏度低。 18.2色譜法基礎知識、基本概念和術語色譜法基礎知識、基本概念和術語18.2.1 色譜分離和相應基礎理論范疇 色譜基礎理論是從微觀分子運動和宏觀分布

6、平衡探討最大限度提高分離遷移和降低離散遷移的科學原理，包括色譜熱力學、色譜動力學和色譜分離理論。 各種色譜方法具有基本相同的動力學理論，也有相似的分離理論規(guī)律。 18.2.2 分布平衡分布平衡色譜過程涉及溶質在兩相中的分布平衡(distribution equilibrium)，平衡常數K稱為分布系數或分配系數：0)(.PTGsssaRT lnmmmaRT lnmmssaRTaRTlnln)exp(RTCCKms18.2.3分布等溫線分布等溫線分布系數與溶質濃度無關或隨溶質濃度變化而改變。在恒定溫度下，將CS 對Cm作圖所得組分或溶質在兩相中的濃度關系曲線，稱為分布等溫線。 18.2.4 分布

7、等溫線方程分布等溫線方程 描述吸附等溫線的數學方程稱為等溫線方程。由于固體對氣體或溶液的吸附現象十分復雜，等溫線形狀多種多樣，有些還無合適方程來描述，在色譜領域常用的等溫線方程主要有三種。 Freundlich方程nKPmX1nKCmCs1CmnKCslg1lglg18.2.4 分布等溫線方程分布等溫線方程.Langmuir方程 . BET(Bnunaure-Emmett-Teller)方程PKPKKCsmX.1.121) 1(1)(.002PPCPPCPKCsmX0220) 1(1)(CPKPCCKPPCsP18.2.5色譜流動相流速色譜流動相

8、流速流動相的流速通常有兩種度量方式：1. 體積流速：以Fc表示，為單位時間流過色譜柱的平均體積表示，單位一般為mLmin-1。 2. 線速度：以u表示，定義為單位時間內流動相流經色譜柱的長度，也可稱為速率，單位是cmmin-1、mmmin-1或mms-1。 MtLu 18.2.6. 色譜圖色譜圖 色譜柱內分離的樣品各組分依次進入柱后檢測器產生檢測信號，其響應信號大小對時間或流動相流出體積的關系曲線稱為色譜圖。 18.2.6. 色譜圖色譜圖色譜圖上的信息：1. 說明樣品是否是單一純化合物。 2. 說明色譜柱效和分離情況。3. 提供各組分保留時間等色譜定性資料和數據。4. 給出各組分色譜峰高、峰面

9、積等定量依據或按不同定量方法計算出的定量數據。 術語：基線、色譜峰高、色譜峰區(qū)域寬度、標準差 、半峰高寬度、色譜峰底寬、色譜峰面積。18.2.7. 保留值保留值 保留值(retention)是樣品各組分，即溶質在色譜柱或色譜體系中保留行為的度量，反映溶質與色譜固定相作用力類型和大小，與兩者分子結構有關。.比移值 溶質通過色譜柱的平均線速度u與流動相平均線速度ux之比，以Rf 表示。 smmxfnnnuuR18.2.7. 保留值保留值.保留體積 死時間內流經色譜柱的流動相的體積稱為死體積VM，即等于色譜柱內流動相體積。 保留時間內流經色譜柱的流動相體積，稱為保留體

10、積，以VR表示。調整保留時間內流經色譜柱的流動相體積，稱為調整保留體積VR。VR = tR FCVR =tRFC =( tR - tM) FC = VR - VM CMMFtV18.2.7. 保留值保留值.保留因子(retention factor) 溶質分布在固定相和流動相的分子數或物質的量之比，以k(或k)表示(無因次) 。 MSMMSSmsVVKVCVCnnkMRMMRMRtttttttk,1kRf11)1 ()1 (MSMMXMRVVKtktuutt)1 (RMSMMRVVKVVkVV18.2.7. 保留值保留值.相對保留值 相對保留值用以表述兩組分或組

11、分間保留差異，亦稱為選擇性因子(selectivity factor)，它反映不同溶質與固定相作用力的差異。 ,1,21212ttkkKK18.2.7. 保留值保留值.保留指數 基于色譜保留值與分子結構關系，Kovats E提出以正構烷烴系列H(CH2)nH作為測定相對保留值的統(tǒng)一標準，并定義正構烷烴的保留指數為100n，如正辛烷保留指數為800，則欲測定某化合物(x)的保留指數以適當碳數正構烷烴的保留值表示。 )()1()()(lglglglgnRnRnRXRttttnXlglg100lglglglg100100), 1(),()()1()()(nnnXnRnRnRXRRnt

12、ttnXI)lglg(100)lglglglg(100),(),()()()()(NnNnXNnNNXRnNRRRRnNI18.2.8.色譜柱結構特性參數色譜柱結構特性參數評價色譜柱的優(yōu)、劣一般根據兩類指標：一是色譜柱性能指標：單位柱長的理論塔板數、特定兩組分或物質對的選擇性因子等二是色譜柱結構特性參數：色譜柱的總孔隙度、滲透性等，這直接關系到色譜儀器操作的流動相柱前壓、分析速度等。 18.2.8.色譜柱結構特性參數色譜柱結構特性參數.色譜柱總孔隙度 柱橫截面上流動相所占的分數，即色譜柱內流動相體積與柱總體積之比： .滲透率與阻抗因子 udFLdtFVVVVVC

13、CCMCCMCPiT2244PdLFVtFPLuKKCCCMCTTf20420PdPLuK22202LtPdLuPdKdMPPP18.3. 溶質分布譜帶展寬溶質分布譜帶展寬-色譜動力學基礎理論色譜動力學基礎理論18.3.1. 色譜過程的理論處理類型 色譜過程的理論處理方法可根據分布等溫線呈線性或非線性；色譜過程是理想或非理想狀態(tài)分為不同類型。 所謂理想色譜過程指溶質在兩相間物質交換在熱力學上可逆，傳質速率很高，平衡瞬間實現，分子擴散可以忽略;非理想色譜這些假設都不成立。 線性理想色譜；線性非理想色譜；非線性理想色譜；非線性非理想色譜.溶質在色譜柱內分布平衡和遷移過程溶質在色譜柱

14、內分布平衡和遷移過程 .色譜流出曲線方程色譜流出曲線方程 實際色譜柱N值很大，為103106，因而洗出曲線一般趨近正態(tài)分市，可近似地用正態(tài)分布函數描述溶質分布，除以流動相體積，即可導出濃度變化方程: 當V = VR = nmaxVm，洗出色譜峰，此時溶質最大濃度Cmax,其流動相體積為VR，即為溶質保留體積： RVVVNVMeNCRR/22221RVMNC/221max22maxRVVRVNeCC22maxRttRtNeCC.理論塔板的計算公式理論塔板的計算公式 令VR V= V，當洗出溶質濃度C為最大濃度Cmax一半，即Cmax / C= 2時，V用V1/2表

15、示： 2)2/1(2max2/RVVNeCC22/122/122/1254. 5254. 522ln8ttVVVVNRRR216WtNRNLH .理論塔板的計算公式理論塔板的計算公式 為了扣除死時間的影響=，引入以調整保留時間tR計算的有效理論塔板數Neff和有效理論塔板高Heff的作為柱效指標。 22/122/122/1216254. 5254. 5tttttttNRRMReffeffeffNLHeffNkkN21 effHkkH2. 塔板理論的成就和局限塔板理論的成就和局限 塔板理論中的理論塔板數和板高按在色譜柱效評價中具有重要實用價值。 然而，色譜是一個

16、動態(tài)過程，區(qū)別于萃取、精餾等分級過程，不可能實現溶質在兩相間真正分布平衡；忽略擴散、傳質、瞬間實現平衡的假設也不符合色譜過程分子運動規(guī)律。 塔板理論不能說明為何理論塔板數隨流動相流速變化；色譜過程中溶質分子分布離散的原因；也未能深入探討色譜柱結構、操作條件等對理論塔板數或塔板高度的影響，因而對色譜柱制備、操作條件優(yōu)化等色譜實踐的指導作用有限，而這正是色譜理論進一步發(fā)展的內在推動力。 18.3.3. 速率理論速率理論.塔板高度的統(tǒng)計意義以標準差2 作為分子在色譜柱內離散的度量，總的分子離散度應為單位柱長離散度之和，且與柱長呈正比，即2 = HL。比例因子H=2/L，等于各獨立分子

17、離散因素之和：niiiiHHHHHLLLL. 速率理論方程速率理論方程 uCmCsuBACuuBAH)(/)11(/uCAuCuBHms/AuCuBHsuCAAm11.氣相色譜速率理論方程氣相色譜速率理論方程1.渦流擴散項(A) 流動相攜帶溶質分子沿柱內各路徑形成紊亂的渦流運動，有些分子沿較窄而直的路徑以較快的速度通過色譜柱，發(fā)生分子運動超前; 而另一些分子沿較寬或彎曲的路徑以較慢的速度通過色譜柱，發(fā)生分子運動滯后，導致色譜區(qū)帶展寬，可以下式表示：pdA.氣相色譜速率理論方程氣相色譜速率理論方程2. 縱向擴散項(B/

18、u) 亦稱為分子擴散。濃差擴散是分子自發(fā)運動過程。3.傳質項(Cu) 色譜分離過程溶質在流動相和固定相之間進行質量傳遞。uDuBm/2/sfSfSSDdkkqDdkfC222.)1 () (uDdkkuDdkkuDdHsfmPmP.)1 (.8.)1 (01. 02222222. 液相色譜速率理論方程液相色譜速率理論方程 高效液相色譜與氣相色譜速率理論方程的主要區(qū)別要歸因于液體與氣體性質差異。 uDdkkuDdkkquDduDduCuCuCuBAHHHHHHmPiisfmPmPsmsmsmsmde.)1)(1 (30)1 (.)1 (.2222222. 影響

19、柱效的變量影響柱效的變量1.流動相流速(u) )/(smoptCCBu)(2minsmCCBAH. 影響柱效的變量影響柱效的變量2.填料粒徑(dP) 渦流擴散A隨dP線性下降。 3. 色譜柱溫 溫度影響擴散系數Ds和Dm，從而影響分子擴散和傳質速率。 . 折合參數板高方程折合參數板高方程 為了在同一基礎上比較不同填料粒徑、不同色譜方法柱性能和解釋分離條件對柱效影響，Giddings首先提出用填料粒徑(dp)為單位，作為歸一化度量板高(H)、流動相線速(u)、柱長(L)等無量綱折合色譜參數。 定義折合板高h=H/dp，折合流速=u dp/Dm，折合柱長l=L/dp

20、。其中折合流速是流動相流經一顆填料的線速度與擴散速率之比。 . 折合參數板高方程折合參數板高方程 利用巳建立的h -關系，可指導最佳色譜參數選擇。如 = 3 能 獲 得 最 小 h 值 。 由3=udp/Dm=ldp2/Dm.tM，可導出最佳填料粒徑關系式:ltDdMmp/318.4. 組分分離組分分離-基本分離方程基本分離方程18.4.1. 分離度 分離度(Resolution)定義為相鄰兩組分色譜峰保留值tR2，tR1之差與兩峰底W2，W1平均寬度之比，以R表示。 )()(2)(2/112121212WWttWWttRRRRR當R = 1，兩色譜峰交疊約4%，可稱為基本分離

21、。當R = 1.5，兩色譜峰交疊約0.3%，可視為完全分離。 18.4.2. 分離方程分離方程當相鄰峰保留值相近時，近似地W1 = W2 = W，并按分離度與理論塔板數N的平方根呈正比。分離某”物質對”達到一定分離度需要的理論塔板數和柱長為：RtNW421214421212kkkNtttNWttRRRRRR22114kkNR222221116kkRN18.4.3分離速度及影響因素分離速度及影響因素 在考慮組分分離時，另一個密切相關的因素是實現分離所需時間，既分離速度。完成分離所需時間決定于遷移速率較慢的組分，既組分2的遷移線速度u2。18.4.4. 色譜柱峰容量 一定色譜操作條件下，色譜柱在一

22、定時間能容納達到一定分離度(R1)色譜峰的數量。 峰容量與樣品容量有一定差別，后者指正常色譜條件下溶質在兩相間有效分配洗出對稱色譜峰容許的最大樣品量。 uHkkRtR2232222) 1(11618.5 色譜方法選擇和分離操作條件優(yōu)化色譜方法選擇和分離操作條件優(yōu)化 通過色譜分離方程分析、初步實驗數據估算，從易至難，采取各種技術手段，實現色譜分離操作條件優(yōu)化。 18.5.1 色譜方法選擇色譜方法選擇 根據樣品物理、化學性質和分析要求選擇色譜方法。 既可用氣相色譜，亦可采用高效液相色譜分析的樣品，通常首選氣相色譜法，因為前者分析成本相對低些。 總體來看，高效液相色譜比氣相色譜適用的樣品類型、范圍或

23、應用領域要廣得多。 18.5.2 分離操作條件優(yōu)化分離操作條件優(yōu)化.提高理論塔板數1. 適當增加柱長2.提高柱效 柱效通常指單位柱長的理論塔板數N。據根板高方程，H隨流動相流速u變化。 此外，降低固定相填料粒徑dP、固定相液膜或鍵合層厚度df ;采用低相對分子質量、低粘度流動相及適當提高柱溫以改善傳質等均有利于提高柱效。12122)/(NRRN 12122)/(LRRL . 調節(jié)、控制保留因子調節(jié)、控制保留因子221kQkR22322)1 ( kkQtR.提高選擇性因子提高選擇性因子 R正比于(-1)/。 =1，R=0，兩組分不可能分離; 略大于

24、1，兩組分才可能分離; 25，分離比較容易實現。從1.01增大到5，(-1)/增加近100倍。 相比之下，k從1增大到50，k/(1+k)從0.5變化至接近于1，只增大一倍。 顯然，是影響R最敏感的因素。 保持k 在110的范圍內，提高值可采取下述措施： 1. 改變流動相組成 2. 改變柱溫 3. 改變固定相 18.6. 色譜定性分析色譜定性分析 18.6.1保留值定性 .與已知物對照定性 色譜保留值與分子結構有關，但缺乏典型的分子結構特征，因而只能鑒定已知物。 在同樣色譜條件下，用已知化合物與樣品中色譜峰對照定性；或將已知化合物加入樣品中導致某色譜峰增高定性，這是色譜基本定性

25、方法。.其他定性方法 按保留值經驗規(guī)律定性。參考文獻保留數據定性。 18.6. 色譜定性分析色譜定性分析 18.6.2選擇性檢測響應定性 色譜儀器一般配置通用型和選擇性檢測器，前者對所有化合物均有響應，后者只對某些類型化合物有響應。18.6.3 色譜-結構分析儀器聯用 結構分析儀器提供分子結構信息，可對化合物直接定性。色譜-結構分析儀器聯用，將結構分析儀器作為色譜檢測器，色譜的高分離能力與結構分析儀器的成分鑒定能力相結合，使各種色譜聯用技術成為當今最有效的復雜混合物成分分離、鑒定技術。 18.7 色譜定量分析色譜定量分析18.7.1 定量依據 根據檢測響應信號大小，測定樣品中各

26、組分的相對含量。 每個組分的量(質量或體積)與色譜檢測器的響應值呈正比，一般與峰高或峰面積響應呈正比。 色譜峰面積(A)以峰高與半峰高寬(2X1/2)相乘求出。 一般保留值小、峰寬窄且難以準確測量的組分，可按峰高定量。多數情況下按峰面積定量為宜。 18.7.2 定量方法定量方法.標準校正法或外標法 最直接的定量方法是配制一系列組成與樣品相近的標準溶液。按標準溶液色譜圖，可求出每個組分濃度或量與相應峰面積或峰高校準曲線。 在實際分析中，可采用單點校正： iiissiAfAAWW18.7.2 定量方法定量方法.內標法 選擇一個一般不存在于樣品中的合適內標化合物。 要

27、求內標物是高純化合物；與樣品中各組分很好分離，且不與組分發(fā)生化學反應；分子結構、保留值與檢測響應最好與待測組分相近。 首先需測定待測組分、內標物對某一標準物的相對定量校正因子。組分i的相對定量校正因子fi定義為組分定量校正因子與標準物定量校正因子之比。 ssiiiAWAWf/ssisisisAWAWf/isisisiiiWfAfAW%100%100%WWfAfAWWPisisisiiii%100%100%WWAfAWWPisisiiii18.7.2 定量方法定量方法.峰面積歸一化法 樣品中所有組分全部冼出，在檢測器上產生相應的色譜峰響應，同時已知其相對定量校正因子，可用歸一化法

28、測定各組分含量。 %100.%21iiiiniiifAfAWWWWWP5. 容量因子和相對保留值*容量因子（k）容量因子也叫質量分配比和容量比，是在一定溫度和壓力下，達到分配平衡時，組分在固定相和流動相中的質量（m）之比流動相流速用平均線速度u（cm/min）代替體積流速F（ml/min），組分流速為v，兩者之比為保留比（R） R=v/u，如果在長為L的色譜柱中， v=L/tR，u=L/to R = to/tR 保留比與溶質分子在流動相中的分數有關： 所以由上式和 R = to/tR， 得： tRto(1+k)或 該式叫色譜方程，表示保留時間與分配系數得關系，在色譜柱一定時，Vs和Vm一定。若

29、流速、溫度一定，則to一定，tR取決于分配系數K，K大得組分保留時間長由tRto(1+k)式得： 分離因子即相對保留值（a） 為兩組分的靜保留值之比 a= k2/k1=tR2/tR1 代表了兩個物質在相同色譜條件下的分離選擇性，物質的化學性質和結構上的差異，在其與固定相和流動相之間的作用力差別也有體現6.分辨率（R）（分離度） 兩組分色譜峰的最高點之間的距離（表示為兩個保留時間之差）和兩個譜帶寬度（W）的算術平均值之比 由于a=tR2/tR1 則有， N-理論塔板數，H-塔板高，Neff-有效塔板數色譜中的名詞 固定相，載體，分離介質，流動相，色譜圖，色譜峰，基線，峰寬，峰面積，峰高，保留時間

30、，保留體積，流動相流速，信號響應，拖尾，對稱峰，肩峰，重疊，柱長，塔板高度，理論塔板數，有效塔板書數，容量因子，分辨率，分離度，內標法。外標法 ，六.幾種色譜法的分離機理 分配色譜 吸附色譜 離子交換色譜 空間排阻色譜 對離子色譜 毛細管電色譜1.分配色譜 基于樣品組分在固定液（涂在載體上的液相）和流動相之間的分配進行分離。類似液-萃取分離液 氣-液分配色譜 ，GC 液-液分配色譜，硅膠S1100+3，3-二羥基丙晴，流動相正己烷 正相分配色譜和反相分配色譜2.吸附色譜 利用被分離組分對固定相表面吸附中心吸附能力的差別實現分離 固定相為吸附劑，多孔型微粒狀物質，具有較大比表面積，表面有許多吸附中心，硅膠表面的吸附中心為硅羥基 流動相的洗脫能力主要由其極性決定，強極性流動相占據吸附中心的能力強，洗脫能力也強，使組分的保留值小， 流動相的洗脫能力用Snyder提出的溶劑強度定量表示正戊烷0.00，氯仿0.26，乙醚0.43，乙睛0.52，甲醇0.70 氣-固吸附色譜