蛋白質(zhì)的提取與檢測(cè)

1、蛋白質(zhì)的提取與檢測(cè)第一節(jié) 細(xì)胞總蛋白的提取及含量測(cè)定【基本原理】蛋白質(zhì)含量測(cè)定法是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四種經(jīng)典的方法，即定氮法、雙縮脲法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有兩種近年普遍使用起來(lái)的測(cè)定法，即考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）與二辛可寧酸法（BCA法）。值得注意的是，上述方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這幾種方法測(cè)定有可能得出不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是完美無(wú)缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質(zhì)的性質(zhì)；溶液中存在的干擾物質(zhì)；測(cè)定

2、所要花費(fèi)的時(shí)間。Lowry法：蛋白質(zhì)與堿性銅溶液中的二價(jià)銅離子絡(luò)和使得肽鍵伸展，從而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在堿性銅條件下與磷鉬鎢酸反應(yīng)并產(chǎn)生深藍(lán)色，在750nm有最大光吸收值。在一定濃度范圍內(nèi)，反應(yīng)液顏色的深淺與蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各種蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測(cè)定時(shí)需使用同種蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)。Bradford法：蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合，使得染料最大吸收峰從465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋白量成正比，測(cè)定595nm處吸光度的增加即可進(jìn)行蛋白定量。BCA（Bic

3、inchoninic acid）法：二價(jià)銅離子在堿性的條件下，可以被蛋白質(zhì)還原成一價(jià)銅離子（Biuret reaction）并與BCA相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個(gè)銅離子，形成紫色的反應(yīng)復(fù)合物。該水溶性的復(fù)合物在562nm處顯示強(qiáng)烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度?！驹噭┡渲啤?. 1.74mg/ml（10mmol/L）PMSF：0.174g PMSF溶解于100ml異丙醇，分裝于1.5ml離心管中，-20保存。2. 細(xì)胞裂解液：50mM Tris-HCl（pH 7.4），150mM NaCl，1mM PMSF，1mM E

4、DTA，1% Triton X-100，4保存。3. 100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）：BSA 0.1g，0.15mol/L NaCl 1ml，充分溶解后-20保存。4. 0.15mol/L NaCl：0.877g NaCl溶解于100ml去離子水，高溫滅菌后室溫保存。5. 考馬斯亮藍(lán)G250溶液：考馬斯亮藍(lán)G250 100mg，95%乙醇 50ml，磷酸 100ml，加去離子水至1L。先用乙醇溶解考馬斯亮藍(lán)染料，再加入磷酸和去離子水，混勻后濾紙過(guò)濾，4保存。6. PBS緩沖液（pH 7.4）：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO412H2O 3.63g，KH2PO4 0.2

5、4g，溶解于900ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至7.4，加去離子水定容至1L，常溫保存?zhèn)溆??！静僮鞑襟E】一、細(xì)胞總蛋白的提取1. 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231與食道癌細(xì)胞系EC109于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。2. 去除培養(yǎng)液后以預(yù)冷的PBS沖洗23遍。3. 加入適量的預(yù)冷的裂解液后置于冰上2030 min，不時(shí)搖動(dòng)。4. 用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)，轉(zhuǎn)移將細(xì)胞碎片和裂解液至預(yù)冷的1.5ml離心管中；。 5. 4、12 000 rpm離心15min。 6. 將上清分裝至1.5ml的EP管中，-20凍存?zhèn)溆谩?二、 蛋白含量測(cè)定

6、（BCA法）（碧云天P0012）1. 根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。2. 完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10uL稀釋至100uL，使終濃度為0.5mg/ml。蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。3. 將標(biāo)準(zhǔn)品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20uL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的溶液補(bǔ)足到20uL。4. 加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，加用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的溶液（PBS）到20uL。每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)。

7、5. 各孔加入200uLBCA工作液，37放置30分鐘。也可以室溫放置2小時(shí)，或60放置30分鐘。BCA法測(cè)定蛋白濃度時(shí)，吸光度會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加深。并且顯色反應(yīng)會(huì)因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或延長(zhǎng)孵育時(shí)間。6.酶標(biāo)儀測(cè)定A562，540-595nm之間的波長(zhǎng)也可接受。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。標(biāo)準(zhǔn)品OD值標(biāo)準(zhǔn)品濃度ug/uL0.07800.0990.0250.1180.050.1540.10.2130.20.2830.30.3290.40.4040.5第二節(jié) SDS-PAGE電泳【基本原理】SDS-PAGE電泳技術(shù)（SDS polyacrylamede gel

8、electrophoresis）首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn進(jìn)一步完善。當(dāng)在樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS后，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，其它因素可以忽略不計(jì)。SDS是一種陰離子去污劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其它物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵（氫鍵和疏水鍵）。在強(qiáng)還原劑如巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）的存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被打開(kāi)并解聚成多肽鏈。解聚后的蛋白質(zhì)分子或其亞基與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，復(fù)合物所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，這就消除了不同蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異

9、，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在溶液中的形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒。橢圓棒的短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物基本上是相同的，但長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與蛋白質(zhì)分子量的大小成正比，因此這種復(fù)合物在SDS-PAGE系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度即蛋白質(zhì)分子量的大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15200kD之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。因此，SDS-PAGE不僅可以分離鑒定蛋白質(zhì)，而且可以根據(jù)遷移率大小測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量?！驹噭┡渲啤?. 10%SDS：10g SDS加入100ml去離子水中，50水浴下溶解，室溫保存。2. 1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）：Tr

10、is-base 45.43g，加入200ml去離子水溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至8.8，加去離子水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。3. 1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）：Tris-base 30.29g，加入200ml去離子溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8，加去離子水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。4. 電泳緩沖液：Tris-base 3.03g，Glycine 18.77g，SDS 1g，加入適量去離子水溶解后定容至1L，室溫保存。5. 5×Loading buffer：50%甘油，250 mM Tris-HCl（pH6.8），10% -巰基乙醇，2.5溴

11、酚藍(lán)，10% SDS?；靹蚝?，分裝于1.5ml離心管中，4保存。6. 10%過(guò)硫酸胺（AP）：0.1g過(guò)硫酸胺溶解于1.0ml去離子水，4保存，保存時(shí)間為2周。7. 四甲基乙二胺（TEMED）：分裝少量原液于棕色瓶，4避光保存。8. 30% Acr/Bic（37.5:1）：丙烯酰胺（Acr）29.2g，甲叉雙丙烯酰胺（Bic）0.8g，加入適量去離子水于37下充分溶解并定容至100ml，4保存。注意：Acr/Bic均具有毒性，易吸附和積累，應(yīng)戴手套進(jìn)行操作。9. 凝膠脫色液：500ml乙醇，100ml冰醋酸，加去離子水定容至1L，室溫保存。10. 考馬斯亮藍(lán)G250蛋白染色液：0.1g考馬斯亮

12、藍(lán)G250溶解于100ml脫色液中，混勻后濾紙過(guò)濾去除顆粒性物質(zhì)，置于棕色瓶中室溫保存。11. 凝膠保存液：450ml脫色液中加入50ml甘油，混勻后室溫保存。12. SDS-PAGE濃縮膠（5% Acrylamide）配方：13. 分離膠配方【操作步驟】一、凝膠的配制與電泳（1）凝膠配制與上樣1. 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。 2. 配制10%濃度的分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生，待灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。3. 膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干

13、。 4. 配制5%濃度的濃縮膠，將剩余空間灌滿后立即將梳子插入濃縮膠中；插梳子時(shí)要使梳子保持水平，濃縮膠凝固的過(guò)程中要補(bǔ)膠12次。5. 待到濃縮膠凝固后，豎直向上輕輕拔出梳子，用水沖洗一下濃縮膠，將其放入加有電泳緩沖液的電泳槽中。 6. 取出含50g蛋白樣品與5×Loading buffer按比例充分混合，煮沸5min。7. 加足夠的電泳液后用微量加樣器貼壁上樣，注意不要吸進(jìn)氣泡。（2）電泳1. 以初始電壓為80V進(jìn)行電泳, 30min，樣品進(jìn)入分離膠后改為120150V。2. 在溴酚蘭泳動(dòng)至距膠下緣約1cm時(shí)即可終止電泳（目的蛋白條帶一般跑過(guò)分離膠的1/3，可根據(jù)預(yù)染蛋白Marke

14、r調(diào)整電泳時(shí)間）。二、考馬斯亮藍(lán)染色1. 電泳后的凝膠于染色液中振蕩染色4h或40染色1h，然后用蒸餾水將凝膠淋洗一次。2. 多次變換脫色液直至凝膠背景脫凈為止，為加快脫色，可略加溫度。3. 凝膠保存：脫去背景色的凝膠在保存液中浸泡30min，然后將凝膠放在玻璃板上，用保存液浸濕玻璃紙包住凝膠在室溫下干燥即可。第三節(jié) 免疫印跡（Western Blot）【基本原理】Western Blot中文一般稱為蛋白質(zhì)免疫印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的

15、細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。Western Blot與Southern印跡雜交或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素/NC膜或聚偏二氟乙烯/PVDF膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色、化學(xué)發(fā)光或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)

16、蛋白水平的表達(dá)?！驹噭┡渲啤?. 電轉(zhuǎn)液：Tris-base 5.8g，Glycine 2.9g，SDS 0.37g，甲醇200 ml，去離子水定容至1L，室溫保存。2. TBS：20mM Tris-HCl （pH7.4），150mM NaCl，室溫保存；3. TBST：即含0.05% Tween20的TBS緩沖液。4. 封閉液與抗體稀釋液：均為含5%脫脂奶粉的TBST，溶解后4保存?！静僮鞑襟E】一、 轉(zhuǎn)膜1. 將PVDF膜在甲醇中浸泡3min，完全浸濕后置于入轉(zhuǎn)膜液中。2. 將膠平鋪于海綿上，按圖示順序鋪上膜與每側(cè)12張濾紙，注意用玻璃棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過(guò)多部分。從負(fù)極（黑色板）依次

17、鋪海綿-濾紙（3層）-膠-PVDF膜-濾紙（3層）。3. 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，要使夾子的黑面對(duì)轉(zhuǎn)移槽的黑面，夾的白面對(duì)紅面。4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰水混合物中，300mA， 1.5h(同時(shí)放入冰袋，外面包冰)。 5. 以預(yù)染蛋白Marker觀察轉(zhuǎn)移效果。注意： 轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套； 整個(gè)操作均在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡； 膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路；注意轉(zhuǎn)膜時(shí)電極方向是“膜正膠負(fù)”。二、免疫反應(yīng) 1. 封閉：將PVDF膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與TBST稍加漂洗，浸沒(méi)于封閉液(脫脂奶粉5%)中緩慢搖蕩2h。傳統(tǒng)上有兩種封閉液：脫脂奶粉或BSA，脫脂奶粉成本低但不能用

18、于磷酸化蛋白（因脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白），使用脫脂奶粉會(huì)結(jié)合磷酸化抗體從而易產(chǎn)生高背景。某些抗體用BSA封閉時(shí)因不明原因可能會(huì)產(chǎn)生比脫脂奶粉更強(qiáng)的信號(hào)。2. 結(jié)合一抗：將-Actin一抗（兔抗人、鼠）用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度（1：2000），室溫下作用2h或4過(guò)夜。3. 洗滌：TBST漂洗PVDF膜后再浸洗三次，每次510 min。4. 結(jié)合二抗：按適當(dāng)比例（1：5000）稀釋HRP標(biāo)記的二抗（羊抗兔），室溫作用2h。5. 洗滌：TBST漂洗膜后再浸洗2次，每次510 min。二、 DAB顯色（按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作）二氨基聯(lián)苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）是過(guò)氧化物酶HRP（Peroxidase）的生色底物，在過(guò)氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成棕褐色不溶性產(chǎn)物。用于檢測(cè)過(guò)氧化物酶的活性，靈敏度高，特異性好。其適用于蛋白質(zhì)雜交和免疫化學(xué)，以及原位雜交染色等。將配好的DAB直接滴加在目的片段位置，避光顯色至蛋白目的條帶明顯出現(xiàn)。將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。 發(fā)光鑒定Western blot檢測(cè)系統(tǒng)中常用交聯(lián)酶兩大家族就是辣根過(guò)氧化物酶HRP-ECL或堿性磷酸