無菌知識培訓(xùn)

1、無菌知識一.無菌相關(guān)的概念1.無菌：是指物體或任一介質(zhì)中沒有活的微生 物的存在，即無論用何種方法，檢不出活的微生物。2.無菌操作：指在操作中，采用或控制一定的條件，盡量避免產(chǎn)品污染微生物的一種操作方法程序。為此目的，所用的一切物料環(huán)境，均應(yīng)事先滅菌，操作也應(yīng)在無菌操作室中進行。3.無菌觀念：指在無菌操作時，避免污染任何微生物?！盁o菌”從定義上來說是一個絕對的概念，但遺憾的是，科學(xué)和計數(shù)高度發(fā)展的今天，藥品的絕對無菌即做不到，也無法加以證實。然而，無菌制劑的安全性要求人們設(shè)定無菌的相對標準。FDA、歐洲制藥工業(yè)界曾將百分之一微生物污染率作為美軍產(chǎn)品“無菌”的相對標準，它和蒸汽滅菌后產(chǎn)品中微生物存

2、活的概率為10-6（即產(chǎn)品的無菌保證值為6），系同一標準的不同表示法。這一標準于1980起收錄于USP中，如今已為世界各國普遍接受和采用。二、細胞培養(yǎng)污染與檢測 細胞污染的種類可分成細菌、真菌、支原體和病毒。 無菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細胞等是主要的污染源。 嚴格的無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好的細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的最好方法。細胞培養(yǎng)過程中的主要細胞污染有：1、細菌污染2、真菌污染3、支原體污染4、病毒污染5、黑膠蟲污染（1）什么是細菌：細菌是一類細胞細短、結(jié)構(gòu)簡單、胞壁堅韌、多以二分裂方式繁殖和水生性較強的原核生物。（2）細菌分類：可根據(jù)形狀分為三

3、類，即：球菌、桿菌和螺旋菌（包括弧菌、螺菌、螺桿菌）。按細菌的生活方式來分類，分為兩大類：自養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌，其中異養(yǎng)菌包括腐生菌和寄生菌。按細菌對氧氣的需求來分類，可分為需氧（完全需氧和微需氧）和厭氧（不完全厭氧、有氧耐受和完全厭氧）細菌。按細菌生存溫度分類，可分為喜冷、常溫和喜高溫三類。 也可經(jīng)革蘭氏染色法染色將細菌分為兩大類：一類最終染成紫色，稱為革蘭氏陽性細菌（G+），另一類被染成紅色，稱為革蘭氏陰性細菌（G-）1、細菌污染（3）生存條件：凡在溫暖、潮濕和富含有機物質(zhì)的地方，都有各種細菌活動之處。所需條件有： 溫度 ：在一定溫度范圍內(nèi)，細菌的代謝活動和生長繁殖隨著溫度的上升而加快。當溫度升

4、高到一定限度，開始產(chǎn)生不良影響時，如果溫度繼續(xù)升高，細菌的細胞功能就會受到破壞，以致造成死亡。0停止生長，在-20不會死亡 。 空氣濕度：65%75% 水分和空氣相對濕度：一般適合食用菌菌絲生長的培養(yǎng)料含水量在60左右。 空氣：微量的CO2濃度(0.0340.1) 光照：光照強度為2501000 Lux 5 pH值：喜偏酸性環(huán)境，菌絲生長的pH值在36.5之間，最適pH值為5.05.5。大部分細菌在pH值大于7.0時生長受阻，大于8.0時生長停止。（4）細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，最常見的細菌污染主要有枯草桿菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌，白色葡萄球菌也較常見。（5）細菌污染后，培養(yǎng)液p

5、H改變，培養(yǎng)液變得明顯混濁，也有的對培養(yǎng)液無肉眼可見影響，只在鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌體時才知已污染，應(yīng)仔細觀察。2、真菌污染（1）什么是真菌：真菌是具有真核和細胞壁的異養(yǎng)生物，具有葉綠體但是無葉綠素不能進行光合作用，具有發(fā)達的菌絲體，異樣吸收營養(yǎng)，以產(chǎn)生大量無性和（或）有性孢子的方式進行繁殖。大多數(shù)真菌生長很快，而只有占少數(shù)的致病性真菌生長較慢。（2）常見的主要有酵母菌、霉菌、煙曲霉、黑曲霉、孢子菌、白色念珠菌等（3）生存條件 真菌的生長和繁殖受許多理化因素的影響 溫度是最能影響真菌生長繁殖的因素。一般能容許真菌生長的最低溫度為0-5，最高為40-45，最適宜淺部真菌生長的溫度為22-28，最適宜深部

6、真菌生長的溫度為37。 真菌的生長繁殖需要一定的濕度，一般真菌在中等濕度時生長較好。 真菌略偏嗜酸性，在PH5-7之間生長最好。 絕大多數(shù)真菌生長時需要氧氣，但需氧量不等。高壓氧能抑制真菌生長，但不會至死。在氧供應(yīng)減少時真菌生長緩慢。二氧化碳對皮膚癬菌生長不利，但在一定條件下能刺激某些真菌的孢子形成。 真菌的生長需要營養(yǎng)成分，碳、氮、某些維生素和某些微量元素都是真菌生長所不可缺少的。（4）真菌污染在細胞培養(yǎng)中較常見。真菌種類繁多，形態(tài)各異，但污染后易發(fā)現(xiàn)，肉眼可見培養(yǎng)基中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的呈散在生長，但培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁。倒置顯微鏡下觀察可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯于細胞

7、之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。3、支原體污染（1）什么是支原體：又稱霉形體，是一類無細胞壁、介于獨立生活和細胞內(nèi)寄生生活的最小型原核生物（2）繁殖方式多樣，主要為二分裂繁殖，還有斷裂、分枝、出芽等方式，蓋因缺乏細胞壁造成分支原體標本裂時二個子細胞大小均所致。同時，支原體分裂和其DNA復(fù)制不同步，可形成多核長絲體。（3）生產(chǎn)條件：營養(yǎng)要求比一般細菌高，除基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)外還需加入1020%人或動物血清以提供支原體所需的膽固醇。最適pH7.88.0之間，低于7.0則死亡。 大多數(shù)兼性厭氧，有些菌株在初分離時加入5%CO2生長更好。生長緩慢，在瓊脂含量較少的固體培養(yǎng)基上孵育23天出現(xiàn)典型的“荷包蛋樣”

8、菌落：圓形（直徑1016um），核心部分較厚，向下長入培養(yǎng)基，周邊為一層薄的透明顆粒區(qū)。（4）支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2m，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細胞壁，中央有電子密度大的密集顆?；蚪z狀的中心囊。（5）培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。4、病毒污染（1）什么是病毒是一種具有細胞感染性的亞顯微粒子，它實際上就是由一個保

9、護性的外殼包裹的一段DNA或者RNA，能以感染態(tài)和非感染態(tài)兩種狀態(tài)存在。（2）在宿主體內(nèi)時呈感染態(tài)（體細胞內(nèi)專性寄生），依賴宿主的代謝系統(tǒng)獲取能量、合成蛋白質(zhì)和復(fù)制核酸，然后通過核酸與蛋白質(zhì)的裝配而實現(xiàn)其大量繁殖；在離體條件下，不能繁殖，但是它們能以無生命的生物大分子狀態(tài)長期存在，并可保持其侵染活性。（3）細胞對病毒感染的反應(yīng)有4種：無明顯反應(yīng)、細胞死亡、細胞增生后死亡和細胞轉(zhuǎn)化5、黑膠蟲（1）黑膠蟲概況： 在細胞培養(yǎng)的時候，有時會在400倍顯微鏡下看到小黑點在動，小黑點有時呈點狀，有時呈小的片狀，運動形式為在原地振動（類似布朗運動），這種小黑點既不是細菌、霉菌，也不是支原體， 目前業(yè)內(nèi)人士稱

10、其為“黑膠蟲”。（2）黑膠蟲一般是存在血清里的，它會不斷增多，達到一定數(shù)量時會與細胞競爭性生長，與細胞競爭培養(yǎng)基中的營養(yǎng)，從而使得細胞營養(yǎng)不足而死亡。（3）可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液不渾濁。黑膠蟲”可寄生于動物細胞，也可以生存于培養(yǎng)基中，依靠細胞和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)為生，并隨細胞傳代而傳代，是一種異養(yǎng)生物。（4）鏡下觀察細胞生長狀態(tài)良好，觀測到的運動物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養(yǎng)的細胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對細胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。6、污染的預(yù)防預(yù)防是防止細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的最好辦法。一般預(yù)防可從以下幾方面著手:（1）從實驗室、物品、用品消毒滅菌著手;（2）從操作者做起，操作者責任心要強，要細心穩(wěn)重，操 作技術(shù)要熟練;（3）防止細胞交叉污染;（4）所有細胞一旦購置或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之，重新復(fù)蘇培養(yǎng)。7、污染的清除抗生素處理：預(yù)防和殺滅細菌的