乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查

1、乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查報(bào)告人：付紅偉報(bào)告人：付紅偉天津醫(yī)大總醫(yī)院天津醫(yī)大總醫(yī)院檢驗(yàn)中心檢驗(yàn)中心2011.1.212011.1.21我國(guó)我國(guó)HBVHBV感染概況感染概況一般人群HBsAg攜帶率高達(dá)7.18%；現(xiàn)有慢性HBV感染者約9 300萬(wàn)人，占全世界的1/4；其中慢性乙型病毒性肝炎患者超過(guò) 2 000萬(wàn)例，占全世界慢性乙肝患者的1/3；15歲以下兒童HBsAg攜帶率下降顯著，1-4歲組僅為0.96%；1 4歲組HBsAb陽(yáng)性率由1992年15.75%升至72.25%; 抗HBcAb陽(yáng)性率由1992年30.08%降至3.76%；2HBVHBV基因組基因組HBV D

2、NAHBV DNA是由是由長(zhǎng)鏈長(zhǎng)鏈L (L (負(fù)鏈負(fù)鏈) ) 和和短鏈短鏈S (S (正鏈正鏈) ) 組成的不完全雙鏈環(huán)狀組成的不完全雙鏈環(huán)狀DNADNA，短鏈的長(zhǎng)度相當(dāng)于長(zhǎng)鏈的，短鏈的長(zhǎng)度相當(dāng)于長(zhǎng)鏈的50%50%85%85%。 HBV DNAHBV DNA長(zhǎng)鏈載有病毒蛋長(zhǎng)鏈載有病毒蛋白質(zhì)的全部密碼，有白質(zhì)的全部密碼，有4 4個(gè)開放讀碼個(gè)開放讀碼框架框架(ORF)(ORF)，分別稱為，分別稱為S S、C C、P P和和X X區(qū)區(qū) 。編碼。編碼7 7個(gè)蛋白質(zhì)。個(gè)蛋白質(zhì)。HBV DNAHBV DNA易發(fā)生變異，特別是前易發(fā)生變異，特別是前S S或或S S區(qū)基因較易突變。區(qū)基因較易突變。嗜肝嗜肝DN

3、A病毒的共同特點(diǎn)：病毒的共同特點(diǎn)：內(nèi)含33.3kb松散環(huán)狀、部分雙鏈DNA基因組及DNA聚合酶；病毒的復(fù)制需逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。3原原表面抗原表面抗原(HBsAg)(HBsAg)：HBVHBV外膜糖蛋白外膜糖蛋白=S+L+M=S+L+M蛋白蛋白 S S蛋白：狹義的蛋白：狹義的HBsAgHBsAg指指S S蛋白。蛋白。 HBsAg HBsAg陽(yáng)性說(shuō)明機(jī)體有陽(yáng)性說(shuō)明機(jī)體有HBVHBV感染。感染。 中分子蛋白：中分子蛋白：preS2+SpreS2+S 大分子蛋白：大分子蛋白：preS1+preS2+SpreS1+preS2+SS蛋白蛋白中分子蛋白中分子蛋白大分子蛋白大分子蛋白PreS1PreS1PreS2P

4、reS2S S1.HBsAg1.HBsAg和抗和抗-HBs-HBse e抗原抗原(HBeAg)(HBeAg)：是可溶性蛋白質(zhì)是可溶性蛋白質(zhì)只存在于血液中只存在于血液中是病毒復(fù)制和傳染性的標(biāo)志是病毒復(fù)制和傳染性的標(biāo)志e e抗體抗體( (抗抗-HBe)-HBe)：對(duì)對(duì)HBVHBV感染有一定的保護(hù)作用感染有一定的保護(hù)作用其出現(xiàn)標(biāo)志著病毒復(fù)制減少、其出現(xiàn)標(biāo)志著病毒復(fù)制減少、傳染性降低傳染性降低前前C區(qū)區(qū)C區(qū)區(qū)前前C / C 蛋白蛋白HBeAgHBcAg表達(dá)表達(dá)切割、加工切割、加工HBeAg只存在于血清中只存在于血清中HBV C基因基因分泌到細(xì)胞外分泌到細(xì)胞外2. HBeAg 2. HBeAg 和抗和抗

5、-HBe-HBe5HBV HBV 的三種形態(tài)的三種形態(tài)1,Hepatitis B virion(Dane particle)2,secreted filament3,secreted sphere67HBV HBV 自然復(fù)制周期自然復(fù)制周期8生物化學(xué)檢測(cè)生物化學(xué)檢測(cè)1HBV血清標(biāo)志物的檢測(cè)血清標(biāo)志物的檢測(cè)2HBV 分子生物學(xué)診斷分子生物學(xué)診斷3HBV臨床藥物療效檢測(cè)臨床藥物療效檢測(cè)4HBVHBV感染的實(shí)驗(yàn)室檢查感染的實(shí)驗(yàn)室檢查1.1.乙型肝炎的生物化學(xué)檢測(cè)乙型肝炎的生物化學(xué)檢測(cè)主要指標(biāo)：ALT, AST, ASTm，血清白蛋白，血清膽紅素，膽堿酯酶,甲胎蛋白,凝血酶原時(shí)間(PT)及部分凝血因子

6、；9方法學(xué)的發(fā)展方法學(xué)的發(fā)展ELISAELISA：靈敏性高，成本低，適用于普通病人篩查；膠體金免疫層析法膠體金免疫層析法( (金標(biāo)法金標(biāo)法) )：簡(jiǎn)便易行，可用于急診病人快速檢測(cè)；化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)：化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)：價(jià)格昂貴，可用于HBVMs為臨界值的病人的確證；可間接反映宿主HBV的復(fù)制水平，在評(píng)價(jià)抗病毒治療的病毒學(xué)應(yīng)答、療效和判斷預(yù)后方面有重要意義。新增檢測(cè)指標(biāo)新增檢測(cè)指標(biāo)PreS1、PreS2及其相應(yīng)抗體對(duì)乙肝兩對(duì)半的新認(rèn)識(shí)對(duì)乙肝兩對(duì)半的新認(rèn)識(shí)102. HBV HBV 血清標(biāo)志物檢測(cè)血清標(biāo)志物檢測(cè)11HBVHBV血清標(biāo)志物檢測(cè)方法的成本效果分析血清標(biāo)志物檢測(cè)方法的成本效果分析(1)(

7、1)12HBVHBV血清標(biāo)志物檢測(cè)方法的成本效果分析血清標(biāo)志物檢測(cè)方法的成本效果分析(2)(2)Back13 preS1preS1preS2preS2S Ss1s1s266s266HBsAgXS基因基因“a”決定簇決定簇 G 145 R 變異，與抗變異，與抗- -HBs 的親和力降低的親和力降低S 基因變異可導(dǎo)致基因變異可導(dǎo)致隱匿性隱匿性HBV 感染感染(occult HBV infection) ，表現(xiàn)為血清，表現(xiàn)為血清HBsAg 陰性，但仍可有陰性，但仍可有HBV 低水平復(fù)低水平復(fù)制制 (血清血清HBV DNA 常常 105 copies/ml, ALT 2 ULN;HBeAg 陰性，HB

8、V DNA 載量 104 copies/ml, ALT 2 ULN;HBV DNA持續(xù)陽(yáng)性，年齡40歲，ALT大于正常上限，也可給予抗病毒治療；HBV DNA持續(xù)陽(yáng)性，年齡40歲，ALT持續(xù)正常，應(yīng)密切隨訪，動(dòng)態(tài)觀察疾病進(jìn)展，必要時(shí)行肝組織檢測(cè)，有病變證據(jù)時(shí)，可以給予抗病毒治療；23HBV HBV 感染抗病毒治療的療效評(píng)估感染抗病毒治療的療效評(píng)估治療終點(diǎn)：治療終點(diǎn)：HBV DNA 明顯下降或低于檢測(cè)下限，并伴有ALT正常；HBV DNA 水平治療開始后3個(gè)月內(nèi)持續(xù)下降1 log以上才說(shuō)明治療有效；每日0.5mg恩替卡韋治療1年時(shí), HBeAg 陽(yáng)性和陰性慢性乙型肝炎患者HBV DNA 檢測(cè)不到

9、率分別為67% 和90%, 恩替卡韋的HBeAg轉(zhuǎn)換率為21% , 與其他口服抗病毒藥相似。并不以HBeAg轉(zhuǎn)陰或HBsAg轉(zhuǎn)陰為治療終點(diǎn)或目標(biāo)。24HBV DNA HBV DNA 定量檢測(cè)試劑盒的性能對(duì)比定量檢測(cè)試劑盒的性能對(duì)比2526同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)HCV,HIV-1,衣原體，及淋病的一體化檢測(cè)衣原體，及淋病的一體化檢測(cè)Back病毒基因突變病毒基因突變疾病進(jìn)展疾病進(jìn)展臨床表現(xiàn)臨床表現(xiàn)對(duì)干擾素應(yīng)答對(duì)干擾素應(yīng)答耐藥變異耐藥變異生化學(xué)改善生化學(xué)改善HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)血清學(xué)轉(zhuǎn)換換HBV DNA清除清除急性乙型肝炎急性乙型肝炎慢性乙型肝炎慢性乙型肝炎肝硬化肝硬化 (LC)肝細(xì)胞癌肝細(xì)胞癌

10、 (HCC)27HBV基因型基因型/基因亞型基因亞型分型方法分型方法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)序列測(cè)定法序列測(cè)定法最直接，最可信，是最直接，最可信，是HBV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但繁瑣基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但繁瑣費(fèi)時(shí)而且價(jià)格昂貴，混合型檢測(cè)能力差，不適于大樣費(fèi)時(shí)而且價(jià)格昂貴，混合型檢測(cè)能力差，不適于大樣本檢測(cè)。本檢測(cè)。 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法 (PCR-RFLP)較測(cè)序法簡(jiǎn)便，適于大樣本檢測(cè)，但由于需要進(jìn)行酶較測(cè)序法簡(jiǎn)便，適于大樣本檢測(cè)，但由于需要進(jìn)行酶切，所以操作仍較為繁瑣，成本較高，并存在酶切不切，所以操作仍較為繁瑣，成本較高，并存在酶切不徹底等問(wèn)題。徹底

11、等問(wèn)題。 pre-S2單克隆抗體酶聯(lián)單克隆抗體酶聯(lián)免疫測(cè)定免疫測(cè)定 (mAbs EIA法法)簡(jiǎn)單、快速，已商品化，適于大樣本檢測(cè)，但檢測(cè)費(fèi)簡(jiǎn)單、快速，已商品化，適于大樣本檢測(cè)，但檢測(cè)費(fèi)用較高并不能有效鑒別有些混合型感染和用較高并不能有效鑒別有些混合型感染和HBsAg低表低表達(dá)及某些表位表達(dá)不充分的標(biāo)本。達(dá)及某些表位表達(dá)不充分的標(biāo)本。分子探針雜交法分子探針雜交法簡(jiǎn)單、快速，對(duì)混合型檢測(cè)非常敏感，已商品化，適簡(jiǎn)單、快速，對(duì)混合型檢測(cè)非常敏感，已商品化，適于大樣本檢測(cè)，但檢測(cè)費(fèi)用較高而且靈敏度和特異度于大樣本檢測(cè)，但檢測(cè)費(fèi)用較高而且靈敏度和特異度還有待提高。還有待提高。型特異性引物型特異性引物PCR

12、法法簡(jiǎn)單、快速，成本低，具有較高的靈敏度，適于流行簡(jiǎn)單、快速，成本低，具有較高的靈敏度，適于流行病學(xué)研究和臨床大樣本檢測(cè)。但特異度還有待提高。病學(xué)研究和臨床大樣本檢測(cè)。但特異度還有待提高。常用常用HBV基因分型方法比較基因分型方法比較28B B型型特異性特異性“引物對(duì)引物對(duì)”的特異度分析的特異度分析B型型特異性引物特異性引物HB（正義鏈）：（正義鏈）：5-ACC GTG AAC GCC CAC MGG AA-329Back4.HBV 4.HBV 臨床藥物治療監(jiān)測(cè)臨床藥物治療監(jiān)測(cè)乙肝病毒的耐藥性檢測(cè)，是精準(zhǔn)治療乙肝的關(guān)鍵！目前由于治療不夠規(guī)范，造成我國(guó)目前超過(guò)95%的乙肝患者發(fā)生耐藥、病毒變異、

13、病毒耐藥，變異檢測(cè)勢(shì)在必行！拉米夫定是第一個(gè)被批準(zhǔn)治療慢性乙型肝炎的口服抗病毒藥, 已在全世界廣泛應(yīng)用。但其耐藥發(fā)生率高, 治療1年時(shí)耐藥發(fā)生率為23%, 2年為46% , 3年為55% , 4和5年分別為65%和71% 。30耐藥耐藥-核苷核苷( (酸酸) )類似物類似物 (NA) (NA) 治療失敗最重治療失敗最重要原因要原因31拉米夫定拉米夫定LMV阿德福韋酯阿德福韋酯ADV替比夫定替比夫定LdT恩替卡韋恩替卡韋ETVHBV替諾福韋替諾福韋TDVNAs：抑制病毒復(fù)制抑制病毒復(fù)制長(zhǎng)期使用長(zhǎng)期使用耐藥變異耐藥變異臨床耐藥臨床耐藥表型耐藥表型耐藥基因耐藥基因耐藥323334 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (RT) (RT) 區(qū)某些位點(diǎn)變異與耐藥相關(guān)區(qū)某些位點(diǎn)變異與耐藥相關(guān)preS1preS1preS2preS2HBsAgHBsAgs1s