脈沖場(chǎng)凝膠電泳教學(xué)文稿

1、脈沖場(chǎng)凝膠電泳第一節(jié)第一節(jié)核酸的分離和純化核酸的分離和純化 一、一般程序一、一般程序 1、供體的核酸分離、供體的核酸分離 供體細(xì)胞培養(yǎng)供體細(xì)胞培養(yǎng) 收集收集(菌體菌體)細(xì)胞細(xì)胞 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 分離分離總總DNA 分離細(xì)胞器分離細(xì)胞器 分離分離總總RNA 分離分離細(xì)胞器細(xì)胞器DNA RNA poly(A)RNA 特異性特異性RNA 染色體染色體DNA(組建基因組文庫(kù)組建基因組文庫(kù)) 2、載體、載體DNA分離分離 載體載體DNA 感染或轉(zhuǎn)染細(xì)胞（病毒型）感染或轉(zhuǎn)染細(xì)胞（病毒型） 轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞（質(zhì)粒型）轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞（質(zhì)粒型） 分離病毒顆粒分離病毒顆粒 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、收集菌體培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、收集菌體

2、 病毒載體病毒載體DNA分離與純化分離與純化 破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA分離與純化分離與純化 3、DNA片段的分離片段的分離 DNA 限制酶切限制酶切 凝膠電泳分離凝膠電泳分離 特定特定DNA片段的回收片段的回收 4、質(zhì)量評(píng)估、質(zhì)量評(píng)估 1） 凝膠電泳凝膠電泳 2）光密度值測(cè)定）光密度值測(cè)定 3）限制酶切分析）限制酶切分析二、細(xì)胞裂解二、細(xì)胞裂解 1. 酶法：酶法： 利用某些細(xì)胞壁裂解酶使細(xì)胞變?yōu)樵|(zhì)體，然后加去垢劑利用某些細(xì)胞壁裂解酶使細(xì)胞變?yōu)樵|(zhì)體，然后加去垢劑使原生質(zhì)體裂解。使原生質(zhì)體裂解。 1) 細(xì)菌：溶菌酶細(xì)菌：溶菌酶 2) 酵母：蝸牛酶、酵母：蝸牛酶、Novozyme23

3、4、glusulase、zymolase 等等 3) 絲狀真菌：絲狀真菌：Novozyme234、溶壁酶、纖維素酶、溶壁酶、纖維素酶 4) 植物細(xì)胞：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶植物細(xì)胞：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶 酶法裂解時(shí)要注意細(xì)胞的生長(zhǎng)條件和生長(zhǎng)時(shí)間，反應(yīng)時(shí)盡可能滿酶法裂解時(shí)要注意細(xì)胞的生長(zhǎng)條件和生長(zhǎng)時(shí)間，反應(yīng)時(shí)盡可能滿足酶的最佳反應(yīng)條件。足酶的最佳反應(yīng)條件。 2. 機(jī)械法機(jī)械法 1) 壓力剪切法：壓力剪切法：French壓力機(jī)，酵母細(xì)胞，細(xì)菌（芽孢壓力機(jī)，酵母細(xì)胞，細(xì)菌（芽孢和和G+球菌除外）球菌除外） 2)射擊破碎法：射擊破碎法：Braun破碎機(jī)，攪切器（破碎機(jī)，攪切器（blend

4、er），混合），混合器（器（mixer），），0.1-0.45mm玻璃球玻璃球 3)固體研磨法：將待破碎細(xì)胞與玻璃球（固體研磨法：將待破碎細(xì)胞與玻璃球（0.10.45mm）同時(shí)致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末同時(shí)致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末 4)反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法 三、三、DNA的分離與純化的分離與純化 1、供體、供體DNA的分離與純化的分離與純化 要求：盡可能地保持其高分子量，無(wú)其它污染物。要求：盡可能地保持其高分子量，無(wú)其它污染物。 1) 基因組大小：基因組大?。?染色體染色體細(xì)菌細(xì)菌 33004200kb酵母酵母 15,000 kb果蠅果蠅 1.28x105 kb人人 3x106 kb

5、植物植物 2x1051x108 kb 天花病毒天花病毒 288 kb痘病毒痘病毒 196 kb質(zhì)體質(zhì)體 幾幾100以上以上kb 線粒體線粒體 藻類藻類 線狀線狀 15kb酵母酵母 環(huán)狀環(huán)狀 1978 kb植物植物 環(huán)狀環(huán)狀 100150 kb動(dòng)物動(dòng)物(扁蟲(chóng)到人扁蟲(chóng)到人)環(huán)狀環(huán)狀 1518 kb錐蟲(chóng)錐蟲(chóng) 網(wǎng)狀網(wǎng)狀 6000 kb(幼體幼體)短膜蟲(chóng)短膜蟲(chóng) 網(wǎng)狀網(wǎng)狀 30,000 kb(幼體幼體) (Kinetoplast） 葉綠體葉綠體雙子葉植物雙子葉植物 121（菠菜）（菠菜）154kb（豌豆）（豌豆）單子葉植物單子葉植物 151（玉米）（玉米）182kb（浮萍）（浮萍）藻類藻類 132（裸藻）

6、（裸藻）191kb（衣藻）（衣藻） 1) DNA分離純化過(guò)程分離純化過(guò)程 破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞 + DNA抽提液抽提液(EDTA、去污劑、還原劑、去污劑、還原劑) 65溫育溫育20 冰浴冷卻冰浴冷卻 離心去細(xì)胞碎片離心去細(xì)胞碎片 苯酚抽提法苯酚抽提法 CsCl密度梯度離心密度梯度離心 1) 苯酚抽提法苯酚抽提法上清液上清液 緩沖液用水飽和苯酚抽提緩沖液用水飽和苯酚抽提23次次 上層液相用氯仿抽上層液相用氯仿抽至界面無(wú)蛋白變性物至界面無(wú)蛋白變性物 上層液相用兩倍體積冷乙醇沉淀上層液相用兩倍體積冷乙醇沉淀 沉沉淀物用淀物用70%冷乙醇洗滌冷乙醇洗滌,干燥干燥 溶于緩沖液溶于緩沖液 加入加入RNAase

7、處理處理除去除去RNA 苯酚氯仿抽提苯酚氯仿抽提 沉淀干燥沉淀干燥 2) CsCl密度梯度離心密度梯度離心上清液上清液 加入固體加入固體CsCl與與EtBr溶液溶液 室溫下超速離心室溫下超速離心(45,000rpm）16小時(shí)小時(shí) 穿孔取出穿孔取出DNA（320nm） 異丙醇抽提異丙醇抽提溴乙錠溴乙錠 緩沖液透析除去殘余緩沖液透析除去殘余CsCl 兩倍體積冷乙醇沉淀兩倍體積冷乙醇沉淀DNA 離心、洗滌、干燥離心、洗滌、干燥 *兩種方法比較：兩種方法比較： CsCl法操作步驟少，分離法操作步驟少，分離DNA分子量大，耗財(cái)多，且需超速分子量大，耗財(cái)多，且需超速離心機(jī)。離心機(jī)。 苯酚法耗時(shí)少，不需昂貴

8、儀器，但操作步驟多，易使苯酚法耗時(shí)少，不需昂貴儀器，但操作步驟多，易使DNA分分子斷裂。子斷裂。 若若 小心操作，所獲小心操作，所獲DNA亦符合要求。亦符合要求。 * 上述兩種分離方法都包含了下述四個(gè)分離步驟上述兩種分離方法都包含了下述四個(gè)分離步驟.可溶與不可溶物分離：高速離心除去細(xì)胞碎片，保留上清液。可溶與不可溶物分離：高速離心除去細(xì)胞碎片，保留上清液。. 使蛋白質(zhì)分離：苯酚抽提或超速離心使蛋白質(zhì)分離：苯酚抽提或超速離心. 使使RNA分離：分離：RNase處理或超速離心處理或超速離心. 使使DNA與其它可溶物分離與其它可溶物分離 2. 載體載體DNA的分離與純化的分離與純化 1) 質(zhì)粒載體質(zhì)

9、粒載體DNA的分離的分離 關(guān)鍵關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒：如何使質(zhì)粒DNA與宿主染色體與宿主染色體DNA分開(kāi)分開(kāi) 原理原理：質(zhì)粒：質(zhì)粒DNA比染色體比染色體DNA 小得多，在小得多，在DNA抽提過(guò)程中，抽提過(guò)程中，染色體染色體DNA斷裂成小片段斷裂成小片段(線狀線狀)，質(zhì)粒，質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋構(gòu)型仍保持超螺旋構(gòu)型 3) 細(xì)胞器細(xì)胞器DNA的分離的分離 植物組織植物組織 用核分離緩沖液勻漿用核分離緩沖液勻漿 過(guò)濾過(guò)濾 濾液離心濾液離心(2000g, 10,4) 核緩沖液使核裂解核緩沖液使核裂解(含含0.5%Triton X-100) 抽提抽提DNA 植物組織植物組織 細(xì)胞器緩沖液勻漿細(xì)胞器緩沖液勻漿

10、離心離心(100g, 10,4)除去細(xì)胞除去細(xì)胞核核 離心離心(1800g, 10,4)分離葉綠體分離葉綠體 離心離心(10,000g, 10,4)分離線粒體分離線粒體 DNase除去細(xì)胞器外除去細(xì)胞器外DNA 加入加入EDTA使使DNase失活失活 純化細(xì)胞器純化細(xì)胞器 細(xì)胞器裂解細(xì)胞器裂解 提取提取DNA 方法：方法： . 超速離心：利用兩種超速離心：利用兩種DNA分子的大小和空間構(gòu)型分子的大小和空間構(gòu)型 . 變性法：在變性條件下使染色體變性法：在變性條件下使染色體DNA變?yōu)閱捂湥|(zhì)粒變?yōu)閱捂?，而質(zhì)粒DNA仍保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)變性條件發(fā)生迅速變化時(shí)，前者仍不能復(fù)性，仍保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)變性條

11、件發(fā)生迅速變化時(shí)，前者仍不能復(fù)性，而后者又可回復(fù)到天然構(gòu)型。而后者又可回復(fù)到天然構(gòu)型。 變性條件可采用加熱煮沸法或堿變性法變性條件可采用加熱煮沸法或堿變性法上述方法亦可用于上述方法亦可用于ss環(huán)狀病毒環(huán)狀病毒DNA RF型的分離型的分離, 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的的氯霉氯霉素?cái)U(kuò)增素?cái)U(kuò)增使用并不廣泛（菌株和載體）使用并不廣泛（菌株和載體） 2) 噬菌體載體噬菌體載體DNA的分離的分離 純凈病毒顆粒純凈病毒顆粒 病毒載體病毒載體DNA M13mp載體可采用質(zhì)粒載體可采用質(zhì)粒DNA的分離方法的分離方法 二、二、RNA的分離與純化的分離與純化 1. 制備制備RNA的關(guān)鍵的關(guān)鍵防止內(nèi)外源防止內(nèi)外源RNase的作

12、用的作用 1) RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿的特點(diǎn)：抗酸抗堿,具很廣具很廣pH作用范圍作用范圍; 抗高溫嚴(yán)抗高溫嚴(yán)寒寒(065均具活性）；抗變性劑均具活性）；抗變性劑 2) 解決辦法：外源解決辦法：外源RNase高溫，焦磷酸二乙酯高溫，焦磷酸二乙酯(DEPC)處理處理所有溶液（所有溶液（TrisHCl除外）和器皿，操作者帶手套除外）和器皿，操作者帶手套 內(nèi)源內(nèi)源RNase高溫抽提，強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，高溫抽提，強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶抑制劑，蛋白酶K等等 2. 總總RNA的制備的制備 根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類不一樣分為以下三種制備方法：根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類不一樣分為以下三種制備方

13、法： 1）熱苯酚抽提法）熱苯酚抽提法 2）胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍）胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍 3）LiCl/尿素法尿素法 其中以胍鹽法最好，對(duì)于從那些其中以胍鹽法最好，對(duì)于從那些RNase含量很高的組織（胰臟）含量很高的組織（胰臟）中提取中提取RNA特別有效，可使特別有效，可使RNase迅速變性，制備的迅速變性，制備的RNA有較有較高翻譯活性。在高翻譯活性。在RNA制備中，細(xì)胞破碎與蛋白質(zhì)變性是同步進(jìn)制備中，細(xì)胞破碎與蛋白質(zhì)變性是同步進(jìn)行的。行的。3. 多聚核糖體多聚核糖體RNA的制備的制備 1) 多聚核糖體的分離多聚核糖體的分離 超速離心法（超速離心法（30-40萬(wàn)萬(wàn)g，離心，離心2

14、-3 h） 鎂鹽沉淀法（鎂鹽沉淀法（0.1 M Mg+） 分級(jí)分離法分級(jí)分離法分離特異性多聚核糖體分離特異性多聚核糖體 i. 結(jié)合與游離核糖體結(jié)合與游離核糖體的分離，這種方法可避免溶酶體破裂。的分離，這種方法可避免溶酶體破裂。 ii. 核糖體大小分級(jí)分離，利用連續(xù)密度梯度分離特大和特小的核糖體大小分級(jí)分離，利用連續(xù)密度梯度分離特大和特小的 多聚核糖體多聚核糖體 iii.核糖體免疫沉淀法核糖體免疫沉淀法 *直接免疫沉淀法直接免疫沉淀法 新生肽鏈新生肽鏈+抗體抗體 蔗糖密度梯度離心蔗糖密度梯度離心 * * *間接免疫沉淀法間接免疫沉淀法 新生肽鏈新生肽鏈+ +抗體抗體+ +抗抗- -抗體（二抗）抗

15、體（二抗） 不可不可 溶復(fù)合物溶復(fù)合物 離心分離離心分離 *免疫親和層析法免疫親和層析法 新生肽鏈新生肽鏈-抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物 不溶性交聯(lián)抗原基不溶性交聯(lián)抗原基 質(zhì)親和層析柱吸附質(zhì)親和層析柱吸附 洗脫洗脫 免疫沉淀法優(yōu)點(diǎn)：可分離到含量?jī)H為免疫沉淀法優(yōu)點(diǎn)：可分離到含量?jī)H為1%的的mRNA，但必須使，但必須使用高純度的抗體，不能發(fā)生交叉反應(yīng)和污染核酸酶用高純度的抗體，不能發(fā)生交叉反應(yīng)和污染核酸酶 2) 多聚核糖體多聚核糖體RNA的分離的分離純化多聚核糖體純化多聚核糖體+SDS 蔗糖密度梯度離心或蛋白酶蔗糖密度梯度離心或蛋白酶K-苯酚抽提苯酚抽提 4. RNA的分級(jí)分離的分級(jí)分離 1) 分子量大小

16、分級(jí)分離分子量大小分級(jí)分離 i. 蔗糖密度梯度離心蔗糖密度梯度離心 ii. 凝膠電泳凝膠電泳 2) 核酸序列分級(jí)分離核酸序列分級(jí)分離 i. 分子雜交法：適用于同源性很高的分子雜交法：適用于同源性很高的RNA的分離的分離DNA分子變性分子變性 結(jié)合到結(jié)合到NCF RNADNA雜交雜交 洗滌洗滌 洗膜洗膜 乙醇沉淀乙醇沉淀 ii. 親和層析法：親和層析法： 低聚低聚dT纖維素纖維素: 用于用于poly(A)較長(zhǎng)的較長(zhǎng)的mRNA； 多聚多聚U瓊脂糖瓊脂糖: 用于用于poly(A)較短的較短的mRNA（20A） RNA進(jìn)樣吸附進(jìn)樣吸附 洗滌洗滌 洗脫洗脫 收集收集260nm處吸收峰樣品處吸收峰樣品 乙

17、醇沉淀乙醇沉淀 iii. 無(wú)無(wú)poly(A) mRNA的分離的分離 純化多聚核糖體純化多聚核糖體 核糖體亞基核糖體亞基+mRNP 離心離心 mRNP 蛋白酶蛋白酶K mRNA 低聚（低聚（dT）纖維素層析）纖維素層析 洗出液洗出液 乙醇沉淀（無(wú)多乙醇沉淀（無(wú)多聚聚A mRNA） 5. RNA的質(zhì)量評(píng)估方法的質(zhì)量評(píng)估方法 1) 光密度值測(cè)定法光密度值測(cè)定法 A260/A280=2.0 2) 凝膠電泳凝膠電泳 3) 體外蛋白質(zhì)翻譯體外蛋白質(zhì)翻譯細(xì)胞裂解物細(xì)胞裂解物 胍鹽法胍鹽法 總總RNA 分子雜交法分子雜交法 特異特異RNA分子分子 熱苯酚法熱苯酚法 凝膠電泳凝膠電泳 圍圍RNA大小分級(jí)分離大小

18、分級(jí)分離 大小范大小范蔗糖密度蔗糖密度梯度離心梯度離心 一定一定 LiCl/ 核酸序列核酸序列 尿素法尿素法離心離心 分級(jí)分離分級(jí)分離 親和層析法親和層析法 poly（A）RNA分子分子 高速離心法高速離心法 全部多聚核糖體全部多聚核糖體 上清液上清液 鎂鹽沉淀法鎂鹽沉淀法蔗糖密度梯度離心蔗糖密度梯度離心結(jié)合與結(jié)合與游離多聚核糖體游離多聚核糖體分級(jí)分離法分級(jí)分離法 蔗糖連續(xù)密度蔗糖連續(xù)密度一定范圍大小核糖體一定范圍大小核糖體多聚核糖體多聚核糖體RNA免疫沉淀法免疫沉淀法特異性多聚核糖體特異性多聚核糖體 第二節(jié)第二節(jié)核核 酸酸 電電 泳泳 1. 種類種類 1) 按凝膠材料分按凝膠材料分: 聚丙烯

19、酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳(普通瓊普通瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖) 2) 按電泳裝置分按電泳裝置分: 水平式水平式/瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠; 豎式豎式/聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 3) 兩種方法比較：分離效果和分離范圍兩種方法比較：分離效果和分離范圍; 操作難易操作難易 2. 用途用途 瓊脂糖凝膠用于瓊脂糖凝膠用于DNA和和RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。常用于小分子核酸分析。 3. 凝膠電泳的一般程序凝膠電泳的一般程序 制膠制膠 點(diǎn)樣點(diǎn)樣 電泳電泳 染色染色 觀察觀察二、二、DNA電泳電泳 1. DNA分

20、子種類分子種類 1) 線狀線狀DNA單鏈與雙鏈，單鏈與雙鏈，ss-DNA電泳時(shí)要注意局部區(qū)域形電泳時(shí)要注意局部區(qū)域形成成ds-DNA，造成遷移距離不確定，造成遷移距離不確定 2) 環(huán)狀環(huán)狀DNA單鏈（如單鏈（如M13mp）和雙鏈（質(zhì)粒）和雙鏈（質(zhì)粒DNA） 3) 線狀線狀ds-DNA電泳電泳使用頻率最高的一種電泳使用頻率最高的一種電泳 這類這類DNA分子在電泳過(guò)程中遷移的距離受以下幾個(gè)因分子在電泳過(guò)程中遷移的距離受以下幾個(gè)因素的影響：素的影響： i. 分子量分子量 的大小的大小: 遷移距離與分子量的遷移距離與分子量的常用對(duì)數(shù)常用對(duì)數(shù)成反比成反比 ii. 凝膠濃度凝膠濃度: 濃度越高，移動(dòng)距離越

21、短，適合分離低分子量濃度越高，移動(dòng)距離越短，適合分離低分子量DNA濃度越低，移動(dòng)距離越長(zhǎng)，適合分離高分子量濃度越低，移動(dòng)距離越長(zhǎng)，適合分離高分子量DNAiii.電壓電壓: 低電壓時(shí)，遷移率與低電壓時(shí)，遷移率與電壓成正比；電壓增高時(shí)，電壓成正比；電壓增高時(shí)，不同大小不同大小DNA片段遷移率片段遷移率增大是不同的。增大是不同的。iv.堿基組成與溫度堿基組成與溫度: 不受影響不受影響,溫度高可導(dǎo)致溫度高可導(dǎo)致DNA帶變形帶變形或解鏈。或解鏈。4) 環(huán)狀環(huán)狀ds-DNA電泳電泳: 常用于質(zhì)粒常用于質(zhì)粒DNA的初步鑒定的初步鑒定5) 線狀線狀ss-DNA電泳電泳 鏈分離凝膠鏈分離凝膠：化學(xué)定序時(shí)，用于單

22、鏈分離。：化學(xué)定序時(shí)，用于單鏈分離。DNA雙鏈互補(bǔ)，雙鏈互補(bǔ)，但組成不一樣，仍可分離（機(jī)理不詳），電泳時(shí)形成三條帶：但組成不一樣，仍可分離（機(jī)理不詳），電泳時(shí)形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。變性雙鏈，兩條單鏈。 核酸定序凝膠核酸定序凝膠( (染料指染料指示劑示劑) )：為避免局部區(qū)域：為避免局部區(qū)域產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)，可采用各產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等）甲胺等）三三. RNA凝膠電泳凝膠電泳 方法：不同的方法：不同的RNA電泳方法是依據(jù)使電泳方法是依據(jù)使RNA分子

23、變性所采取的方分子變性所采取的方法。這些方法不僅要使法。這些方法不僅要使RNA分子在點(diǎn)樣時(shí)是一級(jí)結(jié)構(gòu)，分子在點(diǎn)樣時(shí)是一級(jí)結(jié)構(gòu)，而且在整個(gè)電泳過(guò)程中也保持一級(jí)結(jié)構(gòu)。而且在整個(gè)電泳過(guò)程中也保持一級(jí)結(jié)構(gòu)。 1. 乙二醛乙二醛/二甲基亞砜法二甲基亞砜法 原理：乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發(fā)生反應(yīng)，特別是原理：乙二醛可以與核酸、核苷酸及堿基發(fā)生反應(yīng)，特別是鳥(niǎo)苷形成一個(gè)穩(wěn)定的附加環(huán)，從而阻止鳥(niǎo)苷形成一個(gè)穩(wěn)定的附加環(huán)，從而阻止GC堿基的互補(bǔ)堿基的互補(bǔ)作用發(fā)生作用發(fā)生 步驟：步驟：RNA+10mM羥甲基醛和羥甲基醛和50% DMSO混合混合 50、1 h變性變性 點(diǎn)樣點(diǎn)樣 電泳電泳 染色染色 觀察觀察 2.

24、 羥甲基汞法羥甲基汞法 原理：羥甲基汞可與原理：羥甲基汞可與RNA分子的嘌呤或嘧啶堿基發(fā)生反應(yīng)，分子的嘌呤或嘧啶堿基發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。反應(yīng)部位是在可形成氫鍵的亞氨基處。 步驟：步驟：RNA+10mM羥甲基醛羥甲基醛 點(diǎn)樣在含點(diǎn)樣在含4mM羥甲基醛的羥甲基醛的瓊脂糖凝膠上瓊脂糖凝膠上 電泳電泳 染色觀察染色觀察 3. 甲醛法甲醛法 步驟：步驟：RNA+2.2M甲醛甲醛+50%甲胺甲胺 點(diǎn)樣在含點(diǎn)樣在含2.2M甲醛瓊脂甲醛瓊脂糖凝膠上糖凝膠上 MOPS緩沖液電泳緩沖液電泳 染色觀察染色觀察 其它變性劑，如尿素、甲胺等也可用于其它變性劑，如尿素、甲胺等也可用于RNA電泳電泳

25、. 4. 三種方法的比較三種方法的比較 第一種方法安全，但由于反應(yīng)是不可逆的，由此回收的第一種方法安全，但由于反應(yīng)是不可逆的，由此回收的RNA樣樣品用于體外翻譯效果不好。第二、三種方法的反應(yīng)可逆，回收品用于體外翻譯效果不好。第二、三種方法的反應(yīng)可逆，回收RNA樣品可用于體外翻譯反應(yīng)，但操作必須小心，因兩種變性劑樣品可用于體外翻譯反應(yīng)，但操作必須小心，因兩種變性劑有毒。有毒。五、蛋白質(zhì)電泳五、蛋白質(zhì)電泳 方法：變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者常稱之為方法：變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者常稱之為SDS-PAGE。差別：有無(wú)變性劑。差別：有無(wú)變性劑 用途：非變性凝膠可用于蛋白質(zhì)的分離純化過(guò)

26、程中，可直接用用途：非變性凝膠可用于蛋白質(zhì)的分離純化過(guò)程中，可直接用于酶促反應(yīng)（顏色變化）于酶促反應(yīng)（顏色變化） SDS-PAGE可用于蛋白質(zhì)分子量、亞基組成的測(cè)定。可用于蛋白質(zhì)分子量、亞基組成的測(cè)定。mRNA翻翻譯產(chǎn)物，基因表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定等。譯產(chǎn)物，基因表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定等。 五、核酸片段的分離與回收五、核酸片段的分離與回收 1.方法方法 用于用于DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的回收以及蛋白質(zhì)的回收 1) 電洗脫法電洗脫法: 利用電泳方法將凝膠中的特定核酸分子到其它利用電泳方法將凝膠中的特定核酸分子到其它介質(zhì)中；介質(zhì)中； 2) 濾紙法濾紙法 核酸凝膠染色核酸凝膠染色 長(zhǎng)波紫外光確定位置長(zhǎng)波紫外光確定位置

27、在分在分離帶前方切一口子并插入濾紙條離帶前方切一口子并插入濾紙條(其背面覆蓋透析袋膜其背面覆蓋透析袋膜) 電泳至電泳至DNA帶全部進(jìn)入濾紙條帶全部進(jìn)入濾紙條 洗脫洗脫DNA 純化、沉淀純化、沉淀 3) 透析袋法透析袋法切下含切下含DNA帶瓊脂塊帶瓊脂塊 放入透析袋，封口放入透析袋，封口 放入電泳槽放入電泳槽 電泳電泳23小時(shí)至全部小時(shí)至全部DNA離開(kāi)凝膠塊離開(kāi)凝膠塊 反向電泳反向電泳1分鐘分鐘 取出取出DNA液液 純化、沉淀純化、沉淀 4) 凍融法凍融法 5) 酶解法酶解法 待回收待回收DNA 切口切口 DNA 切口切口 凝膠塊凝膠塊 濾紙法濾紙法 透析袋透析袋 凝膠塊凝膠塊 待回收待回收DN

28、A DNA 透析袋法透析袋法 待回收待回收DNA 凝膠塊凝膠塊 V-型槽型槽 電洗脫槽法電洗脫槽法 回收回收DNA方法方法 2. 影響回收率的因素影響回收率的因素 1）DNA分子大小分子大小回收率與分子量大小呈負(fù)相關(guān)；回收率與分子量大小呈負(fù)相關(guān)； 2）乙醇沉淀）乙醇沉淀其中溫度、時(shí)間和其中溫度、時(shí)間和DNA濃度（回收時(shí)體積）濃度（回收時(shí)體積）均與回收率有關(guān)；均與回收率有關(guān)； 3）離心時(shí)間）離心時(shí)間時(shí)間越長(zhǎng)，效果越好，對(duì)低濃度時(shí)間越長(zhǎng)，效果越好，對(duì)低濃度DNA尤其尤其明顯。明顯。3. 回收回收DNA片段質(zhì)量片段質(zhì)量 凝膠材料的質(zhì)量，如瓊脂糖中的硫酸鹽凝膠材料的質(zhì)量，如瓊脂糖中的硫酸鹽 沉淀劑若改

29、用精胺，它可有效地去除沉淀劑若改用精胺，它可有效地去除PEG、核苷酸、鹽、核苷酸、鹽、聚丙烯酰胺及蛋白質(zhì)等。聚丙烯酰胺及蛋白質(zhì)等。第三節(jié)第三節(jié) 染色體染色體DNA電泳電泳一、一、 DNA分子在凝膠電泳中的移動(dòng)分子在凝膠電泳中的移動(dòng) 1、常規(guī)電泳、常規(guī)電泳 在自由電場(chǎng)中，在自由電場(chǎng)中，DNA的移動(dòng)速度與分子量大小無(wú)關(guān)；的移動(dòng)速度與分子量大小無(wú)關(guān)； 將將DNA分子置于凝膠中進(jìn)行電泳，分子置于凝膠中進(jìn)行電泳，DNA移動(dòng)距離與分子量有關(guān)。移動(dòng)距離與分子量有關(guān)。分子量小的移動(dòng)快；反之則慢。大于分子量小的移動(dòng)快；反之則慢。大于20kb的的DNA大分子，其移動(dòng)大分子，其移動(dòng)距離與分子量無(wú)關(guān)。因?yàn)檫@些距離與分

30、子量無(wú)關(guān)。因?yàn)檫@些DNA分子要通過(guò)膠孔時(shí)必須發(fā)生變分子要通過(guò)膠孔時(shí)必須發(fā)生變形，并沿分子長(zhǎng)軸運(yùn)動(dòng)經(jīng)過(guò)膠孔，它們都以相同速度前進(jìn)，分辨形，并沿分子長(zhǎng)軸運(yùn)動(dòng)經(jīng)過(guò)膠孔，它們都以相同速度前進(jìn)，分辨率也就消失了。率也就消失了。 2、脈沖場(chǎng)凝膠電泳、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulse-field gel electrophoresis，PFGE) PFG工作假說(shuō)工作假說(shuō) 1) DNA松弛時(shí)間：大分子松弛時(shí)間：大分子DNA改變形狀和重新定向所需的改變形狀和重新定向所需的時(shí)間。這個(gè)時(shí)間與時(shí)間。這個(gè)時(shí)間與DNA分子量呈正相關(guān)（分子量呈正相關(guān)（Tr） 2) DNA移動(dòng)時(shí)間：移動(dòng)時(shí)間：DNA分子向前移動(dòng)的時(shí)間（分子向前移動(dòng)

31、的時(shí)間（Tm） 3) 電場(chǎng)脈沖時(shí)間：其電場(chǎng)方向所持續(xù)的時(shí)間（電場(chǎng)脈沖時(shí)間：其電場(chǎng)方向所持續(xù)的時(shí)間（Tp） 分子量大的分子量大的DNA分子所需的松弛時(shí)間長(zhǎng)，分子量小的則短。分子所需的松弛時(shí)間長(zhǎng)，分子量小的則短。由于脈沖時(shí)間是一個(gè)人為的固定值，那么用于向前移動(dòng)的時(shí)間則由于脈沖時(shí)間是一個(gè)人為的固定值，那么用于向前移動(dòng)的時(shí)間則隨分子量大小而變化。分子量大的用于向前運(yùn)動(dòng)的時(shí)間少，移動(dòng)隨分子量大小而變化。分子量大的用于向前運(yùn)動(dòng)的時(shí)間少，移動(dòng)距離就短，分子量小的用于向前運(yùn)動(dòng)的時(shí)間多，移動(dòng)距離就長(zhǎng)。距離就短，分子量小的用于向前運(yùn)動(dòng)的時(shí)間多，移動(dòng)距離就長(zhǎng)。這就是使不同大小分子量這就是使不同大小分子量DNA分離的

32、假說(shuō)。分離的假說(shuō)。 Tp小小 = Tm小小+ Tr小小 Tp大大 = Tm大大+ Tr大大因因Tp小小 = Tp大大 ， Tr小小 Tm大大 ，所以，所以， S小小 S大大 顯然，要使一個(gè)顯然，要使一個(gè)DNA樣品中不同大小的樣品中不同大小的DNA分子分離，脈沖分子分離，脈沖時(shí)間應(yīng)選在最大時(shí)間應(yīng)選在最大DNA分子所需的上限。分子所需的上限。二脈沖場(chǎng)凝膠電泳的種類二脈沖場(chǎng)凝膠電泳的種類 1正交場(chǎng)脈沖凝膠電泳（正交場(chǎng)脈沖凝膠電泳（OFAGE） 利用兩個(gè)或多個(gè)交變電場(chǎng)，使利用兩個(gè)或多個(gè)交變電場(chǎng)，使200-3000 kb的的DNA分子發(fā)生分分子發(fā)生分離，其電極排列可以是雙向非均勻，單向非均勻等。離，其電

33、極排列可以是雙向非均勻，單向非均勻等。脈沖場(chǎng)凝膠電泳原理圖脈沖場(chǎng)凝膠電泳原理圖 北北 南南 脈沖場(chǎng)電泳脈沖場(chǎng)電泳 常規(guī)電泳常規(guī)電泳 兩組電極，排列不均勻兩組電極，排列不均勻; 一組電極，電場(chǎng)方向不變，電極排列均勻，一組電極，電場(chǎng)方向不變，電極排列均勻， 定時(shí)改變電場(chǎng)方向，定時(shí)改變電場(chǎng)方向，DNA分子的凈分子的凈 DNA移動(dòng)方向與電場(chǎng)方向相同。整個(gè)電泳移動(dòng)方向與電場(chǎng)方向相同。整個(gè)電泳 移動(dòng)方向與兩電場(chǎng)呈移動(dòng)方向與兩電場(chǎng)呈45o，在電泳過(guò)，在電泳過(guò) 過(guò)程保持電壓穩(wěn)定。常規(guī)方法制備過(guò)程保持電壓穩(wěn)定。常規(guī)方法制備DNA 程中，電壓有時(shí)可隨時(shí)間的增加而樣程中，電壓有時(shí)可隨時(shí)間的增加而樣品增加，品增加，

34、制備制備DNA樣品與常規(guī)方法樣品與常規(guī)方法不同不同 2. 場(chǎng)倒置凝膠電泳（場(chǎng)倒置凝膠電泳（FIGE） 利用常規(guī)電泳槽進(jìn)行電泳，但電場(chǎng)方向則是周期性地發(fā)生倒利用常規(guī)電泳槽進(jìn)行電泳，但電場(chǎng)方向則是周期性地發(fā)生倒置，其正向和反向的脈沖時(shí)間長(zhǎng)度之比為置，其正向和反向的脈沖時(shí)間長(zhǎng)度之比為3或其它比值。該法可或其它比值。該法可使使15-700 Kb或以上的或以上的DNA分子發(fā)生分離。分子發(fā)生分離。 為了克服同移動(dòng)現(xiàn)象產(chǎn)生（即不同大小為了克服同移動(dòng)現(xiàn)象產(chǎn)生（即不同大小DNA分子一起移動(dòng)），分子一起移動(dòng)），可以采用可以采用轉(zhuǎn)換時(shí)間遞增法轉(zhuǎn)換時(shí)間遞增法（swiching-interval ramps）, 即由電

35、泳即由電泳開(kāi)始時(shí)的短脈沖時(shí)間逐漸遞增到電泳結(jié)束時(shí)的長(zhǎng)脈沖時(shí)間。如開(kāi)開(kāi)始時(shí)的短脈沖時(shí)間逐漸遞增到電泳結(jié)束時(shí)的長(zhǎng)脈沖時(shí)間。如開(kāi)始時(shí)為始時(shí)為60：20，結(jié)束時(shí)可為，結(jié)束時(shí)可為180：60。 上述兩種方法也可聯(lián)合使用，使一些很難分開(kāi)的大分子上述兩種方法也可聯(lián)合使用，使一些很難分開(kāi)的大分子DNA分離。分離。 3. CHEF(Contour-Clamped Homogeneous Electric Fields) 動(dòng)態(tài)調(diào)控閉合均一電場(chǎng)電泳動(dòng)態(tài)調(diào)控閉合均一電場(chǎng)電泳場(chǎng)倒置電泳場(chǎng)倒置電泳 CHEF(動(dòng)態(tài)調(diào)控動(dòng)態(tài)調(diào)控閉合均一電場(chǎng)電泳閉合均一電場(chǎng)電泳)各種脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)的比較各種脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)的比較 方法方

36、法 染色體帶染色體帶 最大帶最大帶 最小帶最小帶 動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié) 直道直道 均勻電場(chǎng)均勻電場(chǎng) 液體樣品液體樣品 機(jī)械轉(zhuǎn)換機(jī)械轉(zhuǎn)換CHEF 15 12000kb 88 bp 是是 是是 是是 是是 不不OFAGE 13 9000kb 5000 bp 不不 不不 不不 是是 不不 TAFE 13 9000kb 2000 bp 不不 是是 不不 不不 不不FIGE 11 2000kb 200 bp 不不 是是 是是 是是 不不RFGE 15 ? 200000 bp 不不 是是 是是 不不 是是三影響染色體三影響染色體DNA電泳的主要因素電泳的主要因素 1染色體的結(jié)構(gòu)染色體的結(jié)構(gòu) 2電泳槽電極的構(gòu)型電泳槽電極的構(gòu)型 3電壓：它與脈沖時(shí)間成反比電壓：它