實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的革蘭氏染色及芽孢染色法

1、實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的革蘭氏染色及細(xì)菌的革蘭氏染色及芽孢染色法芽孢染色法 實(shí)驗(yàn)一存在問(wèn)題實(shí)驗(yàn)一存在問(wèn)題 1、香柏油要加適量香柏油要加適量 2、涂完菌后接種環(huán)一定要灼燒滅菌、涂完菌后接種環(huán)一定要灼燒滅菌 3、無(wú)菌操作、無(wú)菌操作 4、擦鏡紙浪費(fèi)、擦鏡紙浪費(fèi) 5、載玻片要洗干凈、載玻片要洗干凈 6、畫圖不符合要求、畫圖不符合要求細(xì)菌細(xì)菌 個(gè)體個(gè)體微小微小半透半透明明 未未染色染色細(xì)菌細(xì)菌大致大致形態(tài)形態(tài)大小大小單染色法單染色法復(fù)染色法復(fù)染色法能看清形態(tài)大小能看清形態(tài)大小但是無(wú)鑒別意義但是無(wú)鑒別意義能看清形態(tài)大小能看清形態(tài)大小又有鑒別意義又有鑒別意義顯微鏡顯微鏡細(xì)菌的染色細(xì)菌的染色（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模海ㄒ唬?/p>

2、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1、學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色法和芽孢染色法。、學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色法和芽孢染色法。 2、鞏固顯微鏡油鏡的使用技術(shù)和無(wú)菌操作技術(shù)。、鞏固顯微鏡油鏡的使用技術(shù)和無(wú)菌操作技術(shù)。 革蘭氏染色法革蘭氏染色法：是是18841884年由丹麥病理學(xué)家所創(chuàng)立的。革年由丹麥病理學(xué)家所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌（G G+ +）和和革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌（G G）兩大類，該染色法所以能將細(xì)菌分為兩大類，該染色法所以能將細(xì)菌分為G G+ +菌和菌和G G菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的

3、。決定的。（二）實(shí)驗(yàn)原理（二）實(shí)驗(yàn)原理革蘭氏染色原理革蘭氏染色原理肽聚糖（肽聚糖（15-50層）層）細(xì)胞膜（雙層脂質(zhì)細(xì)胞膜（雙層脂質(zhì) 蛋白嵌鑲）蛋白嵌鑲）脂質(zhì)脂質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-1,4-1,4糖苷鍵糖苷鍵N-乙酰葡萄糖胺乙酰葡萄糖胺N-乙酰胞壁酸乙酰胞壁酸四肽鏈四肽鏈五肽橋五肽橋外膜外膜肽聚糖（肽聚糖（1-3層）層）細(xì)胞膜細(xì)胞膜脂質(zhì)脂質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脂質(zhì)雙層脂質(zhì)雙層脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖 G G+ +G G（二）實(shí)驗(yàn)原理（二）實(shí)驗(yàn)原理革蘭氏染色原理革蘭氏染色原理 芽孢（內(nèi)生孢子）及其研究芽孢的重要性芽孢（內(nèi)生孢子）及其研究芽孢的重要性芽孢是某些芽孢是某些G G+ +菌形成的圓形或橢圓形的休眠體，

4、抗熱性菌形成的圓形或橢圓形的休眠體，抗熱性和折光性較強(qiáng)。和折光性較強(qiáng)。芽孢的大小、形態(tài)、位置可做分類依據(jù)。芽孢的大小、形態(tài)、位置可做分類依據(jù)。 （二）實(shí)驗(yàn)原理（二）實(shí)驗(yàn)原理芽孢染色法原理芽孢染色法原理中央芽孢中央芽孢偏端芽孢偏端芽孢游離芽孢游離芽孢末端芽孢末端芽孢（二）實(shí)驗(yàn)原理（二）實(shí)驗(yàn)原理芽孢染色法原理芽孢染色法原理芽孢壁厚、透性低，著色和脫色均較困難；芽孢壁厚、透性低，著色和脫色均較困難；但當(dāng)用弱堿性染料（孔雀綠）在加熱的情況下進(jìn)行但當(dāng)用弱堿性染料（孔雀綠）在加熱的情況下進(jìn)行染色時(shí)，染料可進(jìn)入菌體和芽孢；染色時(shí)，染料可進(jìn)入菌體和芽孢；進(jìn)入菌體的染料經(jīng)水洗后可被脫色；進(jìn)入菌體的染料經(jīng)水洗后可

5、被脫色；當(dāng)用對(duì)比度大、淺色的復(fù)染色劑（番紅）染色后，當(dāng)用對(duì)比度大、淺色的復(fù)染色劑（番紅）染色后，芽孢仍保留初染劑的顏色（綠色），而菌體呈復(fù)染芽孢仍保留初染劑的顏色（綠色），而菌體呈復(fù)染劑顏色（紅色）。劑顏色（紅色）。 1、活材料：、活材料：革蘭氏染色：培養(yǎng)革蘭氏染色：培養(yǎng)12h-16h枯草桿菌（枯草桿菌（Bacillus subtilis）和培養(yǎng)和培養(yǎng)24h大腸桿菌（大腸桿菌（Escherichia coli）芽孢染色：培養(yǎng)芽孢染色：培養(yǎng)28-36 小時(shí)小時(shí) 的蠟狀芽孢桿菌（的蠟狀芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）2、染色液和試劑：、染色液和試劑：革蘭氏染色染色液：結(jié)晶紫

6、、盧哥氏碘液、革蘭氏染色染色液：結(jié)晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃酒精、蕃紅；紅；芽孢染色液：芽孢染色液：5%孔雀綠水溶液、孔雀綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液蕃紅水溶液 ；二甲苯、香柏油二甲苯、香柏油 。3、器材：器材：載玻片、接種杯、木夾子、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。載玻片、接種杯、木夾子、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。（三）實(shí)驗(yàn)器材（三）實(shí)驗(yàn)器材 1. 1.細(xì)菌涂片標(biāo)本的制作細(xì)菌涂片標(biāo)本的制作（1）涂片）涂片 載玻片載玻片1張，加張，加1滴生理鹽水，取菌研磨均勻。滴生理鹽水，取菌研磨均勻。（2）干燥）干燥 室溫干燥，或置酒精燈高處慢慢烘烤。室溫干燥，或置酒精燈高處慢慢烘烤。（3）固定）固定 干燥后的

7、涂片，在酒精燈火焰中通過(guò)干燥后的涂片，在酒精燈火焰中通過(guò)3次。次。（四）實(shí)驗(yàn)步驟（四）實(shí)驗(yàn)步驟革蘭氏染色革蘭氏染色 2. 2.革蘭法染色革蘭法染色（1 1）初染）初染 結(jié)結(jié) 晶晶 紫紫 2min 2min 細(xì)水沖洗細(xì)水沖洗 甩去積水甩去積水（2 2）媒染）媒染 盧戈碘液盧戈碘液 1min 1min 細(xì)水沖洗細(xì)水沖洗 甩去積水甩去積水（3 3）脫色）脫色 95%95%乙醇乙醇 20-30s 20-30s 細(xì)水沖洗細(xì)水沖洗 甩去積水甩去積水（4 4）復(fù)染）復(fù)染 番紅番紅 3min 3min 細(xì)水沖洗細(xì)水沖洗 甩去積水甩去積水（四）實(shí)驗(yàn)步驟（四）實(shí)驗(yàn)步驟革蘭氏染色革蘭氏染色3.3.觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察實(shí)

8、驗(yàn)結(jié)果 待標(biāo)本自干或用吸水紙吸干后，置顯微待標(biāo)本自干或用吸水紙吸干后，置顯微鏡下檢查。鏡下檢查。革蘭陽(yáng)性菌（革蘭陽(yáng)性菌（G G+ +），）， 被染成被染成藍(lán)紫藍(lán)紫色。色。革蘭陰性菌（革蘭陰性菌（G G- -），）， 被染成被染成紅紅色色。（四）實(shí)驗(yàn)步驟（四）實(shí)驗(yàn)步驟革蘭氏染色革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)程序?qū)嶒?yàn)程序（革蘭氏染色的方法和步驟）（革蘭氏染色的方法和步驟）涂片涂片蒸餾水蒸餾水涂片涂片結(jié)晶紫結(jié)晶紫 碘碘 液液95%乙醇乙醇自然干燥自然干燥媒染媒染1min脫色脫色2030s初染初染1min、后水后水洗洗固定固定 番紅番紅復(fù)染復(fù)染2min干燥干燥鏡檢鏡檢水洗時(shí)不要直接沖菌膜水洗時(shí)不要直接沖菌膜水洗水洗水

9、洗水洗水洗水洗每人取大腸桿菌和枯草桿菌，做一塊混合涂片，進(jìn)行革蘭氏染色。每人取大腸桿菌和枯草桿菌，做一塊混合涂片，進(jìn)行革蘭氏染色。2分鐘分鐘1分鐘分鐘3分鐘分鐘干燥固定干燥固定 取一干凈載玻片取一干凈載玻片在兩端各加一滴生理鹽水在兩端各加一滴生理鹽水無(wú)無(wú)菌操作取菌種菌操作取菌種涂于生理鹽水中（涂于生理鹽水中（成菌膜成菌膜） 自然干燥自然干燥火焰固定火焰固定初染初染（結(jié)晶紫，結(jié)晶紫，2min2min） 水洗水洗媒染媒染（碘液，碘液，1min1min） 水洗水洗脫脫色色（乙醇，乙醇，20-30s20-30s） 水洗水洗復(fù)染復(fù)染（蕃紅，蕃紅，3min3min） 水洗水洗自然干燥自然干燥觀察。觀察。（

10、四）實(shí)驗(yàn)步驟（四）實(shí)驗(yàn)步驟革蘭氏染色革蘭氏染色 涂片時(shí)，滴生理鹽水不要過(guò)多，挑菌量宜少，涂片要均勻，涂片時(shí)，滴生理鹽水不要過(guò)多，挑菌量宜少，涂片要均勻，菌膜宜??；菌膜宜??； 酒精脫色：是革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵，酒精脫色：是革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵，要求脫至流出的乙醇要求脫至流出的乙醇不帶顏色為止，立即水洗。若脫色不足，陰性菌被誤染成陽(yáng)不帶顏色為止，立即水洗。若脫色不足，陰性菌被誤染成陽(yáng)性菌，脫色過(guò)度，陽(yáng)性菌被誤染為陰性菌。性菌，脫色過(guò)度，陽(yáng)性菌被誤染為陰性菌。 染色過(guò)程中勿使染色液干涸。用水沖洗后（沖反面），應(yīng)吸染色過(guò)程中勿使染色液干涸。用水沖洗后（沖反面），應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影

11、響染色效果。去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。革蘭氏染色注意事項(xiàng)革蘭氏染色注意事項(xiàng)v制備菌懸液制備菌懸液v染色染色v涂片固定涂片固定v脫色脫色v復(fù)染復(fù)染v鏡檢鏡檢改良的改良的Schaeffer-FultonSchaeffer-Fulton氏染色法氏染色法（四）實(shí)驗(yàn)步驟（四）實(shí)驗(yàn)步驟芽孢染色芽孢染色芽孢染色芽孢染色-制備菌懸液制備菌懸液生理鹽水生理鹽水 1、滴生理鹽水、滴生理鹽水 挑取挑取2-3環(huán)菌苔環(huán)菌苔與生理鹽水混勻與生理鹽水混勻2、制備菌懸液、制備菌懸液在在EP管中滴管中滴2滴生理鹽水滴生理鹽水芽孢染色芽孢染色-染色染色5%孔雀綠染液孔雀綠染液1、滴加孔雀綠染液、滴加孔雀綠染

12、液沸水浴加熱沸水浴加熱15-20min2、加熱染色、加熱染色在離心管中滴在離心管中滴2-3滴孔雀綠染液滴孔雀綠染液芽孢染色芽孢染色-涂片固定涂片固定經(jīng)孔雀綠染經(jīng)孔雀綠染色細(xì)菌懸液色細(xì)菌懸液1、滴菌懸液、滴菌懸液用接種環(huán)用接種環(huán)均勻涂布均勻涂布2、涂片、涂片接種環(huán)取菌懸液接種環(huán)取菌懸液在載玻片中央在載玻片中央 3、干燥、干燥室溫自然晾干室溫自然晾干4、固定、固定通過(guò)酒精燈通過(guò)酒精燈火焰火焰3次固定次固定芽孢染色芽孢染色-復(fù)復(fù) 染染0.5%番紅水溶液番紅水溶液1、滴番紅水溶液、滴番紅水溶液滴加數(shù)滴番紅染滴加數(shù)滴番紅染液在菌膜上，染液在菌膜上，染色色2min2、水洗、水洗不要直接沖菌膜不要直接沖菌膜

13、番紅水溶液番紅水溶液（四）實(shí)驗(yàn)步驟（四）實(shí)驗(yàn)步驟芽孢染色芽孢染色1.1.分別繪出分別繪出枯草桿菌枯草桿菌和和大腸桿菌大腸桿菌的形態(tài)圖，并注明兩菌的的形態(tài)圖，并注明兩菌的革蘭氏染色的結(jié)果。革蘭氏染色的結(jié)果。用紅藍(lán)筆畫出模式圖。用紅藍(lán)筆畫出模式圖。2.2.繪出芽孢的形狀和著生位置，并注明染色結(jié)果（菌體顏繪出芽孢的形狀和著生位置，并注明染色結(jié)果（菌體顏色和芽孢顏色）。色和芽孢顏色）。（五）實(shí)驗(yàn)作業(yè)（五）實(shí)驗(yàn)作業(yè)思考題：思考題：l 你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？l 你的染色結(jié)果是否正確？如果不正確，請(qǐng)說(shuō)明原因。你的染色結(jié)果是否正確？如果不正確，請(qǐng)說(shuō)明原因。 桌面擦干凈