實(shí)驗(yàn)三、血液葡萄糖的測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七 血液葡萄糖的測(cè)定血液葡萄糖的測(cè)定（福林（福林-吳憲氏法）吳憲氏法）一、實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn) 目的目的掌握無(wú)蛋白濾液的制備方法；掌握無(wú)蛋白濾液的制備方法；掌握采用福林掌握采用福林-吳憲氏法測(cè)定血液中葡萄糖的吳憲氏法測(cè)定血液中葡萄糖的原理；原理；進(jìn)一步熟悉分光光度計(jì)的使用。進(jìn)一步熟悉分光光度計(jì)的使用。吳憲的科學(xué)貢獻(xiàn)吳憲的科學(xué)貢獻(xiàn) 吳憲的博士論文為基礎(chǔ)的一系列工作，為吳憲的博士論文為基礎(chǔ)的一系列工作，為現(xiàn)代臨床血液化學(xué)分析提供了重要的分析現(xiàn)代臨床血液化學(xué)分析提供了重要的分析手段，在國(guó)際上長(zhǎng)時(shí)間被廣泛采用。其中手段，在國(guó)際上長(zhǎng)時(shí)間被廣泛采用。其中關(guān)于血糖測(cè)定的方法被國(guó)際上沿用長(zhǎng)達(dá)關(guān)于血糖測(cè)定的方

2、法被國(guó)際上沿用長(zhǎng)達(dá)70年，為此他被譽(yù)為國(guó)際血液分析的權(quán)威。年，為此他被譽(yù)為國(guó)際血液分析的權(quán)威。 在在20世紀(jì)世紀(jì)20年代以前，測(cè)驗(yàn)血中的非蛋白年代以前，測(cè)驗(yàn)血中的非蛋白氮組分對(duì)病人來(lái)說(shuō)是個(gè)沉重的負(fù)擔(dān)，例如氮組分對(duì)病人來(lái)說(shuō)是個(gè)沉重的負(fù)擔(dān)，例如僅一次尿酸測(cè)定就需耗血僅一次尿酸測(cè)定就需耗血25毫升。而福毫升。而福林林吳的新方法只需吳的新方法只需10毫升就足以進(jìn)行包毫升就足以進(jìn)行包括尿素、肌氨酸、肌氨酸酐、尿酸和糖的括尿素、肌氨酸、肌氨酸酐、尿酸和糖的測(cè)定（其中只需一滴血就能測(cè)定血糖）。測(cè)定（其中只需一滴血就能測(cè)定血糖）。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理磷鉬酸磷鉬酸鉬藍(lán)鉬藍(lán) （藍(lán)色）（藍(lán)色）C6H12O6 +

3、2Cu(OH)2C5H11O5COOH +Cu 2O 3Cu 2O +3H3PO42MoO3 12H2O6CuO +3H3PO4Mo2O3 12H2ONa2CO3H2ONaOH+NaHCO3NaOH+CuSO4=Cu(OH)2+ Na2 SO4堿性銅試劑堿性銅試劑 鉬藍(lán)溶液顯藍(lán)色，其藍(lán)色的深淺與血濾液中葡鉬藍(lán)溶液顯藍(lán)色，其藍(lán)色的深淺與血濾液中葡萄糖的濃度成正比，選用顏色深淺較接近于測(cè)定管萄糖的濃度成正比，選用顏色深淺較接近于測(cè)定管的標(biāo)準(zhǔn)管一同比色，即可求出測(cè)定管中葡萄糖的含的標(biāo)準(zhǔn)管一同比色，即可求出測(cè)定管中葡萄糖的含量。量。 血糖管的使用：血糖管的使用： 血糖管下部的管徑較細(xì)，以避免還原生成的

4、氧血糖管下部的管徑較細(xì)，以避免還原生成的氧化亞銅被空氣中的氧再氧化，降低實(shí)際結(jié)果?；瘉嗐~被空氣中的氧再氧化，降低實(shí)際結(jié)果。鎢酸法鎢酸法 原理：血液中的蛋白質(zhì)在原理：血液中的蛋白質(zhì)在pH小于其等電點(diǎn)時(shí)，可小于其等電點(diǎn)時(shí)，可用鎢酸來(lái)沉淀。鎢酸鈉與硫酸混合產(chǎn)生鎢酸和硫用鎢酸來(lái)沉淀。鎢酸鈉與硫酸混合產(chǎn)生鎢酸和硫酸鈉，游離的鎢酸被，蛋白質(zhì)吸附，形成不溶性酸鈉，游離的鎢酸被，蛋白質(zhì)吸附，形成不溶性的鎢酸蛋白而沉淀，經(jīng)過(guò)濾或離心，除去沉淀即的鎢酸蛋白而沉淀，經(jīng)過(guò)濾或離心，除去沉淀即得無(wú)蛋白的血濾液。得無(wú)蛋白的血濾液。 試劑：試劑： 10%鎢酸鈉溶液；鎢酸鈉溶液；0.333molL硫酸溶液。硫酸溶液。 儀器與

5、器材：錐形瓶、吸管、奧氏吸管、濾紙、儀器與器材：錐形瓶、吸管、奧氏吸管、濾紙、漏斗或離心管及離心機(jī)。漏斗或離心管及離心機(jī)。 方法與步驟：方法與步驟： 取取50ml錐形瓶錐形瓶1只，加入蒸餾水只，加入蒸餾水7份；用奧份；用奧氏吸管吸取抗凝血氏吸管吸取抗凝血l份，擦去管壁外血液，將吸管份，擦去管壁外血液，將吸管插人錐形瓶中水的底部，緩慢地放出血液。放完插人錐形瓶中水的底部，緩慢地放出血液。放完血液后，將吸管提高吸取上清液再吹人，反復(fù)洗血液后，將吸管提高吸取上清液再吹人，反復(fù)洗管管3次。充分混合，使紅細(xì)胞完全溶解；次。充分混合，使紅細(xì)胞完全溶解； 加入加入1/3molL硫酸溶液硫酸溶液1份，隨加隨搖

6、，充分混勻。份，隨加隨搖，充分混勻。此時(shí)血液由鮮紅變成棕色，靜置此時(shí)血液由鮮紅變成棕色，靜置510min，使，使其酸化完全；加入其酸化完全；加入10鎢酸鈉溶液鎢酸鈉溶液1份，邊加份，邊加邊搖，血液由透明變成凝塊狀。當(dāng)振搖到不再產(chǎn)邊搖，血液由透明變成凝塊狀。當(dāng)振搖到不再產(chǎn)生泡沫為止；放置數(shù)分鐘后用定量濾紙過(guò)濾或生泡沫為止；放置數(shù)分鐘后用定量濾紙過(guò)濾或離心除去沉淀，即得完全澄清的無(wú)蛋白血濾液，離心除去沉淀，即得完全澄清的無(wú)蛋白血濾液，供測(cè)定用。供測(cè)定用。 用此法制得的無(wú)蛋白血濾液為用此法制得的無(wú)蛋白血濾液為10倍稀釋的血濾液。倍稀釋的血濾液。即每毫升血濾液相當(dāng)于全血即每毫升血濾液相當(dāng)于全血0.ml

7、，適用于葡萄糖、，適用于葡萄糖、非蛋白氮、尿素氮、肌酸酐和氯化物等的測(cè)定。非蛋白氮、尿素氮、肌酸酐和氯化物等的測(cè)定。三、實(shí)驗(yàn)步驟三、實(shí)驗(yàn)步驟1 1、全血無(wú)蛋白濾液的制備、全血無(wú)蛋白濾液的制備抗凝血抗凝血1ml蒸餾水蒸餾水7ml混勻混勻1/3mol/L硫酸硫酸1ml振搖振搖10%10%鎢酸納鎢酸納1 1ml振搖振搖過(guò)濾過(guò)濾放置放置5 5minmin無(wú)蛋白血濾液無(wú)蛋白血濾液2 2、按表操作、按表操作混勻，置沸水浴中煮混勻，置沸水浴中煮8min。取出用流動(dòng)自來(lái)水冷卻取出用流動(dòng)自來(lái)水冷卻3min無(wú)蛋白血濾液無(wú)蛋白血濾液蒸餾水蒸餾水標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖應(yīng)用液標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖應(yīng)用液堿性銅試劑堿性銅試劑空白管空白管標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)

8、準(zhǔn)管測(cè)定管測(cè)定管1.01.02.02.01.01.01.01.0- - - -1.01.0- -2.02.02.02.02.02.0血糖管血糖管試劑試劑ml磷鉬酸試劑磷鉬酸試劑2.02.02.02.02.02.01 1：4 4磷鉬酸溶液磷鉬酸溶液加至加至混勻后放置混勻后放置2 2min12.512.512.512.512.512.53 3、比色測(cè)定、比色測(cè)定 將各管顛倒混勻后，用空白管調(diào)零，在將各管顛倒混勻后，用空白管調(diào)零，在420420nm處處測(cè)定吸收度。測(cè)定吸收度。四、操作注意四、操作注意1、等水沸騰后，才能放入血糖管。加熱要準(zhǔn)確、等水沸騰后，才能放入血糖管。加熱要準(zhǔn)確8分鐘。分鐘。2、冷

9、卻時(shí)切不可搖動(dòng)血糖管，以免還原的氧化亞銅被、冷卻時(shí)切不可搖動(dòng)血糖管，以免還原的氧化亞銅被空氣中的氧再氧化，降低實(shí)際結(jié)果。空氣中的氧再氧化，降低實(shí)際結(jié)果。3、加入磷鉬酸后迅速比色。、加入磷鉬酸后迅速比色。4、分光光度計(jì)的使用。、分光光度計(jì)的使用。五、結(jié)果計(jì)算五、結(jié)果計(jì)算測(cè)定管吸收度測(cè)定管吸收度標(biāo)準(zhǔn)管吸收度標(biāo)準(zhǔn)管吸收度 葡萄糖葡萄糖（mg/100ml ）0.10.1 1000.10.1 六、分析討論六、分析討論=1、分光光度計(jì)的原理、分光光度計(jì)的原理 分光光度計(jì)是根據(jù)物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收來(lái)分光光度計(jì)是根據(jù)物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收來(lái)測(cè)量微量物質(zhì)濃度的儀器，具有靈敏度、準(zhǔn)測(cè)量微量物質(zhì)濃度的儀器，具有靈敏度

10、、準(zhǔn)確度高，操作方便、快速等特點(diǎn)。其工作原確度高，操作方便、快速等特點(diǎn)。其工作原理為光的吸收定律（朗伯理為光的吸收定律（朗伯比爾定律）：一比爾定律）：一束單色光束單色光(強(qiáng)度為強(qiáng)度為I0)通過(guò)某吸光物質(zhì)的溶液通過(guò)某吸光物質(zhì)的溶液時(shí)，其光能量的被吸收與該物質(zhì)濃度的關(guān)系時(shí)，其光能量的被吸收與該物質(zhì)濃度的關(guān)系符合朗伯符合朗伯比爾定律，即當(dāng)入射光波長(zhǎng)、溫比爾定律，即當(dāng)入射光波長(zhǎng)、溫度和溶液的厚度一定時(shí)，吸光度與溶液的濃度和溶液的厚度一定時(shí)，吸光度與溶液的濃度成正比。度成正比。 用公式表示為： T = II0 則 A = lg（1T） =Kbc 式中 T 透光率 I 透過(guò)光強(qiáng)度 I0 入射光強(qiáng)度 A 吸

11、光度 K 比例常數(shù) b 溶液的厚度 c 溶液的濃度 7200分光光度計(jì)分光光度計(jì)分光光度計(jì)的組成分光光度計(jì)的組成分光光度計(jì)種類(lèi)很多，一般包括光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和指示器分光光度計(jì)種類(lèi)很多，一般包括光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和指示器五大部件組成。五大部件組成。1.光源：光源： 是一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源光強(qiáng)是一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源光強(qiáng)度應(yīng)大，有良好的穩(wěn)定性，在整個(gè)光譜區(qū)域內(nèi)光的強(qiáng)度不應(yīng)隨波長(zhǎng)有度應(yīng)大，有良好的穩(wěn)定性，在整個(gè)光譜區(qū)域內(nèi)光的強(qiáng)度不應(yīng)隨波長(zhǎng)有明顯的變化。明顯的變化。2.單色器：?jiǎn)紊鳎?將來(lái)自光源的光按波長(zhǎng)的長(zhǎng)短順序分散為

12、單色光并能隨意改變波將來(lái)自光源的光按波長(zhǎng)的長(zhǎng)短順序分散為單色光并能隨意改變波長(zhǎng)的一種分光部件，包括入口狹縫、色散元件、出口狹縫和準(zhǔn)直鏡四長(zhǎng)的一種分光部件，包括入口狹縫、色散元件、出口狹縫和準(zhǔn)直鏡四部分組成。部分組成。 3. 吸收池：吸收池： 又稱(chēng)為比色皿或比色杯等。常用吸收池是用無(wú)色透明、耐腐蝕的又稱(chēng)為比色皿或比色杯等。常用吸收池是用無(wú)色透明、耐腐蝕的玻璃或石英材料制成，前者用于可見(jiàn)光區(qū)，后者用于紫外光區(qū)，吸收玻璃或石英材料制成，前者用于可見(jiàn)光區(qū)，后者用于紫外光區(qū)，吸收池光程池光程0.110cm不等，其中以不等，其中以1cm為最多。為最多。 4.檢測(cè)器：檢測(cè)器： 檢測(cè)器的作用是檢測(cè)通過(guò)溶液后的

13、光強(qiáng)度、并把光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信檢測(cè)器的作用是檢測(cè)通過(guò)溶液后的光強(qiáng)度、并把光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。常見(jiàn)的檢測(cè)器有硒光電池、光電管和光電倍增管，后二者主要用號(hào)。常見(jiàn)的檢測(cè)器有硒光電池、光電管和光電倍增管，后二者主要用于分光光度計(jì)。于分光光度計(jì)。5.指示器：指示器： 常用儀器指示器有光點(diǎn)檢流計(jì)、微安表、記錄器和數(shù)字顯示器等。常用儀器指示器有光點(diǎn)檢流計(jì)、微安表、記錄器和數(shù)字顯示器等。光點(diǎn)檢流計(jì)和微安表指示器的標(biāo)尺上刻有百分透光度（光點(diǎn)檢流計(jì)和微安表指示器的標(biāo)尺上刻有百分透光度（T%）和吸光度）和吸光度A。7200型分光光度計(jì)使用方法型分光光度計(jì)使用方法1 1準(zhǔn)備準(zhǔn)備 l 在接通電源前，應(yīng)對(duì)儀器的安全性進(jìn)行檢

14、查，電源在接通電源前，應(yīng)對(duì)儀器的安全性進(jìn)行檢查，電源線、接線應(yīng)牢固，接地線通地要良好，各個(gè)調(diào)節(jié)旋線、接線應(yīng)牢固，接地線通地要良好，各個(gè)調(diào)節(jié)旋鈕的起始位置應(yīng)該正確。鈕的起始位置應(yīng)該正確。l 通電：通電：指示燈亮，指示燈亮， 儀器自檢，預(yù)熱儀器自檢，預(yù)熱20min; l 用鍵設(shè)置測(cè)試方式用鍵設(shè)置測(cè)試方式:透射比透射比(T),吸光度吸光度(A),已知標(biāo)樣已知標(biāo)樣濃度方式濃度方式(C)和已知標(biāo)樣濃度斜率和已知標(biāo)樣濃度斜率(K)方式方式; l 波長(zhǎng)選擇：用波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕設(shè)置所需的單色光波長(zhǎng)波長(zhǎng)選擇：用波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕設(shè)置所需的單色光波長(zhǎng);放樣順序：打開(kāi)樣品室蓋，在放樣順序：打開(kāi)樣品室蓋，在14號(hào)放置比色皿槽號(hào)

15、放置比色皿槽中，依次放入中，依次放入%T校具校具(黑體黑體)，參比液，樣品液，參比液，樣品液1和和樣品液樣品液2. 容積容積光面對(duì)光面對(duì)準(zhǔn)光路準(zhǔn)光路手握手握毛面毛面 7200型分光光度計(jì)的使用方法型分光光度計(jì)的使用方法2 2校正校正 l 校具校具(黑體黑體)校?！?.000”：將：將%T校具校具(黑體黑體)置入光路，置入光路，在在T方式下按方式下按“%T”鍵，此時(shí)儀器自動(dòng)校正后顯示鍵，此時(shí)儀器自動(dòng)校正后顯示0.000 參比液校參比液校“100”%（T）或）或“0.000”（A）：將參比）：將參比液拉入光路中，按液拉入光路中，按“0A/100%T”鍵調(diào)鍵調(diào)0A/100%T，此時(shí)儀器顯示此時(shí)儀器顯

16、示“BLA”，表示儀器正在自動(dòng)校正，校，表示儀器正在自動(dòng)校正，校正完畢后顯示正完畢后顯示“100”%T或或“0.000”A后，表示校正后，表示校正完畢，可以進(jìn)行樣品測(cè)定。完畢，可以進(jìn)行樣品測(cè)定。該模式下使空白試樣該模式下使空白試樣透光率透光率100%該模式下使空白試該模式下使空白試樣吸光度為樣吸光度為0.000拉動(dòng)滑竿測(cè)定拉動(dòng)滑竿測(cè)定樣品的吸光度樣品的吸光度3.3.測(cè)定測(cè)定 將兩樣品液分別拉入光路中將兩樣品液分別拉入光路中,此時(shí)若在此時(shí)若在“T”方式方式下則可依次顯示樣品的透射比下則可依次顯示樣品的透射比(透光度透光度)若在若在“A”方式方式下，則顯示測(cè)得的樣品吸光度。下，則顯示測(cè)得的樣品吸光

17、度。4 4結(jié)束結(jié)束 測(cè)量完畢，關(guān)閉電源，將各調(diào)節(jié)旋鈕恢復(fù)至初始測(cè)量完畢，關(guān)閉電源，將各調(diào)節(jié)旋鈕恢復(fù)至初始位置。取出吸收池，維持其干凈，不能有液體。比位置。取出吸收池，維持其干凈，不能有液體。比色皿洗凈，晾干，存于專(zhuān)用盒內(nèi)。色皿洗凈，晾干，存于專(zhuān)用盒內(nèi)。5.5.注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：l 使用前，使用者應(yīng)該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和原理，以及各個(gè)使用前，使用者應(yīng)該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和原理，以及各個(gè)旋鈕之功能。儀器接地要良好，否則顯示數(shù)字不穩(wěn)定。旋鈕之功能。儀器接地要良好，否則顯示數(shù)字不穩(wěn)定。l 如果大幅度改變測(cè)試波長(zhǎng)時(shí)，在調(diào)整如果大幅度改變測(cè)試波長(zhǎng)時(shí)，在調(diào)整“00.0”00.0”和和“100”100”

18、后稍后稍等片刻（因光能量變化急劇，光電管受光后響應(yīng)緩慢，需一段等片刻（因光能量變化急劇，光電管受光后響應(yīng)緩慢，需一段光響應(yīng)平衡時(shí)間），當(dāng)穩(wěn)定后，重新調(diào)整光響應(yīng)平衡時(shí)間），當(dāng)穩(wěn)定后，重新調(diào)整“00.0”00.0”和和100”100” 。l 儀器左側(cè)下角有一只干燥劑筒，應(yīng)保持其干燥，發(fā)現(xiàn)干燥劑變儀器左側(cè)下角有一只干燥劑筒，應(yīng)保持其干燥，發(fā)現(xiàn)干燥劑變色應(yīng)立即更新或烘干后再用。色應(yīng)立即更新或烘干后再用。l 儀器停止工作時(shí)，關(guān)掉電源，電源開(kāi)關(guān)需同時(shí)切斷，并罩好儀器儀器停止工作時(shí)，關(guān)掉電源，電源開(kāi)關(guān)需同時(shí)切斷，并罩好儀器l 比色皿的清潔程度比色皿的清潔程度, ,直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果. .不要用手摸比色皿的光不要用手摸比色皿的光滑的表面，更不要用毛刷刷洗比色皿，因此滑的表面，更不要用毛刷刷洗比色皿，因此, ,特別要將比色皿清特別要將比色皿清洗干凈洗干凈. .先用自來(lái)水將用過(guò)的比色皿反復(fù)沖洗先用自來(lái)水將用過(guò)的比色皿反復(fù)沖洗, ,然后用蒸餾水淋然后用蒸餾水淋洗洗, ,倒立于濾紙片上倒立于濾紙片上, ,待干后再收回比色皿盒中待干后再收回比色皿盒中. .必要時(shí)必要時(shí)