生物技術(shù)復(fù)習(xí)資料(完整整理版)

1、生物技術(shù)復(fù)習(xí)資料第一章 基因工程一專業(yè)符號Tetr 四環(huán)素抗性 R/M體系A(chǔ)mpr 氨芐青霉素抗性 pBR322 質(zhì)粒載體M13 單鏈?zhǔn)删w載體 cosmid 科斯質(zhì)粒IPTG 異丙基-D硫代半乳糖苷 DNA ligase DNA連接酶EcoRI 一種限制酶 host 宿主Plasmid 質(zhì)粒 Ori 復(fù)制起始位點(diǎn)vector 載體 cDNA 互補(bǔ)DNAsouthern blot DNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù) MCS 多克隆位點(diǎn)二名詞解釋生物工程bioengineering利用生物有機(jī)體（包括微生物和動、植物）或其組成部分（包括器官、組織、細(xì)胞、細(xì)胞器）和組織成分（包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、酶、多糖、

2、抗體等），形成新的技術(shù)手段來發(fā)展新產(chǎn)品和新工藝的一種技術(shù)體系。也是采用先進(jìn)生物學(xué)和工程學(xué)技術(shù)，有目的、有計劃定向加工制造生物產(chǎn)品的一個新興技術(shù)領(lǐng)域。免疫分析法免疫分析法是利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)檢測各種物質(zhì)（藥物、激素、蛋白質(zhì)、微生物等）的分析方法?；蚬こ讨赴凑杖藗兊囊庠福隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之轉(zhuǎn)入到原先沒有這類分子的宿主細(xì)胞內(nèi)，形成能持續(xù)穩(wěn)定繁殖的新物種。其目的是為人類提供有用產(chǎn)品及服務(wù)。感受態(tài)細(xì)胞能從其周圍攝入DNA的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。同聚物加尾法利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能，將同種核苷酸（dNTP)加到D

3、NA分子單鏈延伸末端的3-OH上。如果在目的基因兩側(cè)加polydA，則在載體兩側(cè)加polydT。長度一般1040個殘基?？梢赃B接任何兩段DNA分子的普遍性方法。原位雜交技術(shù)根據(jù)核酸雜交原理，利用基因探針檢出培養(yǎng)板上重組 轉(zhuǎn)化體菌落位置的技術(shù)稱之為原位雜交技術(shù)。DNA接頭它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。 標(biāo)記營救SV40 DNA為載體的取代克隆方式又分為早期基因區(qū)域取代及晚期基因區(qū)域取代兩種類型。晚期基因區(qū)域取代方式是以外源性DNA片段取代晚期基因區(qū)域，構(gòu)成的重組DNA在宿主中可以復(fù)制，但不能產(chǎn)生重組病毒顆粒，因而采用早期基因缺失的SV40

4、病毒突變種作為輔助病毒與晚期取代重組DNA或和感染宿主，則晚期區(qū)域取代重組DNA可獲得標(biāo)記營救，輔助病毒產(chǎn)生的晚期基因產(chǎn)物與重組病毒的早期基因產(chǎn)物一起可形成完整病毒顆粒。早期區(qū)域取代方式是以外源性DNA片段取代早期基因區(qū)域，但重組DNA形成病毒顆粒與早期區(qū)域基因產(chǎn)物T抗原供應(yīng)有關(guān)，故同樣可采用晚期基因區(qū)域缺失的SV40突變種作為輔助病毒進(jìn)行標(biāo)記營救，即可形成完整病毒顆粒。R/M體系大多數(shù)的細(xì)菌對于噬菌體的感染都存在一些功能性障礙，即所謂的寄主控制的限制(restriction)和修飾(modification)現(xiàn)象，簡稱R/M體系。銜接物指用化學(xué)方法合成的一段由1012個核苷酸組成，具有一個或

5、數(shù)個限制酶識別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸段片斷。同尾酶雖來源各異，識別的靶子序列也各不相同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端的限制性內(nèi)切酶，稱為同尾酶。 基因文庫是將基因組DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機(jī)地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。啟動子啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確的結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。轉(zhuǎn)化Transformation自然的轉(zhuǎn)化是指將攜帶某種遺傳信息的DNA分子引入宿主細(xì)胞，通過同源重組作用獲得具有新遺傳性狀的生物細(xì)胞的過程，基因工程操作中的轉(zhuǎn)化是泛指將重組D

6、NA轉(zhuǎn)入宿主中的方法。多克隆位點(diǎn)DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個限制內(nèi)切酶的單一識別位點(diǎn)。能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案?；匚慕Y(jié)構(gòu)雙鏈DNA中含有的二個結(jié)構(gòu)相同、方向相反的序列稱為反向重復(fù)序列，也稱回文結(jié)構(gòu)。同裂酶識別順序與切割方式均相同的限制性內(nèi)切酶。安慰誘導(dǎo)物能高效誘導(dǎo)酶的合成，但又不被所誘導(dǎo)的酶分解的分子，如，IPTG是一種乳糖類似物，再無乳糖的條件下，他可以誘導(dǎo)細(xì)胞合成半乳糖苷酶。因此，IPTG被稱為半乳糖苷酶的安慰誘導(dǎo)物。銜接物連接法（linker）將銜接物的5末端和待克隆的DNA片段的5末端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后通過T4DNA連接酶的作用使兩者

7、連接起來，接著用適當(dāng)?shù)南拗泼赶咩暯游锏腄NA分子和載體分子，由此使兩者都產(chǎn)生出彼此互補(bǔ)的粘性末端。DNA接頭法（adaptor）當(dāng)DNA接頭的平末端與平末端的外源DNA片段連接后，便會使后者成為具有粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組的方法。插入滅活效應(yīng)在基因工程早期使的某些載體(如pBR322)，這些載體本身有兩個或更多個抗生素抗性基因和分布適宜的酶，即位點(diǎn)。用適當(dāng)?shù)拿柑幚鞤NA及載體，進(jìn)行重組，即將外源DNA插入到某一抗性基因中，而使該基因失去抵抗某抗生素的表型。DNA-蛋白質(zhì)篩選法是用來專門檢測同DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子的一種方法。這種方法能用于篩選并分離表達(dá)融合的克隆。合成這

8、種融合蛋白的重組DNA分子中的外源DNA編碼一種能專門同某一特定DNA序列結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)（DNA binding protein）。蛋白質(zhì)工程是指通過蛋白質(zhì)化學(xué)、晶體學(xué)和動力學(xué)的研究，獲取關(guān)于蛋白質(zhì)物理、化學(xué)等各方面的信息，在此基礎(chǔ)上，對編碼該蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行有目的的改造，并通過基因工程等手段將其進(jìn)行表達(dá)和分離純化，最終得到比天然蛋白質(zhì)更好的產(chǎn)物。三填空題基因工程載體的必備條件：1、具有有效運(yùn)載能力2、攜帶外源性目的基因前后在宿主內(nèi)功能自主復(fù)制3、在宿主內(nèi)能控制外源基因表達(dá)活動4、鑒定方便，裝卸手續(xù)簡單5、能攜帶大小不同的外源性目的基因、載體分子量要小,運(yùn)載能力要大6、容易控制、安全可

9、靠、穩(wěn)定性好常用的將重組DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的方法：細(xì)菌轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染、高壓電穿孔法、聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、磷酸鈣或DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體法、細(xì)胞核的顯微注射法、激光打孔技術(shù)、基因槍法基因工程基本步驟：1、獲得目的基因2、在體外獲得形成重組DNA分子。3、將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，并與之一起增殖。4、從大量細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得重組DNA分子的宿主細(xì)胞克隆。5、從這些篩選出來的宿主細(xì)胞克隆中，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究用。6、將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。E.c

10、oli表達(dá)系統(tǒng)中常用的強(qiáng)啟動子：Lac、Trp、PL、PR 1）lac啟動子2）trp 啟動子3）tac啟動子目的基因制備方法：一、基因分離的物理方法；二、鳥槍法(Shot gun) 又稱霰彈法；三、cDNA文庫的建立與基因的分離；四、基因組文庫法；五、基因的化學(xué)合成；六、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）外源基因在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)的關(guān)鍵因素：一、有效的轉(zhuǎn)錄起始；二、mRNA的穩(wěn)定性；三、有效地翻譯啟始；四、遺傳密碼應(yīng)用的偏倚性；五、 mRNA的加工；六、 mRNA序列上終止密碼的選擇；七、表達(dá)質(zhì)?？截悢?shù)及穩(wěn)定性；八、外源蛋白的穩(wěn)定性PCR主要步驟：1、高溫變性：2、低溫退火：3、適溫延伸常用的克隆

11、載體：細(xì)菌質(zhì)粒（Col E1質(zhì)粒載體、pSC101質(zhì)粒載體、pBR322、pUC質(zhì)粒載體）、病毒DNA、噬菌體DNA噬菌體DNA和柯斯載體(cosmid)及單鏈DNA噬菌體載體(M13)DNA片段的連接方法：一、DNA連接酶和T4DNA連接酶；二、粘性末端DNA片段的連接（連接酶的作用）；三、平末端DNA片段的連接（同聚物加尾法、銜接物連接法、DNA接頭連接法）真核病毒載體的優(yōu)點(diǎn)：（常用的有SV40病毒載體及昆蟲桿狀病毒載體。）1、有很高的拷貝數(shù)；2、強(qiáng)大的啟動子，可保證外源基因的高效表達(dá)；3、可保證糖基化。四問答題基因獲得的方法有哪些？各有哪些特點(diǎn)？一、基因分離的物理方法：人們通過控制溶解溫

12、度使富A=T區(qū)解鏈變性，而富GC區(qū)仍維持雙鏈。當(dāng)利用單鏈核酸酶S，酶去除解開的單鏈部分，得到富GC區(qū)的DNA片段 。二、鳥槍法(Shot gun)又稱霰彈法：鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離，優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，命中率較高。缺點(diǎn)：盲目性大，陽性片段不一定正好是基因，樣本多，可能會漏。三、cDNA文庫的建立與基因的分離：最關(guān)鍵的特征是它只包括在特定的組織或細(xì)胞類型中已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRNA的那些基因序列，局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)；細(xì)菌或原核生物的mRNA半衰期很短；mRNA在細(xì)胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難；僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因,沒有內(nèi)含子，不能用于真核表達(dá)

13、。四、基因組文庫法：從基因組文庫所分離獲得的基因序列包含有內(nèi)含子，因此不能直接在原核細(xì)胞中表達(dá)，但更適合作為如轉(zhuǎn)基因動物等的真核表達(dá)系統(tǒng)。五、基因的化學(xué)合成：優(yōu)點(diǎn)1、可以合成細(xì)菌偏愛的密碼子2、可以定向改變個別氨基酸3、可以在兩端加上需要的限制酶切點(diǎn)4、可以通過自動化儀器合成。六、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）優(yōu)點(diǎn)：1、操作簡單；2、通用性好；3、成功率高cDNA文庫的建立有哪些步驟?1、分離表達(dá)目的基因的組織或細(xì)胞。2、從組織和細(xì)胞中制備總RNA和mRNA3、第一條cDNA鏈的合成4、第二條cDNA鏈的合成5、cDNA上接頭的加入6、雙鏈cDNA與載體的連接7、從眾多的重組體中篩選出特定的基因限

14、制酶命名原則是什么?屬名（大寫）+種名（小寫）+株名+分離序號外源基因在宿主細(xì)胞高效表達(dá)的關(guān)鍵問題及其解決方案一、有效的轉(zhuǎn)錄起始與基因的高效表達(dá)：選擇強(qiáng)的可調(diào)控的啟動子；二、mRNA的穩(wěn)定性與基因高效表達(dá)：1、利用RNase缺失的受體菌，2、mRNA的5端與3端的正確加工，提高mRNA的穩(wěn)定性；三、有效地翻譯啟始與基因的高效表達(dá)：1、首選AUG為起始密碼子；2、正確的SD序列；3、 SD序列與起始密碼子之間的距離以9±3為宜；4、除SD序列外，處于起始密碼5端的核苷酸應(yīng)為A和U；5、如果在起始密碼AUG后的序列是GCAU或AAAA，能使翻譯效率提高；6、在翻譯起始區(qū)周圍的序列應(yīng)不形成

15、明顯的二級結(jié)構(gòu)。四、遺傳密碼應(yīng)用的偏倚性與基因高效表達(dá)：不同表達(dá)系統(tǒng)中，使用偏倚性密碼，尤其對于基因編碼序列的5端使用偏倚性密碼，能有效提高表達(dá)效率。五、 mRNA的加工與基因高效表達(dá)：絕大多數(shù)較高等的真核基因含有內(nèi)含子，這些內(nèi)含子在mRNA的加工過程中，在細(xì)胞核中被加工去除而產(chǎn)生成熟的mRNA。但許多哺乳動物類細(xì)胞中外源基因的表達(dá)需要內(nèi)含子存在，如果在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)外源基因時，最好用基因組基因而非cDNA。六、 mRNA序列上終止密碼的選擇：1、首選UAA；2、用一串連的終止密碼，而不是只是一個終止密碼，以保證翻譯有效終止。七、表達(dá)質(zhì)粒拷貝數(shù)及穩(wěn)定性與基因高效表達(dá)：一般來講，質(zhì)?？截悢?shù)多，

16、基因表達(dá)水平高；質(zhì)粒穩(wěn)定性高，表達(dá)好。八、外源蛋白的穩(wěn)定性與基因高效表達(dá)：1、通過組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白；2、產(chǎn)生可分泌的蛋白質(zhì)；3、以包含體的形式表達(dá)；4、選擇合適的宿主表達(dá)系統(tǒng)。假如用大腸桿菌生產(chǎn)人的-珠蛋白，必須經(jīng)過幾個基本步驟分離獲得-珠蛋白的基因組成重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選陽性克隆陽性克隆大量增殖分離提純目的蛋白1）獲得目的基因2）在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能自我復(fù)制并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。3）將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，并與之一起增殖。4）從大量細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得重組DNA分子的宿主細(xì)胞克隆。5）從這些篩選出來的宿主

17、細(xì)胞克隆中，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究用。6）將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。平末端DNA片段的連接有哪些方法，各有什么特色？1、同聚物加尾法是由美國斯坦福大學(xué)的P.Labban和D.Kaiser1972年發(fā)展起來的，可以連接任何兩段DNA分子的普遍性方法。原理：利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能，將同種核苷酸（dNTP)加到DNA分子單鏈延伸末端的3-OH上。如果在目的基因兩側(cè)加polydA，則在載體兩側(cè)加polydT。長度一般1040個殘基。缺點(diǎn)：插入的片段難以回收。無法控制外源基因

18、插入方向。2、銜接物（linker)連接法所謂銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由1012個核苷酸組成，具有一個或數(shù)個限制酶識別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸段片斷。將銜接物的5末端和待克隆的DNA片段的5末端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后通過T4DNA連接酶的作用使兩者連接起來，接著用適當(dāng)?shù)南拗泼赶咩暯游锏腄NA分子和載體分子，由此使兩者都產(chǎn)生出彼此互補(bǔ)的粘性末端。優(yōu)點(diǎn)：克隆后還可回收原插入片斷。缺點(diǎn)：如果待克隆的DNA片段或基因的內(nèi)部也含有與所加的銜接物相同的限制位點(diǎn)，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把所克隆的基因切成不同的片段，從而對后繼的亞克隆及其他操作造成麻煩。3、DNA

19、接頭(adaptor)連接法DNA接頭是由美國康奈爾大學(xué)吳瑞博士于1977年發(fā)明的，它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當(dāng)它的平末端與平末端的外源DNA片段連接后，便會使后者成為具有粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。問題：各個DNA接頭分子的粘性末端之間，會通過互補(bǔ)堿基間的配對作用，形成如同DNA銜接物一樣的二聚體分子，失去接頭的本來意義?？朔姆椒ㄊ菍?末端的磷酸修飾移去，其結(jié)果為暴露出的5-OH所取代。如此一來，雖然兩個接頭分子粘性末端之間仍具有互補(bǔ)堿基配對的能力，但終因DNA連接酶無法在5-OH和3OH之間形成磷酸二酯鍵而不會產(chǎn)

20、生出穩(wěn)定的二聚體分子。蛋白質(zhì)工程的主要步驟有哪些？1、分離純化需改造的目的蛋白2、了解其一級結(jié)構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)，了解其結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系3、獲取編碼該蛋白的基因序列4、設(shè)計改造方案5、對基因序列進(jìn)行改造6、將經(jīng)過改造的基因序列重組入表達(dá)載體，進(jìn)行表達(dá)7、分離純化表達(dá)產(chǎn)物，并對其功能進(jìn)行檢測第二章 微生物工程一、 專業(yè)符號1.BOD 生化需氧量 2.COD 化學(xué)需氧量 3.UV 紫外線4.FN 快中子 5.PEG 聚乙二醇 6.EDTA乙二胺四乙酸7.GSH 谷胱甘肽 8.MFA 代謝通量分析 9.MCA 代謝控制分析二、 名詞解釋微生物工程（Microbial Engineering）微生物工程又稱為

21、發(fā)酵工程，是一門利用微生物的生長和代謝活動來生產(chǎn)各種有用物質(zhì)的工程技術(shù)，是生物工程的重要組成部分。自然選育它是利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)變異，通過分離、篩選，排除劣質(zhì)性狀的菌株，選擇出維持原有生產(chǎn)水平或具有更優(yōu)良生產(chǎn)性能的高產(chǎn)菌株誘變育種利用誘變劑處理微生物群體，使其中部分細(xì)胞的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起微生物性狀發(fā)生改變，然后從群體中篩選出目的菌株的過程葡萄糖效應(yīng)又稱葡萄糖阻遏或分解代謝產(chǎn)生阻遏作用。葡萄糖或某些容易利用的碳源，其分解代謝產(chǎn)物阻遏某些誘導(dǎo)酶體系編碼的基因轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象。 生理酸性物質(zhì)：經(jīng)微生物代謝后能形成酸性物質(zhì)的無機(jī)N源生理堿性物質(zhì)：經(jīng)微生物代謝后能形成堿性物質(zhì)的無機(jī)N

22、源前體:在抗生素生物合成中，菌體用來構(gòu)成抗生素分子而本身結(jié)構(gòu)又沒有顯著改變的物質(zhì)生長因素廣義說，凡是微生物生長不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì)都稱為生長因子(又稱生長素)，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等；狹義說，生長素僅指維生素。誘變劑用來處理微生物并能提高生物體突變頻率的物理或化學(xué)因素，稱為誘變因索，又稱誘變劑。三類：物理、化學(xué)、生物誘變劑。基因突變： DNA鏈上的一對或少數(shù)幾對堿基發(fā)生改變引起可遺傳的突變?；蛑亟M：（Gene recombination）兩個不同性狀個體的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一個體細(xì)胞內(nèi)，并經(jīng)過基因的重新組合后，造成菌種變異，形成新的遺傳型個體的方式。原生質(zhì)體融合：用脫壁酶將微生物細(xì)胞

23、壁除去，制成原生質(zhì)體，再用聚乙二醇(PEG)促進(jìn)原生質(zhì)體發(fā)生融合，從而獲得融合子，它保持原細(xì)胞的一切活性原生質(zhì)體的再生：在再生培養(yǎng)基上使失去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體重新長出細(xì)胞壁來表型變異：微生物在生活條件改變時，發(fā)生暫時的形態(tài)生理特性的改變，但隨著環(huán)境條件的復(fù)原，他們又恢復(fù)了原有的特性，是不可遺傳的代謝工程代謝工程 是一門利用分子生物原理系統(tǒng)分析代謝網(wǎng)絡(luò)、并通過DNA重組技術(shù)合理設(shè)計細(xì)胞代謝途徑及遺傳修飾，進(jìn)而完成細(xì)胞特性改造的應(yīng)用性學(xué)科次級代謝產(chǎn)物：微生物生長到一定階段才產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，對該微生物生理功能和生長非必需的物質(zhì)，如抗生素、毒素、激素等初級代謝產(chǎn)物：微生物通過代謝活動所產(chǎn)生的自身

24、生長和繁殖所必需的物質(zhì)，例如氨基酸、核苷酸和多糖之類的物質(zhì)。三、填空題1、微生物產(chǎn)品的下游加工過程包括（發(fā)酵液的預(yù)處理）、（初步提?。?、（高度純化）、（成品加工）。2、發(fā)酵工業(yè)中常用的滅菌方法包括（加熱滅菌法）、（輻射滅菌法）、（介質(zhì)過濾除菌法）、（化學(xué)滅菌法）。3、發(fā)酵過程中監(jiān)控的化學(xué)參數(shù)主要有（PH）、（基質(zhì)濃度）、（溶解氧濃度）、（氧化還原電位）、（產(chǎn)物濃度）、（廢氣中氧濃度）、（廢氣中CO2濃度）和（ ）。4、誘變育種中使用的誘變劑分為（物理誘變劑）、（生物誘變劑）和（化學(xué)誘變劑）。四、問答題1、 常見的菌種保藏方法有哪些?（1）斜面低溫保藏法（2）液體石蠟封藏法（3）甘油冷凍保藏法（

25、4）冷凍干燥保藏法（5）液氮超低溫保藏法（6）其他干燥保藏法2、 發(fā)酵過程中產(chǎn)生泡沫會帶來哪些不利因素，常用的消沫方法有哪幾種？不利因素：培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的泡沫與微生物的生長和合成酶有關(guān)，泡沫的持久存在影響著微生物對氧的吸收；妨礙二氧化碳的排除，因而破壞其生理代謝的正常進(jìn)行，不利于發(fā)酵；由于泡沫大量生成，致使培養(yǎng)液的容量一般只能等于種子罐容量的一半左右，大大影響了設(shè)備的利用率，甚至發(fā)生跑料，招致染菌，造成巨大損失。消泡方法：機(jī)械法 化學(xué)法。 泡沫的控制除了添加消泡劑外，改進(jìn)培養(yǎng)基成分也是相輔相成的一個重要方面。3、發(fā)酵培養(yǎng)基由哪些成分組成？發(fā)酵培養(yǎng)基都必須提供微生物生長繁殖和產(chǎn)物合成所需的能源，

26、包括碳源、氮源、無機(jī)元素、生長因子及水、氧氣等。對于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，除考慮上述微生物的需要外，還必須重視培養(yǎng)基原料的價格和來源。 4、培養(yǎng)基按照組成物質(zhì)來源可分為哪兩種，各自具有什么特點(diǎn)？（1）天然培養(yǎng)基是采用化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分還不恒定的各種植物和動物組織或微生物的浸出物、水解液等物質(zhì)(例如牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、蛋白胨等)制成的。適合于各類異養(yǎng)微生物生長，而一般自養(yǎng)微生物都不能生長。（2）合成培養(yǎng)基是用化學(xué)成分和數(shù)量完全了解的物質(zhì)配制而成的。成分精 確，重復(fù)性強(qiáng)，可以減少不能控制的因素。適用于在實(shí)驗(yàn)室范圍作有關(guān)營養(yǎng)、代謝、分類鑒定、生物測定及選育菌種、遺傳分析等定量研究工作。但一般微

27、生物在合成培養(yǎng)基上生長較慢，有些微生物營養(yǎng)要求復(fù)雜，在合成培養(yǎng)基上不能生長。5、下游處理過程分為那幾個步驟？相應(yīng)的分離方法有哪些？下游加工過程（down stream processing）:從微生物發(fā)酵液中分離、精制生物產(chǎn)品的過程。包括：發(fā)酵液預(yù)處理、初步純化、高度純化（精制）、成品加工預(yù)處理：過濾提取：吸附法、沉淀法、溶媒萃取法、離子交換法精制：鹽析法、交換樹脂脫色、活性炭脫色、結(jié)晶、重結(jié)晶、晶體洗滌、蒸發(fā)濃縮、層析凝膠分離、無菌過濾和干燥等6、簡單敘述原生質(zhì)融合的步驟。1）標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗(yàn)證。2）原生質(zhì)體制備。3）等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合。4）涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。

28、5）選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗(yàn)證，挑取融合子進(jìn)一步試驗(yàn)、保藏。6）生產(chǎn)性能篩選。7、原生質(zhì)體制備過程中，加入滲透壓穩(wěn)定劑的作用是什么，常用的穩(wěn)定劑有哪些？等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護(hù)原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機(jī)物和KCl和NaCl等無機(jī)物8、原生質(zhì)融合過程中PEG和Ca2+分別起什么作用？表面活性劑聚乙二醇及 Ca2*、Mg2*等陽離子，使融合頻率出現(xiàn)突破性提高。PEG分子量從1000到12000，融合時多用4000和6000兩種。9、原生質(zhì)體融合育種過程中，雜種菌株的篩選要注意什么？融合子的選擇主要依靠兩個親本的選擇

29、性遺傳標(biāo)記，在選擇性培養(yǎng)基上，通過兩個親本的遺傳標(biāo)記互補(bǔ)而挑選出融合子。但是由于原生質(zhì)體融合后會產(chǎn)生兩種情況：一是真正融合，即產(chǎn)生雜合二倍體或單倍重組體，二是暫時融合，形成異核體。兩個均可在選擇培養(yǎng)基上生長，前者較穩(wěn)定而后者不穩(wěn)定，會分離成親本類型，有的甚者可以以異核狀態(tài)移接幾代。因此，必須在融合體再生后，進(jìn)行幾代自然分離、選擇，才能確定是否獲得了真正融合子10、誘變育種中使用的化學(xué)誘變劑根據(jù)作用方式分為哪幾類？烷化劑：氮芥、乙烯亞胺、亞硝基胍 它們與DNA堿基起反應(yīng)，引起堿基配對的轉(zhuǎn)換而發(fā)生遺傳變異堿基類似物：它們摻入DNA分子中而導(dǎo)致遺傳變異，例如5-BU、5-FU移碼誘變劑：吖啶黃、吖啶

30、橙等，它們可插入DNA雙螺旋的鄰近堿基對中，造成剪輯的插入和缺失，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和翻譯的移碼突變11、在發(fā)酵過程中引起溶解氧異常下降的常見原因有哪些？1）污染好氣性雜菌，大量的溶氧被消耗2）菌體代謝發(fā)生異?，F(xiàn)象，需氧要求增加3）某些設(shè)備或工藝控制發(fā)生故障或變化12、代謝網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)是什么？可以分為幾類？微生物代謝網(wǎng)絡(luò)中的途徑的交叉點(diǎn)(代謝流的集散處)叫做節(jié)點(diǎn)(node)，微生物自動抵制節(jié)點(diǎn)處代謝物流量分配比率的改變的特性叫做節(jié)點(diǎn)的剛性。節(jié)點(diǎn)的剛性取決于微生物代謝的自動調(diào)節(jié)機(jī)制。如果某個代謝流的擾動對其下游代謝流未能造成可觀察的影響，那么就可以認(rèn)為該處的節(jié)點(diǎn)對上游擾動的反應(yīng)是剛性（Rigid）的，與之

31、相反的情況則稱為柔性（Fluxible）。 第三章 酶工程一、專業(yè)符號及名詞解釋1. NADPH還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸2. DEAE二乙氨乙基葡聚糖3. DNP二硝基苯酚4. error prone PCR 易錯PCR從單一基因出發(fā)，通過改變PCR反應(yīng)條件，在基因擴(kuò)增過程中使堿基配對出現(xiàn)錯誤而引起基因突變。5. DNA shuffling DNA改組又稱為DNA改組技術(shù)，是從2種以上同源正突變基因出發(fā)，用酶（DNaseI）切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。6. IU 酶活力國際單位1個酶活力國際單位是指在特定條件下，1mi

32、n內(nèi)生成1mol產(chǎn)物的酶量（或轉(zhuǎn)化1mol 底物的酶量）。7. Katal 酶活力單位 在最適條件下，每秒鐘可使1MOL底物轉(zhuǎn)化的酶量，1KAT=6*107IU8. 酶工程酶工程（Enzyme engineering）是指通過化學(xué)方法、酶學(xué)方法和DNA重組技術(shù)改善自然酶的形成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，提高酶的催化活性、降低成本并在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。9. 酶的活力單位 在最適條件下，單位時間內(nèi)，酶催化的底物的減少量或產(chǎn)物的生成量10.酶的比活力純度的在量度，指每毫克質(zhì)量的蛋白質(zhì)中所含的某種酶的催化活力，一般用單位/毫克蛋白（U/mg蛋白質(zhì)表示）。酶的比活力越高，酶的純度也就越高。11.固定化酶固定化酶

33、是指限制或固定于特定空間位置的酶，具體來說，是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。12.固定化細(xì)胞將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細(xì)胞固定化技術(shù)。固定化細(xì)胞就是被限制自由移動的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理化學(xué)因素的約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具有能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。13.固定化酶的操作半衰期在連續(xù)測定條件下，固定化酶（細(xì)胞）的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷時間，以t1/2表示。14.固定化酶的偶聯(lián)效率15.固定化酶的活力回收率固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶（細(xì)胞）所顯示的活力占被固定的等當(dāng)量游離酶(細(xì)胞）總

34、活力的百分?jǐn)?shù)。16.固定化酶的相對活力 17.酶反應(yīng)器 以酶（游離酶或固定化酶）作為催化劑進(jìn)行酶促反應(yīng)所需的設(shè)備成為酶反應(yīng)器。18.酶分子的化學(xué)修飾酶的化學(xué)修飾，就是在分子水平上對酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變，以達(dá)到改構(gòu)和改性的目的（側(cè)鏈基團(tuán)的取代、肽鏈的限制性水解、分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)）。19.生物傳感器使用固定化的生物分子(immobilized biomolecules),與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)換能器結(jié)合，用于快速偵測物理、化學(xué)、生物量的新型器件。20.酶的非水相催化 酶在非水相（也稱非水介質(zhì)）中也具備催化活性，可以在含有多種有機(jī)介質(zhì)和微量水分的非水介質(zhì)中發(fā)揮催化作用，并且具有催化活力、選擇性和穩(wěn)定性上表

35、現(xiàn)出與常規(guī)水溶性介質(zhì)中截然不同的催化性能。21.抗體酶抗體酶 或催化抗體（Catalytic antibody)是一種新型人工酶制劑，是一種具有催化功能的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。它是利用現(xiàn)代生物學(xué)與化學(xué)的理論與技術(shù)交叉研究的成果，是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。22.極端微生物又稱嗜極菌，是可以（或者需要）在“極端”環(huán)境中生長繁殖的生物，大多數(shù)極端菌屬于古細(xì)菌。二、填空題1.酶分子的化學(xué)修飾的具體方法包括（主鏈修飾）、（側(cè)鏈基團(tuán)修飾）、（化學(xué)交聯(lián)修飾）、（大分子結(jié)合修飾）、（親和標(biāo)記修飾）、（基因修飾）、（與輔因子相關(guān)的修飾）和（ ）。2.抗體酶的制備方法有（誘

36、導(dǎo)法）、（引入法）、（拷貝法）、和（抗體庫法）。3. 1961年國際生物化學(xué)聯(lián)合會酶學(xué)委員會根據(jù)反映類型，將酶類分為（氧化-還原酶）、（水解酶）、（轉(zhuǎn)移酶）、（連接酶）、（裂合酶）、（異構(gòu)酶）。三、問答題1.酶有什么特性？什么是酶工程？酶是由生物體內(nèi)活細(xì)胞產(chǎn)生的一種生物催化劑，按化學(xué)組成的不同主要分為核酸類酶（R酶）和蛋白質(zhì)類酶（P酶）。催化效率高 專一性強(qiáng) 反應(yīng)條件溫和 催化活性受到調(diào)節(jié)和控制酶工程（Enzyme engineering）是指通過化學(xué)方法、酶學(xué)方法和DNA重組技術(shù)改善自然酶的形成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，提高酶的催化活性、降低成本并在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。2.常用的固定化酶的方法有哪幾

37、種，試對各種方法進(jìn)行綜合比較 （右圖）3.固定化酶的偶聯(lián)效率的測定方法有哪幾種？殘留法（測定未結(jié)合酶量）水解法（水解結(jié)合的酶并測含量）4.影響固定化酶反應(yīng)動力學(xué)的因素有哪幾種？空間效應(yīng)（包括構(gòu)象和屏蔽） 擴(kuò)散效應(yīng) 分配效應(yīng)5.常用的固定化酶的活力測定方法有幾種？分批測定法 連續(xù)測定法6.與天然酶相比，固定化酶具有哪些優(yōu)點(diǎn)？具有生物催化劑的功能，又有固相 催化劑的功能。可重復(fù)使用，降低成本；反應(yīng)后，酶底物產(chǎn)物易分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易純化，產(chǎn)品質(zhì)量高。穩(wěn)定性提高，反復(fù)使用多次后，酶的活力無明顯下降；反應(yīng)條件易于控制，可以自動控制，節(jié)約勞動力。7.與固定化酶相比，固定化細(xì)胞具有哪些優(yōu)點(diǎn)？固定化活細(xì)

38、胞的優(yōu)越性l無需進(jìn)行酶的分離和純化，減少酶的活力損失，同時大大降低了成本；l保持了酶的原始狀態(tài)，比固定化酶的穩(wěn)定性更高，對污染的抵抗力更強(qiáng)；l細(xì)胞本身含多酶系統(tǒng)，可催化一系列反應(yīng)，且不需添加輔助因子；l細(xì)胞生長停滯時間短，細(xì)胞多，反應(yīng)快等。缺點(diǎn)Ø必須保持菌體的完整，需防止菌體的自溶，否則影響產(chǎn)物的純度；Ø必須抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對目的酶的分解；Ø胞內(nèi)多酶的存在，會形成副產(chǎn)物；Ø載體、細(xì)胞膜或細(xì)胞壁會造成底物滲透與擴(kuò)散的障礙等。8.酶的抑制劑按照抑制作用方式分為哪幾類?競爭性抑制 競爭酶的活性中心結(jié)合位點(diǎn)非競爭性抑制 競爭活性位點(diǎn)以外的酶的部位反競爭性抑制 與

39、ES復(fù)合物結(jié)合9.酶分子定向進(jìn)化的原理是什么？在待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用Taq DNA聚合酶不具有35校對功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變文庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。定向進(jìn)化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+定向選擇。前者是人為引發(fā)的，后者雖相當(dāng)于環(huán)境，但只作用于突變后的分子群，起著選擇某一方向的進(jìn)化而排除其他方向突變的作用，整個進(jìn)化過程完全是在人為控制下進(jìn)行的。10.酶分子的親和標(biāo)記物分為哪兩類，各自具有什么特點(diǎn)？Ks型抑制劑：根據(jù)底物的結(jié)構(gòu)設(shè)計的，具有和底物結(jié)構(gòu)相

40、似的結(jié)合基團(tuán)，同時還具有能和活性部位氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)的活性基團(tuán)，導(dǎo)致酶不可逆失活。特點(diǎn)：底物，競爭性抑制劑等對修飾有保護(hù)作用。Kcat:根據(jù)催化過程設(shè)計的，具有酶的底物性質(zhì)，還有一個潛在的反應(yīng)基團(tuán)，在酶催化下活化后，不可逆的抑制酶的活性部位。Kcat型也稱為“自殺性抑制劑”，可以用來治療某些疾病的藥物。11.按照操作方式，酶反應(yīng)器可以分為哪幾類，各自具有什么特點(diǎn)？間歇式攪拌罐反應(yīng)器：這類反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡單，造價較低，傳質(zhì)阻力很小，反應(yīng)能迅速達(dá)到穩(wěn)態(tài)，主要應(yīng)用在飲料和食品工業(yè)中。其缺點(diǎn)是操作麻煩，在反復(fù)回收過程中固定化酶容易損失，所以工業(yè)規(guī)模的固定化酶很少采用。常用于游離酶。連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)

41、器優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)液混合良好，各部位的成分相同，并與流出液的組成也一致。連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器的開放結(jié)構(gòu)使得調(diào)換固定化酶比較容易，而且有利于控制溫度和調(diào)節(jié)pH，還能夠處理膠態(tài)或不溶性底物，受底物抑制的固定化酶采用連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器有較高的轉(zhuǎn)化率。缺點(diǎn)：由攪拌產(chǎn)生的剪切力較大，易打碎磨損固定化酶顆粒。需改良的連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器。填充床反應(yīng)器：流化床反應(yīng)器反應(yīng)時，底物溶液以足夠大的流速，從反應(yīng)器底部向上通過固定化酶柱床，便能使固定化酶顆粒始終處于流化狀態(tài)。其混合程度介于連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器的全混型和填充床的平推流型之間。由于反應(yīng)器內(nèi)混合程度高，因此，傳熱、傳質(zhì)情況良好，可處理粘性大、含有固體顆粒的底物

42、。連續(xù)攪拌罐-超濾膜反應(yīng)器：連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器/連續(xù)攪拌罐適用于顆粒較細(xì)的固定化酶、游離酶和細(xì)胞以及小分子產(chǎn)物與大分子底物。循環(huán)式反應(yīng)器：循環(huán)操作仍能為底物與酶提供足夠的接觸機(jī)會，以達(dá)到所需的轉(zhuǎn)化率。這種反應(yīng)器可用于難溶或者不溶性底物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。 12.與天然酶相比，抗體酶的優(yōu)點(diǎn)有哪些？1）抗體酶可經(jīng)過精確的設(shè)計，專一性的催化某一底物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)，而天然酶通過突變修飾也很困難2）抗體酶可以催化那些理論上認(rèn)為非常不利的反應(yīng)3）抗體酶可以催化天然酶不能催化的反應(yīng)13.抗體酶的制備方法有哪些？ l誘導(dǎo)法：即用設(shè)計好的半抗原，通過間隔鏈與載體蛋白（例如牛血清白蛋白等）偶聯(lián)制成抗原，然后采用標(biāo)準(zhǔn)的單克隆

43、抗體來制備、分離、篩選抗體酶。l引入法（抗體結(jié)合部位修飾法將催化基團(tuán)或輔助因子引入到抗體的抗原結(jié)合部位，可采用選擇性化學(xué)修飾方法，亦可利用蛋白質(zhì)工程和基因工程技術(shù)l拷貝法用酶作為抗原免疫動物得到抗酶的抗體，再將此抗體免疫動物并進(jìn)行單克隆化，獲得單克隆的抗抗體。對抗抗體進(jìn)行篩選，應(yīng)獲得具有原來酶活性的抗體酶。缺點(diǎn)：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能產(chǎn)生新酶。l抗體庫法用基因克隆技術(shù)，將全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)克隆出來，重組到原核表達(dá)載體。通過大腸桿菌直接表達(dá)有功能的抗體分子片段，從中篩選特異性的可變區(qū)基因。第四章 動物細(xì)胞工程一 專業(yè)符號1 DMSO ：二甲基亞砜2 HGPRT¯ ：次

44、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型 3 TK¯：胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型4 HAT：含一定濃度的次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T）的一種選擇性培養(yǎng)基5 MTT：四唑鹽6 McAb：單克隆抗體7 PEG：聚乙二醇 8 Hela：供體患者的姓名，來源于宮頸癌9 CHO：中國地(倉)鼠卵細(xì)胞二 名詞解釋1 動物細(xì)胞工程：是按照人們預(yù)定的設(shè)計，根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)及工程學(xué)原理定向改造動物細(xì)胞遺傳性，創(chuàng)造新物種，通過工程化為人類提供名貴藥品及服務(wù)的技術(shù)。2 錨地依賴性（貼壁依賴性）：大多數(shù)動物細(xì)胞只能附著或貼在固體或半固體表面上培養(yǎng)才能生長的特性為貼壁依賴性，此細(xì)胞稱為錨著依存性細(xì)胞。3 接

45、觸抑制性：指當(dāng)細(xì)胞長滿附著物表面，相鄰細(xì)胞表面間相互接觸，使細(xì)胞對數(shù)生長期停止進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞生長大大減慢，細(xì)胞生長、死亡處于動態(tài)平衡的特性?？勺鳛閰^(qū)別正常細(xì)胞與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。4 動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：將動物機(jī)體的細(xì)胞或某一部分組織取出一小塊，在體外經(jīng)過表面消毒處理后，使其分散成單個游離的細(xì)胞，并放置在人工配制的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，使之生長、分裂、繁殖的技術(shù)。5 組織塊培養(yǎng)法：將動物組織切成直徑12mm³ 立方小塊，放在盛有培養(yǎng)基的玻璃或塑料培養(yǎng)器皿中，待組織塊粘著后，沿底面平面移動生長進(jìn)行培養(yǎng)的方法。6 細(xì)胞單層培養(yǎng)法：動物組織塊經(jīng)過機(jī)械方法或酶解法消化分散成單個細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊后，粘附

46、于培養(yǎng)容器表面培養(yǎng)成新生細(xì)胞單層的培養(yǎng)法，其過程包括組織塊分散及培養(yǎng)。7 單細(xì)胞分離培養(yǎng)：即細(xì)胞克隆培養(yǎng)，是將動物組織分散后，將一個單細(xì)胞從一個群體中分離出來單獨(dú)培養(yǎng)，使之重新繁衍稱為一個新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。8 原代細(xì)胞培養(yǎng)（初代培養(yǎng)）：是指直接從機(jī)體取材（細(xì)胞、組織或器官）或經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，將其分散成細(xì)胞后置于體外合適條件下生長到第一次傳代。9 傳代培養(yǎng)：當(dāng)初代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞相互匯合而鋪滿瓶底時，細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶經(jīng)消化、收集、稀釋后，轉(zhuǎn)移一部分初代培養(yǎng)物到新的培養(yǎng)瓶，細(xì)胞才能繼續(xù)生長的過程稱為傳代培養(yǎng)，常用酶消化法傳代。 10 飼養(yǎng)細(xì)胞：在細(xì)

47、胞培養(yǎng)中加入的活細(xì)胞（如小鼠胸腺細(xì)胞或腹腔細(xì)胞），能夠促進(jìn)單個或少數(shù)分散細(xì)胞的生長增殖，其本身無分裂能力，克隆形成后，本身死亡。 11 動物細(xì)胞融合：在外界因素作用下，兩個或兩個以上異源動物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞互相合并為一個多核細(xì)胞的過程，亦稱動物體細(xì)胞雜交。12 淋巴細(xì)胞雜交瘤：用骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細(xì)胞融合得到雜交瘤細(xì)胞，既能像骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體能力的雜種細(xì)胞。13 動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)：是指在人工條件下，高密度大量培養(yǎng)基因工程、細(xì)胞融合或轉(zhuǎn)化所形成的有用動物細(xì)胞，生產(chǎn)珍貴藥品的技術(shù)，為細(xì)胞工程不可缺少的部分。14

48、McAb：單克隆抗體，只針對某一抗原決定簇的抗體分子。15 微載體培養(yǎng)法：是將細(xì)胞吸附于微載體表面，在培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，使細(xì)胞在微載體表面長成單層的培養(yǎng)方法。16 轉(zhuǎn)基因動物：將某種外源基因?qū)雱游锶旧w基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并穩(wěn)定遺傳給后代的一類動物。 17 基因治療：向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能基因，糾正或補(bǔ)償其基因缺陷，關(guān)閉或抑制異常表達(dá)的基因，表達(dá)新產(chǎn)物達(dá)到治療目的。 三 填空題1 動物細(xì)胞培養(yǎng)基類型：天然培養(yǎng)基、基本合成培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）、完全培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基2 保存動物種質(zhì)細(xì)胞最有效的方法：超低溫冷凍法 超低溫法常用保護(hù)劑：二甲基亞砜DMSO（5%12.5%）、甘油（5%20

49、%）3 細(xì)胞融合及遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移方式有哪些：完整細(xì)胞之間的融合、核體、胞質(zhì)體與完整細(xì)胞的融合、微細(xì)胞與完整細(xì)胞的融合、脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞融合4 雜種細(xì)胞的篩選有哪幾類系統(tǒng)：HAT選擇系統(tǒng)、抗藥性篩選系統(tǒng)、營養(yǎng)互補(bǔ)選擇系統(tǒng)、溫度敏感突變型雜種細(xì)胞選擇系統(tǒng)、基因轉(zhuǎn)化標(biāo)志細(xì)胞的選擇、標(biāo)記基因的特異位點(diǎn)表達(dá)法5 動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有哪些方法：懸浮培養(yǎng)法、固定化培養(yǎng)法、單層靜置貼壁培養(yǎng)法6 動物細(xì)胞所需營養(yǎng)因素：氨基酸（氮源）、 鹽類、 葡萄糖（碳源、功能）、 緩沖系統(tǒng) 、生長因子 、其他成分7 無血清培養(yǎng)基中加入的補(bǔ)充因子：必需因子（細(xì)胞生長因子與激素）、特殊因子如貼壁因子（纖粘連因子、層粘連因子）、蛋白

50、酶抑制劑8 細(xì)胞融合的促融因素：生物促融劑（病毒）、化學(xué)促融劑（PEG）、物理促融劑（電場力、離心力）9 動物細(xì)胞工程研究主要內(nèi)容：動物細(xì)胞工程基礎(chǔ)、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、動物細(xì)胞融合技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)10 生理平衡鹽溶液：Ringer 、PBS 、Earle 、Hanks 、D-Hanks 四 問答題1 淋巴細(xì)胞雜交瘤的形成原理是什么？為什么HAT培養(yǎng)基可用于篩選淋巴細(xì)胞雜交瘤（HAT法具體原理教材p141）？ 用骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細(xì)胞融合得到雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤細(xì)胞既能像骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力，又稱為淋巴

51、細(xì)胞雜交瘤。 HGPRT¯ 或TK¯骨髓瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞融合的雜種細(xì)胞，從兩親本細(xì)胞分別獲得hgprt 或tk基因，可應(yīng)用HAT選擇培養(yǎng)基中的次黃嘌呤H和胸腺嘧啶T，通過補(bǔ)救途徑合成DNA，使雜種細(xì)胞存活下來，而HGPRT¯ 或TK¯骨髓瘤親本細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中死亡，淋巴細(xì)胞不能再體外長期分裂增殖亦逐漸死亡，從而可篩選出淋巴細(xì)胞雜交瘤。2 什么叫McAb？基本特征是什么？ McAb（monoclonal antibody），即單克隆抗體，其基本特征為：專一性強(qiáng)，質(zhì)地均一，檢測靈敏度極高，可通過雜交瘤細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)進(jìn)行生產(chǎn)。3 簡述制備雜交瘤的工藝路線

52、？細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備細(xì)胞融合HAT選擇雜交瘤抗體的檢測雜交瘤的克隆雜交瘤細(xì)胞的凍存單克隆抗體的大量生產(chǎn)單克隆抗體的鑒定 4 動物細(xì)胞培養(yǎng)過程的特點(diǎn)是什么? 動物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大得多，無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度差，適應(yīng)環(huán)境能力差。 倍增時間長，細(xì)胞生長緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時需用抗生素（鏈霉素、青霉素）。 培養(yǎng)過程需氧量少，常采用5% CO2 培養(yǎng)箱。 在機(jī)體中，動物細(xì)胞相互粘連以群體形式存在，在培養(yǎng)過程中有錨地依賴性（貼壁依賴性）、接觸抑制性、密度抑制性等特點(diǎn)。 大規(guī)模培養(yǎng)時，不可套用微生物反應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)。反應(yīng)器應(yīng)密封性好，對pH、溶解氧要求高。 培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的產(chǎn)物分布于細(xì)胞外，反應(yīng)過程成本高，但產(chǎn)

53、品價格昂貴，如疫苗、單抗、生長因子，甚至是細(xì)胞本身。5 雜種細(xì)胞的篩選有哪幾類系統(tǒng)？ 雜種細(xì)胞篩選的原理是將融合混合物于選擇培養(yǎng)基上，終止同型多核、異型多核及未融合親本細(xì)胞的繁殖，而僅允許異型雙核細(xì)胞繁殖的過程。其篩選方法有： HAT選擇系統(tǒng)，為生物化學(xué)選擇法，在HAT選擇培養(yǎng)基上僅有HGPRT¯ 或TK¯骨髓瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞融合的雜種細(xì)胞才能存活，而其兩親本均死亡，從而篩選出雜種細(xì)胞。 抗藥性篩選系統(tǒng)， 利用生物細(xì)胞對藥物敏感性差異篩選雜種細(xì)胞的方法，選擇一種親本細(xì)胞，其生長受藥物A抑制，對藥物B不敏感；選擇另一種親本，其受藥物B抑制，而對藥物A不敏感；當(dāng)將這兩種親本細(xì)胞

54、融合混合物置于含藥物A和B的培養(yǎng)基中時，兩親本細(xì)胞均死亡，唯有融合子雜種細(xì)胞可存活，經(jīng)分離和傳代培養(yǎng)后可篩選出特定雜種細(xì)胞。 營養(yǎng)互補(bǔ)選擇系統(tǒng) 利用兩種親本細(xì)胞營養(yǎng)互補(bǔ)作用原理，如一種親本細(xì)胞為色氨酸缺陷型，另一種親本細(xì)胞為蘇氨酸缺陷型，將這兩種親本細(xì)胞融合混合物置于不含色氨酸及蘇氨酸的培養(yǎng)基中，兩親本細(xì)胞均死亡，唯有融合子雜種細(xì)胞可存活，經(jīng)分離克隆培養(yǎng)后可篩選出雜種細(xì)胞。 溫度敏感突變型雜種細(xì)胞選擇系統(tǒng) 一般的培養(yǎng)細(xì)胞能在3240的范圍內(nèi)生長，但溫度敏感突變型的細(xì)胞能在高溫或低溫下生長，由此篩選雜種細(xì)胞。 基因轉(zhuǎn)化標(biāo)志細(xì)胞的選擇 標(biāo)記基因的特異位點(diǎn)表達(dá)法6 基因工程抗體可以分為哪幾類？主要包括兩大部分： 對已知的單克隆抗體進(jìn)行改造，包括單克隆抗體的人源化即大分子抗體（嵌合抗體、重構(gòu)抗體）小分子抗體（Fab抗體、單鏈抗體、單域抗體、雙特異性抗體、微抗體等）抗體融合蛋白 通過抗體庫的構(gòu)建，使得抗體不需抗原免疫即可篩選并克隆新的單克隆抗體。噬菌體抗體展示技術(shù) 將編碼外源肽或蛋白質(zhì)的DNA片段插入噬菌體的基因組中，然后以融合的形式與噬菌體的外殼蛋白共同表達(dá)于噬菌體表面?？贵w庫技術(shù) 利用基因工程的方法克隆全套抗體可變區(qū)基因并在噬菌體表面表達(dá)，得到多樣性噬菌體抗體的集合即噬菌體抗體庫。第五章 植物細(xì)胞工程一、專業(yè)符號PEG：聚乙二醇 NAA：萘乙