緒論生物工藝學(xué)

1、第一章 緒論生物技術(shù)(biolechnology)生物工程(bioengineering)生物工藝學(xué)一、生物工藝發(fā)展史1古代傳統(tǒng)生物工藝公元前6000年，蘇美爾人和巴比倫人開始制作啤酒公元前2000年，中國人已會釀造良酒公元前221年，中國人已懂得制醬、釀醋，制作豆腐公元10世紀(jì)，中國就有預(yù)防天花的活疫菌2中世紀(jì)后的生物工藝1680年，劉文虎克（Leenvenhoek）制成顯微鏡，首先觀察到了微生物1860年代，巴斯德（pasteur）證實(shí)酒樓發(fā)酵是由酵母菌引起的，由此建立了純種培養(yǎng)技術(shù)。1897年，巴克萊（Buchner）發(fā)現(xiàn)磨碎的酵母仍能使糖發(fā)酵而形成酒精，并稱有發(fā)酵能力的物質(zhì)為酶。19世

2、紀(jì)末20世紀(jì)2030年代，出現(xiàn)發(fā)酵工業(yè)，產(chǎn)品有：丙酮丁醇、乳酸、酒精、檸檬酸、淀粉酶、蛋白酶等。19世紀(jì)40年代，抗生素的生產(chǎn)發(fā)展起來，青霉素從淺層，低效到深層通氣，高效的發(fā)展，大大提高了單位效價，純度和產(chǎn)量。隨后鏈霉素，新霉素相繼問世。1950年代，氨基酸工業(yè)出現(xiàn)1960年代，酶制劑工業(yè)出現(xiàn)，有機(jī)酸工業(yè)出現(xiàn)3現(xiàn)代生物技術(shù)主要是以DNA重組技術(shù)和原生質(zhì)體融合技術(shù)為代表的新興技術(shù)。1973年，S.Cohen小組開創(chuàng)了體外重組DNA并成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌的先例，隨后基因工程問世，按人類的意志將外源基因在體外與截體DNA嵌合，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之形成能復(fù)制和表達(dá)外源基因的克隆。1975年，Kohler及M

3、ilstein發(fā)明了雜交瘤技術(shù)，用淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行原生質(zhì)體融合，獲得在體外培養(yǎng)能產(chǎn)生單一抗體的雜交細(xì)胞。1982年，第一個基因工程產(chǎn)品利用重組體微生物生產(chǎn)的人胰島素終于問世。二、生物反應(yīng)過程生物反應(yīng)過程利用生物催化劑從事生物技術(shù)產(chǎn)品的生產(chǎn)過程見圖生物反應(yīng)過程的四個組成部分：1原料的預(yù)處理及培養(yǎng)基的制備原材料的粉碎、蒸煮、水解、高壓、滅菌等2生物催化劑的制備發(fā)酵過程選擇高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)，培養(yǎng)要求不苛刻的菌種酶反應(yīng)過程選擇一定量的活力強(qiáng)的酶制劑3生物反應(yīng)器及反應(yīng)條件的選擇根據(jù)生物類型的不同，代謝規(guī)律的不一樣，選擇不同的生物反應(yīng)器和反應(yīng)條件。厭氧發(fā)酵靜置發(fā)酵，如酒精、啤酒、丙酮、丁醇、乳酸等，無需

4、通氣，工藝簡單好氧發(fā)酵通氣發(fā)酵，如氨基酸、抗生素、赤霉素等，需通入無菌空氣，以供代謝需要，工藝較復(fù)雜。4產(chǎn)品的分離與純化培養(yǎng)出來的產(chǎn)品需經(jīng)過分離與純化，根據(jù)產(chǎn)品的類型、特點(diǎn)選擇合適的下游技術(shù)來純化產(chǎn)品，如吸附法、溶媒萃取法、離子交換法、沉淀法或蒸餾法等。三、生物工藝過程的共性1如何選擇培養(yǎng)基成份的碳、氮、微量元素及生長因子的比例。2如何合理確定發(fā)酵級數(shù)，各級的培養(yǎng)條件，過程控制的參數(shù)以及菌種的選擇。3如何防止生產(chǎn)過程的雜菌污染。4如何選擇合適的產(chǎn)品提取、分離，純化工藝。四、微生物工業(yè)產(chǎn)品類型1微生物菌體的發(fā)酵這是以獲得具有多種用途的微生物菌體細(xì)胞為目的產(chǎn)品的發(fā)酵工業(yè)。面包，乳酸香菇，冬蟲夏草，

5、靈芝等蘇云金桿菌，蠟樣芽孢桿菌中的伴孢晶體2微生物酶發(fā)酵目前工業(yè)應(yīng)用的酶大多來自微生物發(fā)酵，微生物種類多，產(chǎn)酶品種多，生產(chǎn)容易，成本低。微生物酶制劑有廣泛的應(yīng)用。淀粉酶，糖化酶葡萄糖氨基?；窪L氨基酸光學(xué)拆分膽固醇氧化酶檢測血清中膽固醇含量葡萄糖氧化酶檢測血清中葡萄糖的含量3微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵這是以獲得微生物代謝產(chǎn)物為產(chǎn)品的發(fā)酵工業(yè)，代謝產(chǎn)物可分為兩類初級代謝物氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、核酸等次級代謝物抗生素、生物堿、細(xì)菌素、植物生長因子等第一種是菌體生長所必需，一般在對數(shù)期產(chǎn)生，第二種與菌體生長無關(guān)，一般在穩(wěn)定期產(chǎn)生。4微生物的生物轉(zhuǎn)化這是利用微生物細(xì)胞的一種或多種酶，作用于一些化合物的特定

6、部位（基因），使它轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相似但有更大經(jīng)濟(jì)價值的化合物的一種生化反應(yīng)。該反應(yīng)終產(chǎn)物不是細(xì)胞代謝產(chǎn)生，而是微生物細(xì)胞的酶系作用而形成，細(xì)胞的作用只是相當(dāng)于生物催化劑。如，甾體的轉(zhuǎn)化5微生物的特殊機(jī)能的利用1）消除環(huán)境污染2）保持生態(tài)平衡3）進(jìn)行金屬的浸瀝回收4）利用基因工程菌開拓發(fā)酵工程新領(lǐng)域第二章 生物工業(yè)菌種與種子的擴(kuò)大培養(yǎng)第一節(jié) 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物及要求一、工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物1細(xì)菌（bacteria）細(xì)菌是自然界分布最廣，數(shù)量最多的一類微生物。屬單細(xì)胞原核生物，以二分裂方式繁殖。見圖片工業(yè)常用的細(xì)菌有：枯草芽孢桿菌淀粉酶醋酸桿菌醋酸棒狀桿菌氨基酸短桿菌肌苷酸2酵母菌（yeast）自然

7、界中普遍存在，主要分布于含糖較多的酸性環(huán)境中，單細(xì)胞真核生物見圖片工業(yè)常用的酶母菌有：啤酒酵母釀酒假絲酵母制作面包類酶母脂肪酶3霉菌（mould）：指那些菌絲體較發(fā)達(dá)又不產(chǎn)生大型子實(shí)體的絲狀真菌。大量存在于土壤、空氣、水生物體內(nèi)外等地方，喜歡偏酸好氧的環(huán)境見圖片工業(yè)常用霉菌有：根霉多種酶制劑毛霉抗生素犁頭霉有機(jī)酸紅曲霉甾體激素曲霉青霉4 放線菌（actinomycetes）：原核生物 主要以無性孢子進(jìn)行繁殖也可借菌絲片段進(jìn)行繁殖大量存在于含有豐富有機(jī)質(zhì)的微堿性土壤中，主要用于生產(chǎn)抗生素，微生物中60%的抗生素是放線菌生產(chǎn)的，如：鏈霉素紅霉素金霉素慶大霉素5擔(dān)子菌或菇類（basidiomycet

8、es, mushroom）多用于食用菇的生產(chǎn)，以及近生發(fā)現(xiàn)的抗癌類物質(zhì)1，-葡萄糖苷酶等的生產(chǎn)。6藻類（alga）是自然界分布極廣的一類自養(yǎng)型微生物，常用于工業(yè)生產(chǎn)的有：螺旋藻珊列藻可用于制作保健食品，還可將CO2轉(zhuǎn)化為石油等單胞藻二、微生物工業(yè)對菌種的要求1原料廉價，生長迅速，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高2易于控制培養(yǎng)條件，酶活性高，發(fā)酵周期較短3抗雜菌和噬菌體的能力強(qiáng)4菌種遺傳性能穩(wěn)定，不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素，保證安全生產(chǎn)。第二節(jié) 工業(yè)微生物菌種的衰退、復(fù)壯與保藏一、微生物菌種的衰退1菌種衰退的原因原因主要有三個方面：一是菌種保藏不妥，二是菌種生長的條件要求沒有得到滿足，或遇

9、到不利的條件，或是失去某些需要的條件；三是誘變得來的新菌株發(fā)生回復(fù)突變。1）菌種連續(xù)傳代是菌種發(fā)生退化的直接原因。突變概率為10-810-92）采用保藏效果較差的方法和條件，以及保藏操作不當(dāng)，菌種就較易發(fā)生退化。3）菌種的回復(fù)突變也會使已獲得的優(yōu)良性狀退化和消失回復(fù)突變變異菌株因遺傳組成的自身修復(fù)，使原有的遺傳障礙解除，代謝途徑發(fā)生變化，從而恢復(fù)原有的特性。回復(fù)突變的原因：a)發(fā)生不完全突變：DNA雙鏈中僅有一條鏈發(fā)生點(diǎn)突變。b)產(chǎn)生異核菌絲：對具有兩個核以上細(xì)胞的菌株，如果只有一個或幾個核發(fā)生變異，會形成性狀不同的菌絲。c)菌落不純：菌落中只有一個高產(chǎn)突變的孢子或細(xì)胞，菌落不是由一個孢子或細(xì)

10、胞組成。2菌種性能的改變1）菌種遺傳特性的改變a)異核現(xiàn)象導(dǎo)致微生物群體發(fā)生變異：鄰近菌絲細(xì)胞間發(fā)生吻合，或個別核發(fā)生變異而產(chǎn)生。b)自發(fā)突變導(dǎo)致菌種遺傳特性改變：DNA發(fā)生改變。c)回復(fù)突變或產(chǎn)生分離子：使菌種群體中形成具有不同基因型的個體。2）菌種生理狀況的改變a)菌種是一個不純的群體，其中變異株所占的比例決定該菌種的特性。b)菌種培養(yǎng)基可通過影響菌種的生理狀況而影響發(fā)酵產(chǎn)量。3防止菌種衰退的措施1）盡量減少傳代次數(shù)。2）菌種的分離：分離出其中未衰退的菌體3）菌種的復(fù)壯：這是指一種廣義的復(fù)壯，在菌種的生產(chǎn)性能尚未衰退前就經(jīng)常有意識地進(jìn)行純種分離測定，使之生產(chǎn)性能逐步提高。4）提供良好的環(huán)境

11、條件：進(jìn)行合理傳代，只用三代內(nèi)的菌種，采用培養(yǎng)條件有利于高產(chǎn)菌，不利于低產(chǎn)菌。5）用優(yōu)良的保藏方法：盡可能采用斜面冰箱保藏，真空冷凍干燥，干孢子保藏等。6）定期純化菌種，對菌種進(jìn)行定期的分離純化，可減少其中共存的自發(fā)突變或突變不完全株，保持原來的優(yōu)良特性。二、菌種的復(fù)壯這指的是一種狹義的復(fù)壯，當(dāng)菌種已經(jīng)發(fā)生衰退后怎樣進(jìn)行復(fù)壯。1）純種分離：通過純種分離，把退化菌種中的一部分仍保持原有典型性狀的單細(xì)胞分離出來，分為兩種方法：菌落純平板劃線法等細(xì)胞純顯微鏡操作法等2）通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯：對于寄主性微生物的退化株，可通過接種到相應(yīng)的昆蟲或動物寄主體內(nèi)以提高其毒性。3）淘汰已衰退的個體；采用改變培養(yǎng)條

12、件，如低溫，高溫或改變營養(yǎng)成份等，使得衰退個體大量死亡，保留未退化的個體。三、菌種保藏1菌種保藏的原理人工創(chuàng)造條件使菌體的代謝活動處于休眠狀態(tài)。·利用菌種休眠體：孢子，芽孢等。·利用休眠狀態(tài)環(huán)境條件：低溫，干燥，隔絕空氣或氧氣，缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等。2菌種保藏方法1）斜面低溫保藏法：保存期約13個月，4，避免水分蒸發(fā)、收縮、板結(jié)、“鹽害”2）液體石蠟封存保藏法在斜面上加入滅菌后的液體石蠟，高出斜面1cm，使菌種與空氣隔絕，4保存，保存期約1年。3）固體曲保藏法根據(jù)傳統(tǒng)制曲原理改進(jìn)而成，適用于產(chǎn)孢子的真菌，可用麥皮、大米、小米或麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為產(chǎn)孢子培養(yǎng)基，使菌種產(chǎn)唾大量休眠體（

13、孢子）后加以保存。該法的要點(diǎn)是控制適當(dāng)水分，低溫或室溫保存，保存期約13年。4）砂土管保藏法用人工法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息，適用于產(chǎn)孢子放線菌，霉菌和產(chǎn)芽孢的細(xì)菌。黃砂和泥土按3:2或1:1比例混合，裝入試管內(nèi)（1cm）滅菌烘干，用無菌水洗下孢子，制成懸液，再與砂土混合。放在低溫干燥的環(huán)境下保存，保存期為1年以上。5）冷凍干燥法原理是在低溫下迅速將細(xì)胞凍結(jié)以保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，然后在真空下使水分升華。細(xì)胞不易發(fā)生死亡和變異，適用于各種微生物，保存期為510年。6）液氮超低溫保藏法微生物在-130以下，新陳代謝停止，可永久性保存微生物菌種。液氮的溫度可達(dá)-196，這是一種理想的微生物保存方法

14、。需要有液氮罐，冰箱設(shè)備。將菌液置于10%甘油或二甲基亞砜保護(hù)劑中，密封于安瓿瓶內(nèi)，放置0，-20，再放入液氮罐中保存，幾乎可以永遠(yuǎn)保存。3菌種保藏的注意事項(xiàng)1）菌種保藏前所處的狀態(tài)選用休眠體，采用新鮮斜面上的生長豐滿的培養(yǎng)物，應(yīng)注意培養(yǎng)溫度，時間等。2）菌種保藏所用基質(zhì)應(yīng)碳源比例少，營養(yǎng)成分貧乏些。3）操作過程對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害凍結(jié)速度應(yīng)迅速，應(yīng)加適量保護(hù)劑，避免形成較大的冰晶，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成機(jī)械損傷。第三節(jié) 工業(yè)微生物菌種的選育菌種選擇的目的是改良菌種的特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。通過菌種選擇，發(fā)酵產(chǎn)量可提高幾十倍，幾百倍，甚至幾千倍。自然選育 菌種選育誘變選育 雜交育種 原生質(zhì)體融合技術(shù)

15、 DNA重組技術(shù)1、 自然選育不經(jīng)過人工誘變處理，包括從自然界分離獲得的菌株根據(jù)菌種的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的過程。1從自然界分離獲得菌株自然界分離新菌種包括四個步驟：采樣、增殖培養(yǎng)、純種分離和性能測定。1）采樣a.根據(jù)篩選目的，確定采樣地點(diǎn)。b.取離地面515cm處的土壤幾十克，放入消毒好的袋中記錄采樣時間、地點(diǎn)、環(huán)境情況等，酶母菌和霉菌在腐殖質(zhì)含量高的土壤中取。2）增殖培養(yǎng)如樣品中含目標(biāo)菌較少，應(yīng)進(jìn)行增殖（富集）培養(yǎng)，即給混合菌群提供有利于目標(biāo)菌株生長或不利于其他菌型生長的條件，促使目標(biāo)菌大量繁殖，便于分離它們。a.控制碳源，生長因子、鹽等b.控制PHc.添加抑制劑d.控制溫度3）純種分離

16、增殖培養(yǎng)后還含有雜菌，需進(jìn)行純種分離，才能獲得純種，一般是采用單菌落分離法。a.平板劃線法b.菌液稀釋法為避免孢子之間的粘連和吻合，可進(jìn)行液體培養(yǎng)，玻璃珠，石英砂振蕩，或加入0.05%的分散劑（Tween 80）4）生產(chǎn)性能的測定初篩采用兩步法復(fù)篩a.初篩：進(jìn)行一些定性或半定量測定b.復(fù)篩：初步進(jìn)行工藝條件摸索c.終試驗(yàn)：選出較優(yōu)菌株13株，進(jìn)行進(jìn)一步生產(chǎn)性能試驗(yàn)和毒性試驗(yàn)等。2從自發(fā)突變體中獲得菌株微生物的自發(fā)突變雖然頻率較低，但也時有發(fā)生，有時也會出現(xiàn)一些優(yōu)良變異菌株，我們通過篩選可將其選出，可以自發(fā)突變的頻率較低，往往滿足不了生產(chǎn)的需求，必須要進(jìn)行人工誘變。自然育種的作用：在工業(yè)生產(chǎn)中可

17、以達(dá)到純化菌種，防止菌種衰退，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高產(chǎn)量的目的。優(yōu)點(diǎn)：純化菌種，防止菌種衰退，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高產(chǎn)量缺點(diǎn)：效率低，進(jìn)展慢，很難使生產(chǎn)水平大幅增加二、誘變育種誘變育種的優(yōu)點(diǎn)：·突變頻率高·變異譜寬·速度快·方法簡便誘變育種主要有兩個環(huán)節(jié)：誘變劑的處理和采用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株。選育的程序有五個步驟：出發(fā)菌株的選擇；菌懸液的制備；前培養(yǎng)；誘變；變異菌株的分離和篩選。1出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株（parent strain）工業(yè)上用來進(jìn)行誘變處理的菌株。出發(fā)株有三類：從自然界分離得到的野生型菌株；通過生產(chǎn)選育，即自發(fā)突變經(jīng)篩選得到的高產(chǎn)株；已經(jīng)誘變過的菌

18、株；先行雜交，再作誘變的出發(fā)株。2菌懸液的制備1）處理前細(xì)胞盡可能達(dá)到同步生長狀態(tài)（選擇法或誘導(dǎo)法）2）一般采用對數(shù)期細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞，或霉菌，放線菌剛剛成熟的孢子3）菌懸液濃度為：真菌孢子或酵母菌為106個/ml，細(xì)菌和放線菌孢子為108個/ml4）細(xì)胞懸液經(jīng)玻璃珠振蕩打散5）用脫脂棉或?yàn)V紙過濾，以達(dá)到單細(xì)胞狀態(tài)3前培養(yǎng)透變處理前，將細(xì)胞在添加嘌呤，嘧啶等堿基或酵母膏的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2060min，再進(jìn)行誘變處理，則可提高誘變率。4誘變凡可提高基因誘變率的物質(zhì)都稱誘變劑，分為物理誘變劑和化學(xué)誘變劑兩種。5變異菌株的分離和篩選誘變處理后，大多屬于負(fù)突變體：需要有有效的篩選方案和方法才能在短時間內(nèi)選

19、出優(yōu)良性能的變異株。篩選一般分為兩個階段：初篩，以量為主，復(fù)篩，以質(zhì)為主。三、誘變育種方案設(shè)計(jì)(一)突變的誘發(fā)1誘變劑接觸DNA分子誘變劑要進(jìn)入細(xì)胞基因所處的狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄期為佳與培養(yǎng)條件有關(guān)2DNA損傷的修復(fù)（以紫外照射為例）微生物有五種修復(fù)DNA損傷的方式1）光復(fù)活作用可見光可激活光復(fù)合酶，與二聚體結(jié)合，從而切除二聚體2）切補(bǔ)修復(fù)在四種酶的協(xié)同作用下可進(jìn)行DNA損傷修復(fù)；內(nèi)切酶、外切酶、DNA多聚酶和DNA連接酶。3）重組修復(fù)重組修復(fù)必須在DNA復(fù)制時進(jìn)行，復(fù)制時在二聚體處留下一個空隙，通過染色劑交換，可將二聚體換掉，然后再補(bǔ)上空缺。4）SOS修復(fù)系統(tǒng)是一種能造成誤差修復(fù)的“呼救信號”修復(fù)系統(tǒng)

20、。在修復(fù)過程中，DNA多聚酶在無模板的情況下進(jìn)行DNA修復(fù)合成，因此容易造成錯差，導(dǎo)致基因突變。5）DNA多聚酶的校正作用DAN多聚酶（I、II、III），除了多功能聚作用外，還具有3到5核酸外切酶作用，可切除不正常核苷酸，達(dá)到校正目的，但DNA多聚酶發(fā)生突變，外切酶活性減弱，菌體的突變率會相應(yīng)提高。該株稱增變突變型，對誘變劑格外敏感。3從前突變到突變誘變前后的處理可影響誘變的效果，有兩方面：1）通過影響與DNA修復(fù)作用有關(guān)的酶活性咖啡堿抑制切補(bǔ)修復(fù)氯霉素抑制白白和酶的合成Ba2+ 抑制DNA多聚酶3外切酶活性2）通過使誘變的基因處于活化狀態(tài)，如復(fù)制或轉(zhuǎn)錄狀態(tài)4從突變到突變型突變基因的出現(xiàn)不等

21、于突變表型的出現(xiàn)，表型改變落后于基因型改變稱為表型遲延，分為分離性遲延和生理性遲延。1）分離性遲延誘變后基因處于不純的狀態(tài)，突變型居于隱性基因，需經(jīng)幾代的復(fù)制、分離，在細(xì)胞中成為純的狀態(tài)才能表達(dá)。2）生理性遲延突變基因成為純合狀態(tài)后，還不一定出現(xiàn)突變表型，必須等到原有基因的產(chǎn)物稀釋到某一程度后才能表現(xiàn)出來。一般要經(jīng)過幾個世代。如抗噬菌體突變的表達(dá)，需經(jīng)歷好幾代后方能表達(dá)。(二)誘變劑的種類及選擇1誘變劑1）物理誘變劑主要為各種射線：紫外線、X射線、r射線、射線、射線和超聲波。紫外光應(yīng)用最廣泛，它的作用光譜正好是核酸的吸收光譜。2）化學(xué)誘變劑種類較多甲基磺酸乙酯（EMS），亞硝基胍，亞硝酸，氮芥

22、等。這些誘變劑能特異地與某些基因起作用，引起物質(zhì)的原發(fā)損傷，從而改變細(xì)胞代謝方式。2誘變效果及選擇亞硝基胍和甲基磺酸乙酯能引起堿基對轉(zhuǎn)換，得到的變異株回變率高電離輻射，紫外線和吖啶類等能引起缺失，移碼等巨大損傷，不易產(chǎn)生回復(fù)突變。偏低劑量處理容易出現(xiàn)正突變，偏高劑量容易出現(xiàn)負(fù)突變，現(xiàn)在一般采用死亡率70%-80%，而不是90%-99%。對遺傳上不穩(wěn)定的菌株采用溫和誘變劑，對遺傳上較穩(wěn)定的株則采用強(qiáng)烈的誘變劑。不應(yīng)采用同一誘變劑反復(fù)處理，但也不應(yīng)頻頻變換誘變劑。(三)出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇是誘變育種成敗的關(guān)鍵。它的性能、系譜、形態(tài)、生理、傳代、保存等特性對誘變效果影響很大。1選擇純種作為出

23、發(fā)菌株：以排除異核體或異質(zhì)體的影響。2選擇出發(fā)株，不僅產(chǎn)量高，而且產(chǎn)孢子早而多，色素少，生長速度快等有利于合成發(fā)酵產(chǎn)物的性狀。3選擇對誘變劑敏感的菌株出發(fā)株；可提高變異頻率，而且高產(chǎn)突變株出現(xiàn)率也高。(四)篩選的方法1制定篩選方案方案主要是制定篩選流程，2營養(yǎng)缺陷型的篩選方法1）再經(jīng)中間培養(yǎng)減少以后出現(xiàn)分離子2）淘汰野生型抗生素法，菌絲過濾法，差別殺菌法，饑餓法3）檢出營養(yǎng)缺陷型逐個測定法，夾層平板法，限量營養(yǎng)法，影印接種法4）確定生長譜確定出缺陷什么樣，是氨基酸、維生素，還是嘌呤，嘧啶缺陷型3突變株的篩選篩選方案如下：出發(fā)菌株誘變處理200株單孢子菌株初篩（測試條件粗放，瓊脂塊法，單個搖瓶法

24、）挑50株復(fù)篩（測試條件提高）挑5株（出發(fā)菌株）誘變處理各挑40株（共200）初篩挑50株復(fù)篩挑5株可再循環(huán)幾次，直到獲得優(yōu)良性能的菌株。初篩后的育種及測定方法可采用以下幾種：1）形態(tài)變異篩選形態(tài)的變異可被觀察到，可作為初篩的一種指標(biāo)，如菌落的大小、光滑度、色澤、透明圈等，可用的方法有：紙牛培養(yǎng)顯色法透明圈法深度梯度法2）隨機(jī)篩選這種方式的特點(diǎn)是隨機(jī)，大量。搖瓶篩選法選出的種菌接種搖瓶，培養(yǎng)測定產(chǎn)量，特點(diǎn)是：與生產(chǎn)條件相近，但量大，時間長，操作復(fù)雜。瓊脂塊法將單菌落連同其生長培養(yǎng)基（瓊脂塊）用打孔器取出，培養(yǎng)后置于鑒定平板測定產(chǎn)量。特點(diǎn)是：簡便，快速，但培養(yǎng)條件不同（固體轉(zhuǎn)液體）篩選自動化和微

25、型化瓶改管，管改孔，培養(yǎng)條件計(jì)算機(jī)控制等，可省工、省時，篩選量大，方便易行。3）理化篩選這是一種運(yùn)用遺傳學(xué)、生物化學(xué)原理，根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能合成途徑，代謝調(diào)控及產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)類設(shè)計(jì)的一些篩選方法。初級代謝產(chǎn)物的篩選利用合成途徑中的反饋?zhàn)瓒艋蚍答佉种圃?，篩選生產(chǎn)氨基酸、核苷酸、維生素等菌株。a. 降低終產(chǎn)物濃度，篩選終產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型見圖2-5，圖2-6這種篩選適合于以下三種情況：·發(fā)酵產(chǎn)物為某一直線合成的中間產(chǎn)物·發(fā)酵產(chǎn)物為某一分枝合成的中間產(chǎn)物·發(fā)酵產(chǎn)物為某一分枝合成的一個終產(chǎn)物b. 篩選抗反饋突變株，獲得結(jié)構(gòu)類似物（代謝物）的抗性突變株·利用與代謝產(chǎn)

26、物類似的化合物處理微生物細(xì)胞，殺死或抑制絕大多數(shù)細(xì)胞，選出能產(chǎn)生該代謝物的抗反饋突變株。·利用回復(fù)突變篩選抗反饋株，獲得非完全的回復(fù)突變株，第二次的誘變使得產(chǎn)物合成酶的調(diào)節(jié)位點(diǎn)改變，而不能與產(chǎn)物結(jié)合，因而不受產(chǎn)物的反饋抑制。次級代謝產(chǎn)物的篩選利用次級代謝途徑與初級代謝途徑之間的關(guān)系篩選次級代謝產(chǎn)物的突變株，主要是一些抗生素高產(chǎn)株。a.利用營養(yǎng)缺陷型篩選當(dāng)某些次級代謝和初級代謝處于同一分枝合成途徑時，篩選初級代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)缺陷型可使相應(yīng)的次級代謝產(chǎn)物增產(chǎn)。例：芳香族氨基酸 莽草酸（中間物）氯霉素如誘變使莽草酸芳香氨基酸合成受阻，可產(chǎn)生大量氯霉素脂肪酸 丙二酰COA（中）制霉菌素四環(huán)素灰

27、黃霉素如誘變使黃二酰COA脂肪酸合成受阻，可產(chǎn)生大量以上抗生素。亮氨酸 -酮基異戊酸（中）頭孢菌素C一般aa營養(yǎng)缺陷不適合工業(yè)發(fā)酵，可將aa缺陷株與生產(chǎn)株或另一種營養(yǎng)缺陷型雜交，或者進(jìn)行回復(fù)突變可得到適合的高產(chǎn)株。b. 篩選負(fù)變株的回復(fù)突變株由于兩次突變都在抗生素合成有關(guān)基因上，動搖了其遺傳基礎(chǔ)，該途徑受酶調(diào)節(jié)的程度往往很低，容易人工控制，并且產(chǎn)量從無到有，或很高，比較容易檢出。c. 篩選出磷酸鹽調(diào)節(jié)的突變磷酸鹽對抗生素生物合成有抑制作用，去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株可消除這種抑制作用以獲得高產(chǎn)，篩選方案如下：孢子懸液誘變劑接種于完全培養(yǎng)基菌落影印發(fā)酵培養(yǎng)基（正常磷酸鹽濃度）打孔機(jī)取單個菌落瓊脂塊浸有高

28、濃度磷酸鹽濾紙上培養(yǎng)挑選菌落直徑（抑菌活力）明顯大于其他（突變株）從影印平板挑取相應(yīng)菌落搖瓶發(fā)酵測定抗生素菜量d. 篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株菌株在快速分解利用碳源時對其他許多代謝途徑中的酶，包括許多抗生素合成酶，有阻遏或抑制作用。篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株，有利于提高抗生素發(fā)酵產(chǎn)量?？刹捎谩捌咸烟切?yīng)”來進(jìn)行篩選。將菌株在含有葡萄糖和組氨酸為唯一氮源的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代，可選出去葡萄糖分解代謝調(diào)節(jié)突變株。能在這種培養(yǎng)基中生長的只有兩種菌株：一組氨酸分解酶發(fā)生了突變，不再受阻遏，二是葡萄糖分解代謝有關(guān)酶發(fā)生突變，不再產(chǎn)生那么多分解代謝阻遏物。后一種是我們需要的。也可利用葡萄糖的毒性結(jié)構(gòu)物質(zhì)來

29、篩選突變株，在培養(yǎng)基中加入半乳糖和毒性物質(zhì)，菌株不能利用毒性物質(zhì)，但可抑制菌利用半乳糖。只有去葡萄糖分解代謝調(diào)節(jié)突變株能夠利用半乳糖進(jìn)行生長。e. 篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株許多抗生素和氨基酸有共同的前體，或有些氨基酸本身可以作為某些抗生素的前體，氨基酸代謝與抗生素的合成有密切聯(lián)系，打破氨基酸代謝調(diào)節(jié)，可導(dǎo)致抗生素的高產(chǎn)。在培養(yǎng)基中加入氨基酸結(jié)構(gòu)類似物，對菌的生長有抑制作用，可以篩選到解除氨基酸反饋調(diào)節(jié)的突變株。從而提高抗生素前體的量，進(jìn)一步提高抗生素產(chǎn)量。例： 類似物賴氨酸 -氨基己二酸青霉素f. 篩選二價金屬離子抗性突變株加入能和產(chǎn)物（抗生素）或其中間體結(jié)合的二價金屬離子（生長抑制劑）

30、，當(dāng)達(dá)到一定濃度時，抗生素低產(chǎn)株不生長，而高產(chǎn)株能幸存，因?yàn)樾纬纱罅慨a(chǎn)物或中間體能與二價離子結(jié)合，以解除其毒性。因此，可篩選出高產(chǎn)株。例：桿菌肽能和二價金屬離子結(jié)合，具有輸送二價離子進(jìn)出細(xì)胞功能，當(dāng)在培養(yǎng)基中加入硫酸亞鐵時，能選出桿菌肽高產(chǎn)株。該株能將二價離子送出胞外，解除毒性。g. 篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株前體或前體結(jié)構(gòu)類似物對某些抗生素生產(chǎn)菌的生長有抑制作用，且可抑制抗生素的合成，篩選對前體或前體結(jié)構(gòu)類似物的抗性突變株，可以消除其對菌的生長及其抗生素合成的抑制作用，提高產(chǎn)量。h. 篩選自身所產(chǎn)的抗生素抗性突變株生產(chǎn)菌株對其自身所產(chǎn)的抗生素耐受能力不同，高產(chǎn)株的耐受力大于低產(chǎn)菌株。

31、因此，可用自產(chǎn)的抗生素來篩選高產(chǎn)菌株。(五) 突變基因的表現(xiàn)突變基因的遺傳特性改變了，其培養(yǎng)條件也應(yīng)作出相應(yīng)的改變，高產(chǎn)菌株篩選出來后，要進(jìn)行最佳發(fā)酵條件的研究，使高產(chǎn)基因能在生產(chǎn)規(guī)模下得以最好的表達(dá)。第四節(jié) 生產(chǎn)菌種的改良誘變育種可獲得高產(chǎn)菌株，但不能達(dá)到定向育種的目的，一些現(xiàn)代的生物技術(shù)可達(dá)到改良，定向育種的目的，這些技術(shù)主要有雜交育種，原生質(zhì)體融合，DNA重組。一、常規(guī)雜交育種以青霉菌雜交育種（準(zhǔn)性生殖）為例：見圖2-71遺傳標(biāo)記選擇有一定遺傳標(biāo)記的親本菌株進(jìn)行雜交，便于雜交后的篩選。標(biāo)記通常有營養(yǎng)缺陷型，抗藥性突變型等。2異核體的形成完全培養(yǎng)基混合培養(yǎng)法親本A(a-)親本B(b-)孢子

32、孢子液體完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12天挑出菌絲體生理鹽水洗滌3次撕碎基本培養(yǎng)基平板培養(yǎng)7天長出異核體菌絲異核體具有來自親本的兩種遺傳物質(zhì)，能夠互補(bǔ)營養(yǎng)，因此能生長在基本培養(yǎng)基上。3雜合二倍體的形成雜合二倍體是雜交育種的關(guān)鍵，雜合二倍體不僅具有雜種特性，并隨著染色體間的重組分離，能形成更多類型雜種。異核體自發(fā)形成雜合二倍體的頻率很低，必須人為的提高其頻率，常用方法有：提高異核體培養(yǎng)溫度，紫外線照射異核體，樟腦蒸氣熏異核體4染色體交換和單倍化雜合二倍體在細(xì)胞分裂過程中偶然發(fā)生染色體交換和單倍化，可形成親本和重組型兩種分離子，如用誘變劑處理則分離子的重組類型會增加，雜交的目的是為了獲得重組型分離子。2、 原生

33、質(zhì)體融定義：把兩個親本的細(xì)胞壁分別使用生物酶制劑酶解，使菌體細(xì)胞在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包裹的球狀體（即原生質(zhì)體）。在融合劑聚乙二醇（PEG）的作用下，；兩親本的原生質(zhì)體在高深條件下混合，使其相互聚集發(fā)生質(zhì)配和核配，基因組由接觸到交換，從而實(shí)現(xiàn)遺傳重組。原生質(zhì)體融合是一項(xiàng)新的生物技術(shù)，能使重組頻率大大提高，可使來自不同菌株的多種優(yōu)良性狀通過遺傳重組，組合到一個重組菌株中。步驟一般有：標(biāo)記菌株的篩選，原生質(zhì)體的制備，原生質(zhì)體的融合，融合子的選擇，實(shí)用性菌株的篩選等。原生質(zhì)體融合育種主要步驟如下：選擇兩個有特殊價值并帶有選擇性遺傳標(biāo)記的細(xì)胞作為親本，在高滲透壓溶液中，用適當(dāng)脫壁酶去除細(xì)胞壁，

34、剩下的是由細(xì)胞膜包裹的原生質(zhì)體。這時原生質(zhì)體對溶液和培養(yǎng)基的滲透壓非常敏感，必須在高滲透壓或等滲透壓的溶液或培養(yǎng)基中才能維持生存，在低滲透壓溶液中將會破裂而死亡。兩種不同的原生質(zhì)體在高滲透壓條件下混合，在聚乙二醇和Ca2+作用下，發(fā)生細(xì)胞膜融合，PEG是一種脫水機(jī)，由于脫水作用，原生質(zhì)體開始聚集收縮，相鄰的原生質(zhì)體融合的大部分面積緊密接觸。開始原生質(zhì)體融合僅在接觸部位的一小塊區(qū)域，形成細(xì)小的原生質(zhì)體，繼而逐漸變大導(dǎo)致兩個原生質(zhì)體融合。Ca2+可提高融合效率。在融合時兩親本基因組由接觸到交換，從而實(shí)現(xiàn)遺傳重組，再生的細(xì)胞菌落中就有可能獲得具有理想狀態(tài)的重組菌株。1標(biāo)記菌株的篩選供融合用的兩個親株

35、要求性能穩(wěn)定并帶有遺傳標(biāo)記，以利于融合子的選擇：標(biāo)記一般為營養(yǎng)缺陷型和抗藥性。一般用多種抗生素（或其它藥物）以梯度平板法進(jìn)行粗選，再用具有抗性的抗性生物制備不同濃度的平板，進(jìn)行細(xì)選。2 原生質(zhì)體的制備菌體的預(yù)處理 菌體的培養(yǎng)時間 酶濃度 酶解溫度與時間 滲透壓穩(wěn)定劑應(yīng)采用適當(dāng)?shù)陌谌芙饷福喝芫讣?xì)菌，放線菌蝸牛酶，纖維素酶酵母菌和霉菌影響原生質(zhì)體制備的因素主要有以下幾個方面：1）菌體的預(yù)處理使用脫壁酶前，先用某些化合物對菌體進(jìn)行預(yù)處理，比較有利于原生質(zhì)體的制備，使細(xì)胞壁對酶的敏感性增加。EDTA（乙二胺四乙酸）金屬鰲合劑，避免金屬離子對酶的抑制作用甘氨酸代替丙氨酸參與肽聚糖合成，干擾肽聚糖的相

36、互交聯(lián)。青霉素干擾肽聚糖肽糖肽橋的形成D-環(huán)絲氨酸干擾肽聚糖park核苷酸的形成2）菌體的培養(yǎng)時間選擇對數(shù)生長期后期的菌體進(jìn)行酶處理，這時的細(xì)胞生長代謝旺盛，胞壁對酶解作用最敏感，原生質(zhì)體的形成率高，再生率也高。3）酶濃度酶濃度過高導(dǎo)致再生率降低，過低則不利于原生質(zhì)體形成一般采用原生質(zhì)體形成率和再生率之乘積達(dá)到最大時的酶濃度（最適酶濃度）4）酶解溫度一般控制在20-405）酶解時間需要給予充足的酶解時間是形成原生質(zhì)體的必要條件，但過長會使再生率降低，因?yàn)槊笇?xì)胞膜會造成損傷。6）滲透壓穩(wěn)定劑原生質(zhì)體對滲透壓很敏感，必須在高滲透壓或等滲透壓的溶液中才能生存，需采用一些滲透壓穩(wěn)定劑。蔗糖，丁二酸鈉

37、細(xì)菌，放線菌兇梨醇，甘露醇酵母菌KCl，NaCl霉菌濃度一般為：0.30.8mol/L一定濃度的Ca2+，Mg2+等二價陽離子可增加原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性。3原生質(zhì)體的融合與再生將兩個親本的原生質(zhì)體混合，在融合劑PEG和Ca+作用下，兩個原生質(zhì)體就會發(fā)生融合。影響原生質(zhì)體融合的因素有：菌體的前處理，菌體的培養(yǎng)時間，融合劑的濃度，融合劑作用時間，陽離子濃度，融合溫度，融合PH等，這些都需要根據(jù)不同的菌株來進(jìn)行測試。融合后必須再生建立胞壁，才能成為一個無性繁殖系。影響再生的因素有：菌種自身的再生性能，原生質(zhì)體制備的條件，再生培養(yǎng)基成份，再生培養(yǎng)條件等，檢查原生質(zhì)形成和再生的指標(biāo)有兩個：1）原生質(zhì)形成率=

38、(A-B)/A×100%2）原生質(zhì)體再生率=(C-B)/(A-B)×100%A將酶處理前的菌體經(jīng)無菌水系列稀釋，涂布于完全培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，計(jì)算出原菌數(shù)。B將用酶處理后得到原生質(zhì)體用無菌水適當(dāng)稀釋，在完全培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)計(jì)數(shù)，應(yīng)為未形成原生質(zhì)體的菌數(shù)。C將用酶處理后得到原生質(zhì)體用高滲透壓液稀釋，在再生培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)計(jì)數(shù)，生長出的菌落數(shù)為原生質(zhì)體再生數(shù)和未形成原生質(zhì)體數(shù)的總和。為了提高原生質(zhì)體的融合率，需加入融合劑：·聚乙二醇（PEG），可使原生質(zhì)體的膜電位下降，促進(jìn)Ca+交換，也通過滲透壓的脫水作用使細(xì)胞凝集（擾亂膜表面的蛋白和脂質(zhì)的排列，提高流動性）。

39、3;Ca+，原生質(zhì)體可通過Ca+交換而促進(jìn)凝集，從而提高融合率。4融合子的選擇依靠兩個親本的選擇遺傳標(biāo)記，在選擇性培養(yǎng)基上，通過兩個親本的遺傳標(biāo)記互補(bǔ)而挑選出融合子。一般產(chǎn)生兩種情況：真正的融合：產(chǎn)生雜合二倍體或單倍重組體假融合：形成異核體兩者均可以在選擇培養(yǎng)基上生長，異核體不穩(wěn)定，傳代后會分離。因此，融合后必須再生后進(jìn)行幾代自然分離，選擇，才能確定出真正融合子。5滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)在育種中的應(yīng)用采用熱，紫外線，電離輻射以及某些生化試劑，抗生素等處理原生質(zhì)體，使之失去再生能力，經(jīng)細(xì)胞融合后，由于損傷部位的互補(bǔ)，可以形成再生的融合體。1）單一親株滅活2）雙親株或多親株滅活該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以不需

40、要遺傳標(biāo)記三、DNA重組技術(shù)(一)DNA重組過程1基因分離將DNA分子從細(xì)胞中分離提取出來，基本步驟如下：SDS溶解細(xì)胞酚，蛋白酶去除蛋白質(zhì)核糖核酸酶去除RNA乙醇沉淀DNA2DNA分子的切割與連接限制性內(nèi)切酶識別和切割DNA分子連接酶連接有粘性末端或平末端的DNA分子3載體載體可將外源DNA片段引入宿主細(xì)胞，主要有四大類：質(zhì)粒（plasmids），黏粒（cosmids）、入噬菌體，M13噬菌體4引入宿主細(xì)胞質(zhì)粒重組DNA宿主噬菌體重組DNA宿主重組的噬菌體粒子宿主5重組體的選擇和鑒定a. 根據(jù)遺傳標(biāo)記選擇重組細(xì)胞抗藥性等b. 根據(jù)目的基因鑒定重組子核酸雜交，免疫化學(xué)法等6外源基因的表達(dá)外源基

41、因能否表達(dá)，取決于三個方面：a.轉(zhuǎn)錄水平啟動子及RNA聚合酶的統(tǒng)一b.翻譯水平mRNA核糖體結(jié)合位與受體核糖體的統(tǒng)一c.轉(zhuǎn)錄和翻譯后的修飾甲基化、糖基化等(二)分子育種技術(shù)分子育種是應(yīng)用基因工程手段(DNA重組)來進(jìn)行的。1鏈霉菌的基因克隆1）制備供體DNA及酶切2）制備載體DNA鏈霉菌質(zhì)粒或噬菌體分離及酶切3）連接載體和供體DNA片段4）將受體菌制成原生質(zhì)體受體菌的選擇應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：a.必須缺乏一種酶活力，可由克隆的外源基因產(chǎn)物來補(bǔ)充b.受體菌的限制性內(nèi)切酶能限制來自供體的DNA，應(yīng)設(shè)法降低該酶活性，如進(jìn)行誘變、熱處理等。c.受體菌在制備原生質(zhì)體時，先用0.5%的甘氨酸處理，使之對溶菌酶更

42、敏感。5）轉(zhuǎn)化作用：用PEG將DNA導(dǎo)入原生質(zhì)體6）再生和選擇：轉(zhuǎn)化后先將原生質(zhì)體涂于不含有藥物的再生培養(yǎng)基上，進(jìn)行一段時間非選擇性再生，然后將藥物加到再生培養(yǎng)基上，殺滅未被轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體。2鏈霉菌抗生素合成基因的克隆抗生素合成基因往往與相關(guān)基因，甚至抗性基因排列成簇，在克隆抗生素合成基因方面總結(jié)了以下七個策略：1）檢測克隆到標(biāo)準(zhǔn)宿主中的個別基因產(chǎn)物；2）利用產(chǎn)生菌阻斷突變株的互補(bǔ)作用：以抗生素生物合成阻斷突變株恢復(fù)產(chǎn)抗生素作為指標(biāo)。3）利用突變克隆技術(shù)：外源基因進(jìn)入抗生素的生產(chǎn)菌中，由于同源性就發(fā)生重組，造成該基因的表達(dá)中斷或改變，以此來確定克隆基因的性質(zhì)。4）連鎖的抗生素抗性基因的克?。嚎?/p>

43、性基因常與其合成基因連鎖在一起，可先克隆抗性基因，再分析是否也含有合成基因，然后再進(jìn)行合成基因的克隆。5）用人工合成的寡核苷酸探測基因文庫。6）直接克隆抗生素產(chǎn)生菌DNA大片段到非產(chǎn)生菌中，用鳥槍法克隆一個抗生素產(chǎn)生菌的DNA大片段到一個非產(chǎn)生菌中，然后直接篩選產(chǎn)抗生素的克隆。7）用一種抗生素的克隆DNA去探測相關(guān)抗生素的同源基因：很多重要抗生素如四環(huán)線、紅霉素、阿霉素、利福霉素等都是聚酮體抗生素、多功能合成酶（聚酮體合成酶）的氨基酸序列具有保守性，編碼聚酮體合成酶的DNA就可作為探針用于分離其他基因。3利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)新的抗生素將一種抗生素生物合成基因引入產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相似的抗生素產(chǎn)生菌，可改

44、變抗生素的結(jié)構(gòu)。一般有兩種情況：1）引入的羥化酶基因使原有的抗生素發(fā)生羥化；2）可合成兼有二者結(jié)構(gòu)的新抗生素結(jié)構(gòu)。4利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)氨基酸氨基酸的基因克隆多采用鳥槍法：供體菌DNA提取一種或幾種內(nèi)切酶處理切成一個或大于一個基因片段大小都與載體連接轉(zhuǎn)化到另一菌株進(jìn)行無性繁殖篩選含有目的基因的轉(zhuǎn)化子第五節(jié) 種子的擴(kuò)大培養(yǎng)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)（種子制備）是發(fā)酵生產(chǎn)的第一道工序，不僅是增加數(shù)量，更重要是質(zhì)量（產(chǎn)量高，性能穩(wěn)定），而且不被雜菌污染。一、種子制備一般包括兩個過程，即固體培養(yǎng)基上生產(chǎn)大量孢子孢子制備，在液體培養(yǎng)基中生產(chǎn)大量菌絲種子制備。1孢子制備不同菌種的孢子制備有其不同的特點(diǎn)1）放線菌孢子的

45、制備a.孢子采用瓊脂斜面培養(yǎng)基b.營養(yǎng)成份：麥皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機(jī)鹽等；c.碳源和氮源不要太豐富，不利于孢子形成（碳1%，氮0.5%）d.干燥和限制營養(yǎng)可直接或間接誘導(dǎo)孢子形成e.溫度為28-37，時間為514天f.兩種種子入罐法：一是孢子入罐法（常用），另一是搖瓶菌絲入罐法（縮短種子在罐內(nèi)培養(yǎng)時間）放線菌發(fā)酵生產(chǎn)的工藝過程如下：菌種母斜面（孢子）子斜面（孢子）搖瓶種子（菌絲）種子罐發(fā)酵罐2）霉菌孢子的制備a.以天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基：大米、小米、玉米、麥皮、麥粒等b.培養(yǎng)溫度為2528，時間為414天3）細(xì)菌培養(yǎng)物的制備a.采用碳源限量而氮源豐富的配方，如牛肉膏、蛋白胨b.溫度為283

46、7，時間為12天，產(chǎn)芽孢菌510天2 種子制備將固體培養(yǎng)的孢子轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)，繁殖大量菌絲或菌體的過程。培養(yǎng)條件應(yīng)有利于孢子發(fā)芽和菌絲繁殖。階段：實(shí)驗(yàn)室種子的制備 生產(chǎn)車間種子的制備1）搖瓶種子制備孢子發(fā)芽和菌絲繁殖緩慢的菌種，需將孢子經(jīng)搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進(jìn)入種子制度，培養(yǎng)配方和條件與種子罐相似。常采用母瓶、子瓶兩級培養(yǎng)，兩種都可直接進(jìn)罐。母瓶營養(yǎng)豐富和完全，氮源豐富有利菌絲生長，但各種成價不宜過濃。子瓶培養(yǎng)基濃度以母瓶略高，更接近種子罐配方。2）種子罐種子制備因菌種不同而異，一般為分一級種子，二級種子和三級種子的制備。孢子（或搖瓶菌絲）小體積種子罐一級種子發(fā)酵罐二級種子大發(fā)酵罐三級種子種子罐的

47、級數(shù)主要決定于菌種的性質(zhì)和生長速度及發(fā)酵設(shè)備的合理應(yīng)用。目的是要形成一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體。種子制備的目的：形成一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體種子罐級數(shù)的減少，有利于生產(chǎn)過程的簡化及發(fā)酵過程的控制，可以減少因種子生長異常而造成發(fā)酵的波動。三、種子培養(yǎng)工業(yè)微生物培養(yǎng)法分為靜置培養(yǎng)和通氣培養(yǎng)兩大類型，通氣培養(yǎng)實(shí)用于好氧和兼性好氧菌的培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)法是將培養(yǎng)基盛于發(fā)酵容器中，在接種后，不通空氣進(jìn)行培養(yǎng)。而通氣培養(yǎng)法的生產(chǎn)菌種以好氧菌和兼性好氧菌居多，它們生長的環(huán)境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體快速生長和發(fā)酵，又稱為好氧性培養(yǎng)。1表面培養(yǎng)法是一種好氧靜置培養(yǎng)法，分固態(tài)和液態(tài)兩種，其生長速度與培養(yǎng)基的

48、深度有關(guān)，單位體積的表面積越大，生長速度越快。2固體培養(yǎng)法分為淺層和深層固體培養(yǎng)兩種，也稱曲法培養(yǎng)，特點(diǎn)是固體曲的酶活力高。3液體深層培養(yǎng)從罐底部通氣，攪拌培養(yǎng)法。其特點(diǎn)是容易根據(jù)培養(yǎng)要求和時間控制通氣，攪拌，溫度與氫離子濃度等條件。1）深層培養(yǎng)的三個控制點(diǎn)a.滅菌：培養(yǎng)前必須進(jìn)行培養(yǎng)基加熱滅菌。b.溫度控制：在夾套中通冷卻水循環(huán)來維持溫度恒定。c.通氣，攪拌：空氣經(jīng)過濾器除菌，由罐底通入，再經(jīng)攪拌將空氣分散成小氣泡，增加溶氧量，也可均勻地分散罐中的微生物。2）幾種深層培養(yǎng)法a.控制培養(yǎng)法根據(jù)罐內(nèi)部的變化情況，掌握短暫時間內(nèi)狀態(tài)變量的變化以及可能測定的環(huán)境因子對微生物代謝活動的影響，并以此為基

49、礎(chǔ)進(jìn)行控制培養(yǎng)，以達(dá)到產(chǎn)物的最優(yōu)培養(yǎng)條件。b.載體培養(yǎng)法持征是以天然或人工合成的多孔材料代替麥皮之類的固體基質(zhì)作為微生物的載體，置于營養(yǎng)成分嚴(yán)格控制的液體培養(yǎng)基。發(fā)酵結(jié)束，將菌體和培養(yǎng)基擠壓出來進(jìn)行抽提。c.兩步法在酶制劑的兩步法液體深層培養(yǎng)中，每一步菌體相同而培養(yǎng)條件不同，因?yàn)槲⑸锷L與產(chǎn)酶的條件有很大的差異。特點(diǎn)是將菌體生長條件（營養(yǎng)期）與產(chǎn)酶條件（繁殖期）區(qū)分開來。第一步：菌體在豐富培養(yǎng)基上大量繁殖，收集，濃度，洗滌，再轉(zhuǎn)入產(chǎn)酶培養(yǎng)基。第二步：產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，菌體一般不繁殖，只是積累大量的酶。四、種子質(zhì)量的控制(一)影響孢子質(zhì)量的因素及其控制孢子質(zhì)量與培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度、

50、濕度、時間、接種量等都有關(guān)。1培養(yǎng)基1）影響因素原材料：產(chǎn)地、品種、加工方法和用量。 水質(zhì)：地區(qū)不同，秀節(jié)變化，水源污染2）控制原材料：材料中的糖、氮、磷含量需經(jīng)化學(xué)分析及搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)合格后使用。水質(zhì)：盡量使用蒸餾水或無鹽水中加入適量無機(jī)鹽，供配制培養(yǎng)基，比較容易控制。氮源：供生產(chǎn)用或制備孢子和傳代，應(yīng)使用較單一的氮源，以保證正常菌落類型的優(yōu)勢。作為選種或分離平板，則需用較復(fù)雜的有機(jī)氮源便于選擇特殊代謝的菌落。成分應(yīng)適應(yīng)種子培養(yǎng)基的需要（利于直接吸收利用）營養(yǎng)成分要盡可能和發(fā)酵培養(yǎng)基相近2培養(yǎng)溫度和濕度1）影響因素溫度：培養(yǎng)溫度不同，菌的生理狀態(tài)也不同，不采用最適溫度，其生產(chǎn)力下降，一般來說提高溫度，菌體代謝加快，培養(yǎng)時間縮短。孢子成熟早、易老化。濕度：地區(qū)和天氣都可影響培養(yǎng)濕度2）控制溫度：對不同的菌應(yīng)測試其最適生長溫