基因芯片技術(shù)概要

1、基因芯片技術(shù)概要 作者：張發(fā)寶 本文來(lái)源：生物谷 生物科學(xué)正迅速地演變?yōu)橐婚T(mén)信息科學(xué)。最明顯的一個(gè)例子就是目前正在進(jìn)行的HGP（human genome project），最終要搞清人類全部基因組的30億左右堿基對(duì)的序列。除了人的遺傳信息以外，還有其它生物尤其是模式生物 model organism）已經(jīng)或正在被大規(guī)模測(cè)序，如大腸桿菌、啤酒酵母、秀麗隱桿線蟲(chóng)以及中國(guó)和日本科學(xué)家攻關(guān)的水稻基因組計(jì)劃。但單純知曉生物基因組序列一級(jí)結(jié)構(gòu)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還必須了解其中基因是怎樣組織起來(lái)的，每個(gè)基因的功能是什么，又是怎樣隨發(fā)育調(diào)控和微環(huán)境因素的影響而在特定的時(shí)空域中展開(kāi)其表達(dá)譜的，即我們正由結(jié)構(gòu)基因組時(shí)代邁

2、入功能基因組時(shí)代。隨著這個(gè)功能基因組學(xué)問(wèn)題的提出（后基因組時(shí)代，蛋白組學(xué)）1 ，涌現(xiàn)出許多功能強(qiáng)大的研究方法和研究工具，最突出的就是細(xì)胞蛋白質(zhì)二維凝膠電泳（2-D-gel）（及相應(yīng)的質(zhì)譜法測(cè)蛋白分子量）和生物芯片（Biochip）技術(shù) 2 。 一什么是基因芯片生物芯片，簡(jiǎn)單地說(shuō)就是在一塊指甲大小（1cm3）的有多聚賴氨酸包被的硅片上或其它固相支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，但需經(jīng)特殊處理。作原位合成的支持物在聚合反應(yīng)前要先使其表面衍生出羥基或氨基（視所要固定的分子為核酸或寡肽而定）并與保護(hù)基建立共價(jià)連接；作點(diǎn)樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸附帶負(fù)電荷的探針?lè)肿?，?/p>

3、常需包被以氨基硅烷或多聚賴氨酸等）將生物分子探針（寡核苷酸片段或基因片段）以大規(guī)模陣列的形式排布，形成可與目的分子（如基因）相互作用，交行反應(yīng)的固相表面，在激光的順序激發(fā)下標(biāo)記熒光根據(jù)實(shí)際反應(yīng)情況分別呈現(xiàn)不同的熒光發(fā)射譜征， CCD 相機(jī)或激光共聚焦顯微鏡根據(jù)其波長(zhǎng)及波幅特征收集信號(hào)，作出比較和檢測(cè)，從而迅速得出所要的信息。生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片。而基因芯片中，最成功的是 DNA 芯片，即將無(wú)數(shù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的寡核苷酸或 cDNA 在芯片上做成點(diǎn)陣，與樣品中同源核酸分子雜交 3 的芯片?；蛐酒幕驹硗酒夹g(shù)中雜交測(cè)序（ sequencing by hybridizati

4、on, SBH ）。即任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解為一個(gè)序列固定、錯(cuò)落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列（ subsequence ）。例如可把寡核苷酸序列 TTAGCTCATATG 分解成5個(gè)8nt亞序列： (1) CTCATATG (2) GCTCATAT (3) AGCTCATA (4) TAGCTCAT (5) TTAGCTCA 這 5 個(gè)亞序列依次錯(cuò)開(kāi)一個(gè)堿基而重疊7個(gè)堿基。亞序列中 A 、 T 、 C 、 G 4 個(gè)堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有 65536 種。假如只考慮完全互補(bǔ)的雜交，那么 48 個(gè) 8 nt 亞序列探針中，僅有上述 5 個(gè)能同靶 DNA 雜交。

5、可以用人工合成的已知序列的所有可能的 n 體寡核苷酸探針與一個(gè)未知的熒光標(biāo)記 DNA/RNA 序列雜交，通過(guò)對(duì)雜交熒光信號(hào)檢測(cè)，檢出所有能與靶 DNA 雜交的寡核苷酸，從而推出靶 DNA 中的所有8nt亞序列，最后由計(jì)算機(jī)對(duì)大量熒光信號(hào)的譜型（pattern）數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，重構(gòu)靶 DNA 的互補(bǔ)寡核苷酸序列。 二芯片類型一般基因芯片按其材質(zhì)和功能，基本可分為以下幾類 4 ：( 一 ) 元件型微陣列芯片1 生物電子芯片2 凝膠元件微陣列芯片3 藥物控釋芯片 ( 二 ) 通道型微陣列芯片1 毛細(xì)管電泳芯片2 PCR 擴(kuò)增芯片3 集成 DNA 分析芯片4 毛細(xì)管電層析芯片 ( 三 ) 生物傳感芯片1

6、 光學(xué)纖維陣列芯片2 白光干涉譜傳感芯片 小鼠基因表達(dá)譜芯片 (MGEC)附 : 目前國(guó)內(nèi)基因芯片常見(jiàn)品種 .( 上海博星公司 )芯片品種 芯片點(diǎn)數(shù) MGEC-20S 2000 MGEC-40S 4000 MGEC-80S 8000 癌癥相關(guān)基因表達(dá)譜芯片 (CRGEC) 分類 芯片型號(hào) 芯片點(diǎn)數(shù) 肝癌相關(guān)基因表達(dá)譜芯片 LiverC-16S 1626 LiverC-16D 3252 LiverC-9.5NS 954 LiverC-9.5ND 1908 肺癌相關(guān)基因表達(dá)譜芯片 LungC-7.3S 737 LungC-7.3D 1474 人類基因表達(dá)譜芯片 (HGEC) 芯片品種 芯片點(diǎn)數(shù) H

7、GEC-10S 1024 HGEC-10D 2048 HGEC-20S 2048 HGEC-20D 4096 HGEC-40S 4096 HGEC-40D 8192 HGEC-80S 8192 HGEC-80D 16184 三基因芯片的制備芯片種類較多，制備方法也不盡相同，常見(jiàn)的芯片可分為兩大類：一類是原位合成；一種是直接點(diǎn)樣。原位合成適用于寡核苷酸；直接點(diǎn)樣多用于大片段 DNA ，有時(shí)也用于寡核苷酸，甚至 mRNA 。原位合成有兩種途徑。一是光蝕刻法；一是噴印法。光蝕刻法可以合成 30nt 左右，噴印法可以合成 40-50nt ，光蝕刻法每步縮合率較低，一般為 95% 左右，合成 30nt

8、產(chǎn)率僅 20% ；噴印法可達(dá) 99% 以上，合成 30nt 產(chǎn)率可達(dá) 74% ，從這個(gè)意義上說(shuō)噴印法特異性應(yīng)比光刻法高。此外，噴印法不需特殊的合成試劑。與原位合成法比較點(diǎn)樣法較簡(jiǎn)單，只需將預(yù)先制備好的寡核苷酸或 cDNA 等樣品通過(guò)自動(dòng)點(diǎn)樣裝置點(diǎn)于經(jīng)特殊處理的玻璃片或其它材料上即可。1、原位光蝕刻合成 5-7寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由 Affymetrix 公司開(kāi)發(fā)的，采用的技術(shù)原理是在合成堿基單體的 5 羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè) 5 端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過(guò)程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度

9、的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長(zhǎng)。某一含 n 個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，通過(guò) 4 n 個(gè)化學(xué)步驟能合成出 4n 個(gè)可能結(jié)構(gòu)。例如：一個(gè)完整的十核苷酸通過(guò) 32 個(gè)化學(xué)步驟， 8 個(gè)小時(shí)可能合成 65,536 個(gè)探針。目前美國(guó) Affymetrix 公司已有同時(shí)檢測(cè) 6,500 個(gè)已知人類基因的 DNA 芯片，并且正在制備含 500,000-1,000,000 個(gè)寡核苷酸探針的人類基因檢測(cè)芯片。該公司每月投入基因芯片研究的經(jīng)費(fèi)約 100 萬(wàn)美元，目前產(chǎn)品尚未公開(kāi)投放市場(chǎng)發(fā)揮經(jīng)濟(jì)效益，但已有許多公司及研究機(jī)構(gòu)與其簽約購(gòu)買(mǎi)其產(chǎn)品。該產(chǎn)品不僅可用于基因表達(dá)分析和基因診斷等，而且在大規(guī)模藥物開(kāi)發(fā)方面也

10、具有誘人的前景。 Affymetrix 的大部分產(chǎn)品將在 98 年底全面投放市場(chǎng)。屆時(shí)，在其產(chǎn)品被廣泛采用的同時(shí)，其所有的研究投入將變成巨大的利潤(rùn)。其它公司產(chǎn)品也正在從實(shí)驗(yàn)室技術(shù)研究走向開(kāi)發(fā)應(yīng)用。目前，用于分子診斷的 DNA 芯片不僅已可用于檢測(cè)愛(ài)滋病病毒基因還可用于囊性纖維化（ CF ）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相關(guān)基因的基因診斷。鑒于光刻設(shè)備技術(shù)復(fù)雜，只能有專業(yè)化公司生產(chǎn)，加之成本高及合成效率不高的問(wèn)題，因此有待進(jìn)行以下研究：對(duì)光刻技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提高合成效率；開(kāi)發(fā)新的原位合成技術(shù)，如噴印合成技術(shù)，該技術(shù)既能進(jìn)行原位合成又能進(jìn)行非原位合成。另一方法是光導(dǎo)原位合成法。具體方法是在經(jīng)過(guò)處理的載玻片表

11、面鋪上一層連接分子（ linker ），其羥基上加有光敏保護(hù)基團(tuán)，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（ photolithographic mask ）保護(hù)不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護(hù)基團(tuán)，游離羥基，利用化學(xué)反應(yīng)加上第一個(gè)核苷酸，所加核苷酸種類及在芯片上的部位預(yù)先設(shè)定，所引入的核苷酸帶有光敏保護(hù)基團(tuán)，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位點(diǎn)加上另外三種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而 N 個(gè)核苷酸長(zhǎng)的芯片需要 4N 個(gè)步驟。每一個(gè)獨(dú)特序列的探針?lè)Q為一個(gè) “feature” ，這樣的芯片便具有 4N 個(gè) “feature” ，包含了全部長(zhǎng)度為 N 的核苷酸序列。這種

12、原位直接合成的方法無(wú)須制備處理克隆和 PCR 產(chǎn)物，但是每輪反應(yīng)所需設(shè)計(jì)的光柵則是主要的經(jīng)費(fèi)消耗。運(yùn)用這種方法制作的芯片密度可高達(dá) 106 探針 / 平方厘米，即探針間隔為 5 10m ，但只能制作 II 型 DNA 芯片。見(jiàn)圖 1 。 2、原位噴印合成芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過(guò)芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個(gè)芯片上移動(dòng)并根據(jù)芯片上不同位點(diǎn)探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術(shù)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的 DNA 固相合成一致，因此不特殊制備的化學(xué)試劑。3、點(diǎn)樣法點(diǎn)樣法是將合成好的探針、 cNDA 或基因組 DNA 通過(guò)特定的

13、高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。一些研究者采用人工點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化學(xué)方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好的 DNA 芯片可置于緩沖液中保存。由于方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于大規(guī)模 DNA 芯片制作，因而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化點(diǎn)樣就顯得尤為重要。有的研究者用多聚賴氨酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過(guò)分區(qū)后用計(jì)算機(jī)控制的微陣列點(diǎn)樣機(jī)按照預(yù)先設(shè)計(jì)順序點(diǎn)上核酸分子，點(diǎn)樣量很小，約為 5nl 。大規(guī)模 CDNA 芯片多采用這種方法，與其寡核苷酸微芯片相比。 DNA 芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強(qiáng)的親和勢(shì)和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，

14、量化，分類 PCR 產(chǎn)物。有的研究者將玻片上覆蓋 20m 厚薄層聚丙烯酰胺凝膠作為支持物，采用機(jī)械刻寫(xiě)或光刻的方法在其表面劃上網(wǎng)格，并用激光照射蒸發(fā)掉單元間隙的多余凝膠，以實(shí)現(xiàn) DNA 芯片分區(qū)，單元大小為 4040m 或 100100m 間隔分別為 50m 和 100m 。然后將化學(xué)方法合成的寡核苷酸探針自動(dòng)化點(diǎn)樣于各個(gè)單元內(nèi)而制成 DNA 芯片，點(diǎn)樣速度可達(dá) 2000 單元 / 秒。其裝置采用的機(jī)器人有一套計(jì)算機(jī)控制三維移動(dòng)裝置、多個(gè)打印 / 噴印針的打印 / 噴印頭；一個(gè)減震底座，上面可放內(nèi)盛探針的多孔板和多個(gè)芯片。根據(jù)需要還可以有溫度和濕度控制裝置、針洗滌裝置。打印 / 噴印針將探針從

15、多孔板取出直接打印或噴印于芯片上。直接打印時(shí)針頭與芯片接觸，而在噴印時(shí)針頭與芯片保持一定距離。打印法的優(yōu)點(diǎn)是探針密度高，通常 1 平方厘米可打印 2,500 個(gè)探針。缺點(diǎn)是定量準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使用壽命有限。噴印法的優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，使用壽命長(zhǎng)。缺點(diǎn)是噴印的斑點(diǎn)大，因此探針密度低，通常 1 平方厘米只有 400 點(diǎn)。國(guó)外有多家實(shí)驗(yàn)室和公司研究開(kāi)發(fā)打印 / 噴印設(shè)備，目前有一些已經(jīng)商品化。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院和益生堂生物企業(yè)公司目前正在聯(lián)手利用打印 / 噴印技術(shù)進(jìn)行生物芯片的研究和開(kāi)發(fā)，預(yù)計(jì) 2 年內(nèi)將有用于實(shí)驗(yàn)室研究或臨床診斷的基因芯片產(chǎn)品問(wèn)世。見(jiàn)圖二。4、電子芯片 8-10

16、電子芯片是由美國(guó) anogen 公司開(kāi)發(fā)的，目前國(guó)內(nèi)清華大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)也在開(kāi)發(fā)這一技術(shù)。這種芯片為帶有陽(yáng)電荷的硅芯片、芯片經(jīng)熱氧化，制成 1mm 1mm 的陣列、每個(gè)陣列含多個(gè)微電極，在每個(gè)電極上通過(guò)氧化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。將連接鏈親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上，在電場(chǎng)作用下生物素標(biāo)記的探針即可結(jié)合在特定電極上。電子芯片最大特點(diǎn)是雜交速度快，可大大縮短分析時(shí)間。制備復(fù)雜、成本高是其不足。5、三維芯片 11-12三維芯片是由美國(guó)的 Packard 、摩托羅拉、 Argonne 國(guó)家實(shí)驗(yàn)室三家機(jī)構(gòu)與俄羅斯 Engelhardt 分子生物學(xué)研究所合作開(kāi)發(fā)的一種芯片技術(shù)。三維生物芯片實(shí)質(zhì)上是一塊顯微

17、鏡載玻片，其上有 10,000 個(gè)微小聚乙烯酰胺凝膠條，每個(gè)凝膠條可用于靶 DNA ， RNA 和蛋白質(zhì)的分析。先把乙知化合物加在凝膠條上，再用 3cm 長(zhǎng)的微型玻璃毛細(xì)管將待測(cè)樣品加到凝膠條上。每個(gè)毛細(xì)管能把小到 0.2nl 的體積打到凝膠上。以上幾家機(jī)構(gòu)合作研究的生物芯片系統(tǒng)具有其它生物芯片系統(tǒng)不具有的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一是凝膠的三維化能加進(jìn)更多的已知物質(zhì)，增加了敏感性。二是可以在芯片上同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增與檢則。一般情況下，必須在微量多孔板上先進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，再把樣品加到芯片上，因此需要進(jìn)行許多額外操作。本芯片所用凝膠體積很小。使 PCR 擴(kuò)增體系的體積減小 1,000 倍（總體積約納升級(jí)），從而節(jié)

18、約了每個(gè)反應(yīng)所用的 PCR 酶（約減少 100 倍）。三是以三維構(gòu)象形式存在的蛋白和基因材料可以其天然狀態(tài)在凝膠條上分析，可以進(jìn)行免疫測(cè)定，受體 - 配體研究和蛋白組分析。6、流過(guò)式芯片（ flow-thru chip ） 13Cene Logic正在開(kāi)發(fā)一種在芯片片基上制成格柵狀微通道，Cene Logic設(shè)計(jì)及合成特定的寡核苷酸探針，結(jié)合于微通道內(nèi)芯片的特定區(qū)域。從待測(cè)樣品中分離DNA或RNA并對(duì)其進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后，該樣品流過(guò)芯片，固定的寡核苷酸探針捕獲與之相互補(bǔ)的核酸，采用Cene Logics 信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)分析結(jié)果。流通式芯片用于高通量分析已知基因的變化，其特定在于敏感性高：由于寡核

19、苷酸吸附表面的增大，流過(guò)式芯片可監(jiān)測(cè)稀有基因表達(dá)的變化；速度快：微通道加速了雜交反應(yīng)，減少了每次檢測(cè)所需時(shí)間；價(jià)格降低：由于采用了特殊的共價(jià)化學(xué)技術(shù)將寡核苷酸吸附于微通道內(nèi)，使每一種流過(guò)芯片可反復(fù)使用多次，從而使其成本降低。四基因芯片樣品制備一般說(shuō)來(lái)應(yīng)用 DNA 芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)包括 5 個(gè)過(guò)程：生物學(xué)問(wèn)題的提出和芯片設(shè)計(jì)；樣品制備；生物雜交反應(yīng)；結(jié)果探測(cè)；數(shù)據(jù)處理和建模。1、樣品制備。一般所需 mRNA 的量是以一張表達(dá)譜芯片需要 3g mRNA 計(jì)算的不同組織抽提 3 10g mRNA 所需組織量 器官 / 組織 * 提取 3gmRNA 所需組織量 ( 克 ) 提取 10gmRNA 所需織量

20、( 克 ) 總 RNA 得率 單位 : 毫克 RNA/ 克組織 mRNA 所占百分比 % 成人正常組織 肝 0.2083 0.6944 1.80 - 1.80 mg/g 0.80 成人正常組織 腦 缺數(shù)據(jù) 缺數(shù)據(jù) 1.30 - 1.30 mg/g 缺數(shù)據(jù) 成人正常組織 肺 0.3000 1.0000 1.00 - 1.00 mg/g 1.00 成人正常組織 心 0.5000 1.6667 0.60 - 0.60 mg/g 1.00 成人正常組織 胃 0.1852 0.6173 2.70 - 2.70 mg/g 0.60 成人正常組織 喉 0.3125 1.0417 1.20 - 1.20 mg

21、/g 0.80 病理組織 結(jié)腸癌 0.2521 0.8403 1.70 - 1.70 mg/g 0.70 病理組織 胃癌 0.4317 1.4388 0.50 - 0.50 mg/g 1.39 病理組織 空腸腺癌 0.3571 1.1905 1.40 - 1.40 mg/g 0.60 病理組織 直腸癌 0.1604 0.5348 1.70 - 1.70 mg/g 1.10 病理組織 肝癌 0.1116 0.3720 3.84 - 3.84 mg/g 0.70 病理組織 肺癌 0.1282 0.4274 2.00 - 2.00 mg/g 1.17 考慮到個(gè)體差異以及樣品在研磨、勻漿等過(guò)程中的損失

22、，客戶提供的樣品量應(yīng)在上述基礎(chǔ)上增加 1-2 倍。 2、樣本采集過(guò)程關(guān)鍵點(diǎn)組織標(biāo)本采集操作建議規(guī)程 ,( 取標(biāo)本所需關(guān)鍵器材和處理要求 ) 鋁箔 經(jīng) DEPC 水浸泡過(guò)夜， 78C 烘干，高壓滅菌后烘干 1.5 ml 微離心管 15 ml 聚丙烯離心管 市場(chǎng)有售 RNAase-Free 的相應(yīng)規(guī)格離心管 標(biāo)簽紙 記號(hào)筆 樣品登記表 由客戶指定專人填寫(xiě) 液氮罐 應(yīng)常備液氮罐，并保證液氮的來(lái)源 取材部位的病理切片 由客戶提供 1-2 張 注：以下步驟 1 5 應(yīng)在冰上進(jìn)行且不超過(guò) 15 分鐘，超過(guò)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致樣品的 RNA 降解。對(duì)腫瘤組織的取材，要求盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，例如對(duì)于手術(shù)切除

23、的整個(gè)或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報(bào)告的結(jié)果來(lái)判定要進(jìn)行研究的取材部位。1、離體新鮮組織，切成多個(gè) 1cm3 小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜；肝、腎、脾應(yīng)剪除門(mén)部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將周?chē)恼＝M織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周?chē)哪[瘤組織切除干凈）。2、在 RNase-Free 0.9 生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。3、用鋁箔包裹組織，或用 5ml 凍存管裝載組織 ( 但最好統(tǒng)一采用鋁箔 ) 。用記號(hào)筆在鋁箔或凍存管外表寫(xiě)明樣品編號(hào)，并貼上標(biāo)簽，迅速投入液氮冷卻。4、填寫(xiě)樣品登記表，寫(xiě)明樣品名稱、種類、編號(hào)、取樣日期、樣品處理情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個(gè)

24、樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號(hào)繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙（標(biāo)簽上注明：樣品名稱、編號(hào)、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐5、保留 1-2 張取材部位的病理切片。 五。生物芯片雜交待分析基因在與芯片結(jié)合探針雜交之前必需進(jìn)行分離、擴(kuò)增及標(biāo)記。根據(jù)樣品來(lái)源、基因含量及檢測(cè)方法和分析目的不同，采用的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記方法各異。當(dāng)然，常規(guī)的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記技術(shù)完全可以采用，但操作繁瑣且費(fèi)時(shí)。高度集成的微型樣品處理系統(tǒng)如細(xì)胞分離芯片及基因擴(kuò)增芯片等是實(shí)現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。為了獲得基因的雜交信號(hào)必須對(duì)目的基因進(jìn)行標(biāo)記，目前采用的最普遍的熒光標(biāo)記方法與傳統(tǒng)方法如體外轉(zhuǎn)錄、 PCR 、逆轉(zhuǎn)錄等原

25、理上并無(wú)多大差異，只是采用的熒光素種類更多，這可以滿足不同來(lái)源樣品的平行分析。用計(jì)算機(jī)控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目的基因的熒光信號(hào)，通過(guò)計(jì)算機(jī)處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)信息。雜交條件的選擇與研究目的有關(guān)，多態(tài)性分析或者基因測(cè)序時(shí)，每個(gè)核苷酸或突變位點(diǎn)都必須檢測(cè)出來(lái)。通常設(shè)計(jì)出一套四種寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每個(gè)位點(diǎn)，只在中央位點(diǎn)堿基有所不同，根據(jù)每套探針在某一特點(diǎn)位點(diǎn)的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度，即可測(cè)定出該堿基的種類。如果芯片僅用于檢測(cè)基因表達(dá)，只需設(shè)計(jì)出針對(duì)基因中的特定區(qū)域的幾套寡聚核苷酸即可。表達(dá)檢測(cè)需要長(zhǎng)的雜交時(shí)間，更高的嚴(yán)謹(jǐn)性，更高的樣品濃度和低溫度，這有利于增加檢測(cè)的特異性

26、和低拷貝基因檢測(cè)的靈敏度。突變檢測(cè)，要鑒別出單堿基錯(cuò)配，需要更高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和更短的時(shí)間。此外，雜交反應(yīng)還必須考慮雜交反應(yīng)體系中鹽濃度、探針 GC 含量和所帶電荷、探針與芯片之間連接臂的長(zhǎng)度及種類、檢測(cè)基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。有資料顯示探針和芯片之間適當(dāng)長(zhǎng)度的連接臂可使雜交效率提高 150 倍 9 。連接臂上任何正或負(fù)電荷都將減少雜交效率。由于探針和檢測(cè)基因均帶負(fù)電荷，因此影響他們之間的雜交結(jié)合，為此有人提出用不帶電荷的肽核酸（ PNA ）做探針 9 。雖然 PNA 的制備比較復(fù)雜，但與 DNA 探針比較有許多特點(diǎn)，如不需要鹽離子，因此可防止檢測(cè)基因二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成及自身復(fù)性。由于 PNA-DNA

27、 結(jié)合更加穩(wěn)定和特異，因此更有利于單堿基錯(cuò)配基因的檢測(cè)。六。基因芯片檢測(cè)原理雜交信號(hào)的檢測(cè)是 DNA 芯片技術(shù)中的重要組成部分。以往的研究中已形成許多種探測(cè)分子雜交的方法，如熒光顯微鏡、隱逝波傳感器、光散射表面共振、電化傳感器、化學(xué)發(fā)光、熒光各向異性等等，但并非每種方法都適用于 DNA 芯片。由于 DNA 芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號(hào)在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模 DNA 芯片由于其面積小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號(hào)較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(jī) (charged-coupled device camera ， CCD) 攝像機(jī)等弱光信號(hào)探測(cè)裝置。此外，大多數(shù) D

28、NA 芯片雜交信號(hào)譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號(hào)強(qiáng)度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測(cè)方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。雜交信號(hào)探測(cè)系統(tǒng)主要包括雜交信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)收集及傳輸和信號(hào)處理及成像三個(gè)部分組成。由于所使用的標(biāo)記物不同，因而相應(yīng)的探測(cè)方法也各具特色。大多數(shù)研究者使用熒光標(biāo)記物，也有一些研究者使用生物素標(biāo)記，聯(lián)合抗生物素結(jié)合物檢測(cè) DNA 化學(xué)發(fā)光。通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)來(lái)確定DNA芯片雜交譜型。1熒光標(biāo)記雜交信號(hào)的檢測(cè)方法使用熒光標(biāo)記物的研究者最多，因而相應(yīng)的探測(cè)方法也就最多、最成熟。由于熒光顯微鏡可以選擇性地激發(fā)和探測(cè)樣品中的混合熒光標(biāo)記物，并具有很好的空間分辨率和

29、熱分辨率，特別是當(dāng)熒光顯微鏡中使用了共焦激光掃描時(shí)，分辨能力在實(shí)際應(yīng)用中可接近由數(shù)值孔徑和光波長(zhǎng)決定的空間分辨率，而在傳統(tǒng)的顯微鏡是很難做到的，這便為DNA芯片進(jìn)一步微型化提供了重要的檢測(cè)方法的基礎(chǔ)。大多數(shù)方法都是在人射照明式熒光顯微鏡（epifluoescence microscope）基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，包括激光掃描熒光顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、使用了 CCD 相機(jī)的改進(jìn)的熒光顯微鏡以及將 DNA 芯片直接制作在光纖維束切面上并結(jié)合熒光顯微鏡的光纖傳感器微陣列。這些方法基本上都是將待雜交對(duì)象 以熒光物質(zhì)標(biāo)記，如熒光素或麗絲膠（lissamine）等，雜交后經(jīng)過(guò) SSC 和 SDS 的混合溶

30、液或 SSPE 等緩沖液清洗。（1）激光掃描熒光顯微鏡探測(cè)裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計(jì)算機(jī)控制的二維傳動(dòng)平臺(tái)上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過(guò)物鏡聚焦到芯片表面，激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為 5 10m 。同時(shí)通過(guò)同一物鏡收集熒光信號(hào)經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測(cè)，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。通過(guò)計(jì)算機(jī)控制傳動(dòng)平臺(tái) X Y 方向上步進(jìn)平移， DNA 芯片被逐點(diǎn)照射，所采集熒光信號(hào)構(gòu)成雜交信號(hào)譜型，送計(jì)算機(jī)分析處理，最后形成 20m 象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類型的 DNA 芯片及大規(guī)模 DNA

31、 芯片雜交信號(hào)檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、基因診斷等方面研究。（2） 激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)非常相似，但是由于采用了共焦技術(shù)因而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標(biāo)記分子與 DNA 芯片雜交的同時(shí)進(jìn)行雜交信號(hào)的探測(cè)，而無(wú)須清洗掉未雜交分子，從而簡(jiǎn)化了操作步驟大大提高了工作效率。 Affymetrix 公司的 S P A Forder 等人設(shè)計(jì)的 DNA 芯片即利用此方法。其方法是將靶 DNA 分子溶液放在樣品地中，芯片上合成寡核苷酸陣列的一面向下，與樣品池溶液直接接觸，并與 DNA 樣品雜交。當(dāng)用激發(fā)光照射使熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光時(shí)，既有芯片上雜交的 DNA 樣品所

32、發(fā)出的熒光，也有樣品地中 DNA 所發(fā)出的熒光，如何將兩者分離開(kāi)來(lái)是一個(gè)非常重要的問(wèn)題。而共焦顯微鏡具有非常好的縱向分辨率，可以在接受芯片表面熒光信號(hào)的同時(shí)，避開(kāi)樣品池中熒光信號(hào)的影響。一般采用氬離子激光器（ 488nm ）作為激發(fā)光源，經(jīng)物鏡聚焦，從芯片背面入射，聚集于芯片與靶分子溶液接觸面。雜交分子所發(fā)的熒光再經(jīng)同一物鏡收集，并經(jīng)濾波片濾波，被冷卻的光電倍增管在光子計(jì)數(shù)的模式下接收。經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換反轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)送微機(jī)處理，成像分析。在光電信增管前放置一共焦小孔，用于阻擋大部分激發(fā)光焦平面以外的來(lái)自樣品池的未雜交分子熒光信號(hào)，避免其對(duì)探測(cè)結(jié)果的影響。激光器前也放置一個(gè)小孔光闌以盡量縮小聚焦點(diǎn)處

33、光斑半徑，使之能夠只照射在單個(gè)探針上。通過(guò)計(jì)算機(jī)控制激光束或樣品池的移動(dòng)，便可實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片的二維掃描，移動(dòng)步長(zhǎng)與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標(biāo)記雜交信號(hào)圖譜。其特點(diǎn)是靈敏度和分辨率較高，掃描時(shí)間長(zhǎng)，比較適合研究用?，F(xiàn)在 Affymetrix 公司已推出商業(yè)化樣機(jī)，整套系統(tǒng)約 12 萬(wàn)美元。（3）采用了 CCD 相機(jī)的熒光顯微鏡 這種探測(cè)裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以 CCD 相機(jī)作為信號(hào)接收器而不是光電倍增管，因而無(wú)須掃描傳動(dòng)平臺(tái)。由于不是逐點(diǎn)激發(fā)探測(cè)，因而激發(fā)光照射光場(chǎng)為整個(gè)芯片區(qū)域，由 CCD 相機(jī)獲得整個(gè) DNA 芯片的雜交譜型。這種方法一般不

34、采用激光器作為激發(fā)光源，由于激光束光強(qiáng)的高斯分布，會(huì)使得光場(chǎng)光強(qiáng)度分布不均，而熒光信號(hào)的強(qiáng)度與激發(fā)光的強(qiáng)度密切相關(guān)，因而不利于信號(hào)采集的線性響應(yīng)。為保證激發(fā)光勻場(chǎng)照射，有的學(xué)者使用高壓汞燈經(jīng)濾波片濾波，通過(guò)傳統(tǒng)的光學(xué)物鏡將激發(fā)光投射到芯片上，照明面積可通過(guò)更換物鏡來(lái)調(diào)整；也有的研究者使用大功率弧形探照燈作為光源，使用光纖維束與透鏡結(jié)合傳輸激發(fā)光，并與芯片表面呈 50o 角入射。由于采用了 CCD 相機(jī)，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時(shí)間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。其特點(diǎn)是掃描時(shí)間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用 14 .（4）光纖傳感器有的研究者將 DNA 芯片直接做在光纖維束

35、的切面上（遠(yuǎn)端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由 7 根單模光纖組成。每根光纖的直徑為 200m ，兩端均經(jīng)化學(xué)方法拋光清潔?；瘜W(xué)方法合成的寡核苷酸探針共價(jià)結(jié)合于每根光纖的遠(yuǎn)端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠(yuǎn)端浸入到熒光標(biāo)記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過(guò)光纖維束傳導(dǎo)來(lái)自熒光顯微鏡的激光（ 490urn ），激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導(dǎo)熒光信號(hào)返回到熒光顯微鏡，由 CCD 相機(jī)接收。每根光纖單獨(dú)作用互不干擾，而溶液中的熒光信號(hào)基本不會(huì)傳播到光纖中，雜交到光纖遠(yuǎn)端的靶分子可在 90 的甲酸胺（ formamide ）和 TE 緩沖液中浸泡 10 秒鐘

36、去除，進(jìn)而反復(fù)使用。這種方法快速、便捷，可實(shí)時(shí)檢測(cè) DNA 微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因而不便于制備大規(guī)模 DNA 芯片，有一定的應(yīng)用局限性。2. 生物素標(biāo)記方法中的雜交信號(hào)探測(cè)以生物素（ biotin ）標(biāo)記樣品的方法由來(lái)已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號(hào)，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種類繁多，因而檢測(cè)方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標(biāo)記的探針用于 DNA 芯片雜交將受到很大的限制，因?yàn)樵谀猃埬ど蠠晒鈽?biāo)記信號(hào)信噪比較低

37、。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標(biāo)記的。目前應(yīng)用較多的是美國(guó) General Scanning 公司開(kāi)發(fā)的基因芯片專用檢測(cè)系統(tǒng) (ScanArray 3000) ，采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號(hào)采集，由計(jì)算機(jī)處理熒光信號(hào)，并對(duì)每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析。近期又開(kāi)發(fā)出了 ScanArray 5000 ，其掃描精度和功能有較大的提高。 七 結(jié)果的分析樣品在被測(cè)定前，首先要經(jīng)過(guò)消化，使待測(cè)組織細(xì)胞中的DNA或RNA釋放出來(lái)，在經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增后，以熒光標(biāo)記物標(biāo)記，放入基因芯片自動(dòng)孵育裝置（Fluidics Station）中，由其自動(dòng)控制反應(yīng)的時(shí)間、溫度以及緩沖液的

38、配比等反應(yīng)條件，進(jìn)行雜交，這一過(guò)程，僅需要數(shù)秒鐘。雜交完成后，要對(duì)基因芯片進(jìn)行“讀片”，即應(yīng)用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡，對(duì)基因芯片表面的每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。這種顯微鏡，將聚焦的平面設(shè)定為芯片的表面，因此可以檢測(cè)結(jié)合到芯片表面位點(diǎn)的樣品片斷的熒光標(biāo)記，而待測(cè)樣品中未與芯片上探針結(jié)合的熒光標(biāo)記物，則懸浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被檢測(cè)。樣品與探針的錯(cuò)配是影響雜交反應(yīng)結(jié)果的重要因素，但由于樣品與芯片上的探針正確配對(duì)時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)要比錯(cuò)配時(shí)強(qiáng)的多，因此，通過(guò)對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的分析，就可以區(qū)分正確與錯(cuò)誤的配對(duì)。 為了使結(jié)果的檢驗(yàn)更加簡(jiǎn)便和快速，Affymetrix 的基因芯片的分析系統(tǒng)中采用了基因陣

39、列掃描儀和專用的基因芯片工作站，對(duì)一幅包含數(shù)萬(wàn)個(gè)探針位點(diǎn)的基因芯片圖樣的分析，僅需要數(shù)分鐘的時(shí)間。這樣在短短的幾十分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)，就可以完成用傳統(tǒng)方法需要數(shù)月才能完成的幾萬(wàn)乃至幾十萬(wàn)次雜交分析試驗(yàn)。八。基因芯片的應(yīng)用（一）基因表達(dá)分析基因芯片具有高度的敏感性和特異性，它可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞中幾個(gè)至幾千個(gè) mRNA 拷貝的轉(zhuǎn)錄情況。與用單探針?lè)治?mRNA 的點(diǎn)雜交技術(shù)不同，基因芯片表達(dá)探針陣列應(yīng)用了大約 20 對(duì)寡核苷酸探針來(lái)監(jiān)測(cè)每一個(gè) mRNA 的轉(zhuǎn)錄情況。每對(duì)探針中，包含一個(gè)與所要監(jiān)測(cè)的 mRNA 完全吻合和一個(gè)不完全吻合的探針（圖 2 ），這兩個(gè)探針的差別在于其中間位置的核苷酸不同。這種成對(duì)的探

40、針可以將非特異性雜交和背景訊號(hào)減小到最低的水平，由此我們就可以確定那些低強(qiáng)度的 mRNA 。目前， Affymetrix 公司已經(jīng)生產(chǎn)出 HugeneFL 、 Mu6500 （含有小鼠 6500 個(gè)基因）、 Ye6100 （含有酵母 6100 個(gè)基因）等基因芯片成品。1、分析基因表達(dá)時(shí)空特征。英國(guó)劍橋大學(xué) Whitehead 研究所的 Frank C.P. Holstege 等人，應(yīng)用含有酵母基因組的基因芯片，深入研究了真核細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)周期。應(yīng)用基因組水平的表達(dá)分析，監(jiān)測(cè)那些表達(dá)受轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制的關(guān)鍵成分控制的基因，發(fā)現(xiàn) RNA 聚合酶 II 、主要的轉(zhuǎn)錄因子 TFIID 和 SAGA 染色

41、體修飾復(fù)合物等均在基因的表達(dá)中有自己特定的作用位點(diǎn) 15 。通過(guò)本試驗(yàn)，研究人員揭示了：（1）基因特異性的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)表達(dá)的調(diào)控作用。（2）細(xì)胞在缺乏營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中，基因不同位點(diǎn)的協(xié)同調(diào)節(jié)作用的全新機(jī)制。（3）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最終作用位點(diǎn)，在最初的幾步中就可以確定。以此試驗(yàn)為基礎(chǔ)，研究人員進(jìn)一步繪制出了酵母基因組控制圖，并由此分析出了各種調(diào)節(jié)因子在基因上不同的作用位點(diǎn)和其作用的分子機(jī)制。 美國(guó) Stanford 大學(xué)的 V.R.Iyer 等人 16 ，對(duì)成纖維細(xì)胞中與細(xì)胞增生和損傷修復(fù)有關(guān)的基因進(jìn)行了分析。首先，他們用成纖維細(xì)胞中的 8600 個(gè)基因片斷制成基因芯片的探針陣列，通過(guò)與 mRNA 反轉(zhuǎn)

42、錄形成的 cDNA 的雜交反應(yīng)，可以判斷出該基因的活性。在試驗(yàn)中，成纖維細(xì)胞被置于無(wú)營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中，使絕大部分基因的活性關(guān)閉，兩天后，加入 10% 的血清， 24 小時(shí)內(nèi)，分 6 個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，觀察基因的活化情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，在所有被監(jiān)測(cè)的基因中，約有 500 個(gè)基因最為活躍，而使細(xì)胞保持不分裂狀態(tài)的基因活性被抑制。其中，最早被活化的是那些轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。在活化的基因中，有 28 個(gè)基因共同作用，控制細(xì)胞的增殖； 8 個(gè)與免疫反應(yīng)的激活有關(guān)； 19 個(gè)與血管重建有關(guān)；另有許多基因，與血管新生密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，基因的表達(dá)與正常的細(xì)胞存在著明顯的差異。通過(guò)基因芯片繪出基因表達(dá)的時(shí)空?qǐng)D譜，有助

43、于人類認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)過(guò)程和特征。2、基因差異表達(dá)檢測(cè) 17生命活動(dòng)中基因表達(dá)的改變是生物學(xué)研究的核心問(wèn)題。理解人類基因組中 10 萬(wàn)個(gè)不同的基因功能，監(jiān)測(cè)某些組織、細(xì)胞不同分化階段的差異基因表達(dá)（ differential gene expression ， DGE ）十分重要。對(duì)差異表達(dá)的研究，可以推斷基因與基因的相互關(guān)系，細(xì)胞分化中基因“開(kāi)啟”或“關(guān)閉”的機(jī)制；揭示基因與疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的內(nèi)在聯(lián)系。目前 DGE 研究方法主要有表達(dá)序列標(biāo)簽（ ESTs ）測(cè)序、差減克?。?subtractive cloning ）、差異顯示（ differential display ）、基因表達(dá)系列分

44、析 (serial analysis of gene expression, SAGE) 。而 cDNA 微陣列雜交技術(shù)可監(jiān)測(cè)大量 mRNA 的轉(zhuǎn)錄，直接快速地檢測(cè)出極其微量的 mRNA ，且易于同時(shí)監(jiān)測(cè)成千上萬(wàn)的基因，是研究基因功能的重要手段之一。 Rihn BH 等利用基因芯片檢測(cè)胸膜間皮瘤與正常細(xì)胞間比較了 6500 個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)了 300 多個(gè)差異基因的表達(dá)。其中幾個(gè)典型基因的表達(dá)經(jīng) RT-PCR 進(jìn)行定量后，可作為胸膜間皮瘤診斷的標(biāo)記物（ Markers ） 18 。 Sgroi 19 報(bào)告 DNA 芯片結(jié)合激光捕獲顯微切割技術(shù)（ laser capture microdissect

45、ion ）用于乳癌浸潤(rùn)期和轉(zhuǎn)移期及正常細(xì)胞的基因表達(dá)譜（ gene expression profiles ）差異研究，結(jié)果被定量 PCR 和免疫組化所證實(shí)。差異表達(dá)有助于早期發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞 3 萬(wàn)個(gè)基因與正常細(xì)胞的區(qū)別，有助于了解瘤細(xì)胞的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和藥敏。最近，美國(guó)毒物化學(xué)研究所（ CIIT ） 和國(guó)家環(huán)境健康科學(xué)研究所（ NIEHS ）正計(jì)劃在一張玻片上建立 8 700 個(gè)小白鼠 cDNA 芯片，用于肝癌的研究。我國(guó)也已成功研制出能檢出 41000 種基因表達(dá)譜的芯片。美國(guó) Stanford 大學(xué)的 David Botstein 利用 cDNA 微陣列芯片，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了分

46、析，發(fā)現(xiàn)其基因表達(dá)水平明顯低于正常細(xì)胞。利用基因芯片對(duì)表達(dá)進(jìn)行分析，在一次試驗(yàn)中可以獲取相當(dāng)于在 60 余萬(wàn)次傳統(tǒng)的 Northern 雜交中所獲得的關(guān)于基因表達(dá)的信息。通過(guò)這種實(shí)驗(yàn)方法，可以建立一種全新的腫瘤分類學(xué)方法，即依據(jù)每個(gè)腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)情況對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分類。基因芯片技術(shù)在分析基因的表達(dá)中具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。 3、發(fā)現(xiàn)新基因Moch 等利用腫瘤微陣列芯片（5184 個(gè) cDNA 片段）發(fā)現(xiàn)了腎細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物基因，并于正常細(xì)胞進(jìn)行比較。在532份標(biāo)本中檢測(cè)到胞漿纖維Vimentin 的表達(dá)基因，陽(yáng)性率為 51% 61% 20 。追蹤觀察，有Vimentin 表達(dá)的患者，預(yù)后極

47、差。人類大量 ESTs 給 cDNA 微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫(kù)中 400000 個(gè) ESTs 代表了所有人類基因，成千上萬(wàn)的 ESTs 微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析 21 。定量檢測(cè)大量基因表達(dá)水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療靶等方面是很有價(jià)值的。如該技術(shù)在炎癥性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（ RA ）和炎癥性腸病（ IBD ）的基因表達(dá)研究中，由 RA 或 IBD 組織制備探針，用 Cy3 和 Cy5 熒光素標(biāo)記，然后與靶 cDNA 微陣列雜交，可檢測(cè)出炎癥疾病誘導(dǎo)的基因如 TNF- 、 IL 或粒細(xì)胞集落刺激因子

48、，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些以前未發(fā)現(xiàn)的基因如 HME 基因和黑色素瘤生長(zhǎng)刺激因子。 Schena 等人 22 報(bào)道了 cDNA 的微陣列在人類基因表達(dá)監(jiān)測(cè)、生物學(xué)功能研究和基因發(fā)現(xiàn)方面的應(yīng)用。采用含 1,046 個(gè)已知序列的 cDNA 微陣列，用高速機(jī)器人噴印在玻片上，用雙色雜交法定量監(jiān)測(cè)不同基因表達(dá)，在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，不同表達(dá)模式的陣列成分通過(guò)序列分析鑒定其特征。該方法較以往常用的方法敏感 10 倍以上，檢測(cè)限度為 1:500,000(wt/wt) 總?cè)梭w mRNA 。在培養(yǎng) T 細(xì)胞熱休克反應(yīng)的測(cè)定中，發(fā)現(xiàn) 17 個(gè)陣列成分的熒光比較明顯改變，其中 11 個(gè)受熱休克處理的誘導(dǎo)， 6 個(gè)呈現(xiàn)中度抑制，

49、對(duì)相應(yīng)于 17 個(gè)陣列成分的 cDNA 測(cè)序發(fā)現(xiàn) 5 個(gè)表達(dá)最高的成分是 5 種熱休克蛋白， 17 個(gè)克隆中發(fā)現(xiàn) 3 個(gè)新序列。另外，在佛波酯誘導(dǎo)檢測(cè)中 23 ，發(fā)現(xiàn)有 6 個(gè)陣列成分信號(hào)增強(qiáng)超過(guò) 2 倍，測(cè)序及數(shù)據(jù)庫(kù)比較揭示有 5 個(gè)已知的，誘導(dǎo)表達(dá)最高的兩個(gè)是 PCA-1 酪氨酸磷酸酶和核因子 - B1 ，有一個(gè)是未知的。這 4 個(gè)新基因的表達(dá)水平均相對(duì)較低，僅呈現(xiàn) 2 倍的誘導(dǎo)。 Northern 雜交結(jié)果證實(shí)了微陣列的結(jié)果。進(jìn)一步檢測(cè)了人的骨髓、腦、前列腺及心臟組織中熱休克和佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達(dá)， 4 種組織中檢測(cè)出 15 種熱休克和佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，其表達(dá)水平與 Jurkat 細(xì)

50、胞中相應(yīng)成分的表達(dá)水平密切相關(guān)如在四種組織中表達(dá)水平最高的兩個(gè)基因 -actin 和細(xì)胞色素 C 氧化酶在 Jurkat 細(xì)胞中的表達(dá)水平也很高。上述實(shí)驗(yàn)提示在缺乏任何序列信息的條件下，微陣列可用于基因發(fā)現(xiàn)和基因表達(dá)檢測(cè)。目前，大量人類 ESTs 給 cDNA 微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫(kù)中 400,000 個(gè) ESTs 代表了所有人類基因，成千上萬(wàn)的 ESTs 微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析。4、大規(guī)模 DNA 測(cè)序人類基因組計(jì)劃的實(shí)施促進(jìn)了高效的、自動(dòng)化操作的測(cè)序方法的發(fā)展。芯片技術(shù)中雜交測(cè)序（ sequencing by hybrid

51、ization, SBH ）技術(shù)及鄰堆雜交（ contiguous stacking hybridization, CSH ）技術(shù)即是一種新的高效快速測(cè)序方法 24-26 。用含 65 536 個(gè) 8 聚寡核苷酸的微陣列，采用 SBH 技術(shù)，可測(cè)定 200 bp 長(zhǎng) DNA 序列，采用 67 108 864 個(gè) 13 聚寡核苷酸的微陣列，可對(duì)數(shù)千個(gè)堿基長(zhǎng)的 DNA 測(cè)序。 SBH 技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長(zhǎng)度的增加而提高，但微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長(zhǎng)度的增加則提高了微陣列的復(fù)雜性，降低了雜交準(zhǔn)確性。 CSH 技術(shù)彌補(bǔ)了 SBH 技術(shù)存在的弊端， CSH 技術(shù)的應(yīng)用增加了微陣列中寡核苷

52、酸的有效長(zhǎng)度，加強(qiáng)了序列準(zhǔn)確性，可進(jìn)行較長(zhǎng)的 DNA 測(cè)序。計(jì)算機(jī)模擬論證了 8 聚寡核苷酸微陣列與 5 聚寡核苷酸鄰堆雜交，相當(dāng)于 13 聚寡核苷酸微陣列的作用，可測(cè)定數(shù)千個(gè)核苷酸長(zhǎng)的 DNA 序列 26 。 Dubiley 等人 26 將合成的 10 聚寡核苷酸固定于排列在載片表面的 0.1 0.1 0.02mm 或 1 1 0.02mm 聚丙酰胺凝膠墊上制備聚寡核苷酸微陣列，先用分離微陣列（ fractionation chips ）進(jìn)行單鏈 DNA 分離，再用測(cè)序微陣列（ sequencing chips ）分析序列，后者聯(lián)合采用了 10 聚寡核苷酸微陣列的酶促磷酸化、 DNA 雜交及

53、與鄰堆的 5 聚寡核苷酸連接等技術(shù)。該方法可用于含重復(fù)序列及較長(zhǎng)序列的 DNA 序列測(cè)定及不同基因組同源區(qū)域的序列比較。利用基因芯片測(cè)序的準(zhǔn)確率達(dá) 99% 以上。正如 NIH 首腦 Harold Varmus 在美國(guó)細(xì)胞生物學(xué) 1998 年年會(huì)上所說(shuō)： “ 在基因芯片的幫助下，我們將能夠監(jiān)測(cè)一個(gè)細(xì)胞乃至整個(gè)組織中所有基因的行為。 ”（二）基因型、基因突變和多態(tài)性分析在同一物種不同種群和個(gè)體之間，有著多種不同的基因型，而這種不同，往往與個(gè)體的不同性狀和多種遺傳性疾病有著密切的關(guān)系。通過(guò)對(duì)大量具有不同性狀的個(gè)體的基因型進(jìn)行比較，就可以得出基因與性狀的關(guān)系。但是，由于大多數(shù)性狀和遺傳性疾病是由多個(gè)基

54、因同時(shí)決定的，因此分析起來(lái)就十分困難，然而基因芯片技術(shù)恰恰解決了這一問(wèn)題，利用其可以同時(shí)反應(yīng)數(shù)千甚至更多個(gè)基因的特性，我們就可以分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關(guān)系。美國(guó) Stanford 大學(xué)的 E.A.Winzeler 等 27 ，以兩種不同菌株的酵母（ S96 和 YJM789 ）作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)控制酵母對(duì)放線菌酮的抗藥性的基因進(jìn)行分析。將含有酵母 150 000 個(gè) DNA 片斷的基因芯片分別與這兩株酵母活化轉(zhuǎn)錄的 mRNA 分子雜交， S96 幾乎全部吻合，而 YJM789 與芯片上的探針組存在較大的差異，約有 3000 個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有雜交顯色。由于 S96 對(duì)放線菌酮有抗藥性而 YJ

55、M789 的抗藥性則弱的多，因此可以判定控制這一抗藥性的基因的所在。而后，通過(guò)對(duì) S96 和 YJM789 雜交后產(chǎn)生的抗藥子代的遺傳標(biāo)記的分析，進(jìn)一步確定，控制該抗藥性的基因位于 15 號(hào)染色體，是一長(zhǎng)約 57 000 個(gè)堿基的片斷。美國(guó)國(guó)家人類基因組研究室的 J.G.Hacia 等在 Fodor 研究小組的協(xié)助下 28 ，將基因芯片應(yīng)用于雙色突變分析。他們的分析對(duì)象是與人類遺傳性乳腺癌和卵巢癌密切相關(guān)的 BRCA1 基因的外顯子 11 。在擴(kuò)增后，將 BRCA1 基因的外顯子 11 置于含有熒光素 -12-UTP 的環(huán)境中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，而后將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 mRNA 與 BRCA1 外顯子

56、 11 芯片雜交， 4 小時(shí)后，用藻紅蛋白染色。在觀察時(shí)，用 488nm 的氬離子激光進(jìn)行掃描，熒光染色位點(diǎn)呈現(xiàn)綠色，而藻紅蛋白染色的位點(diǎn)呈現(xiàn)紅色。應(yīng)用雙色分析，可以更為清楚的監(jiān)測(cè)未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)鏈之間的競(jìng)爭(zhēng)性雜交情況，進(jìn)而分析該基因中的不同突變。通過(guò)對(duì) 15 名患者 BRCA1 基因的觀察，有 14 名患者在外顯子 11 位點(diǎn)存在不同的突變。 Hacia 等 29 在 1.28 cm1.28 cm 的芯片上固定了 9.66104 個(gè)長(zhǎng)度為 20 nt 的寡核苷酸探針，用于檢測(cè)乳腺癌基因 BRCA1 的 exon11 (3.45 kb) 中所有可能的堿基置換、插入和缺失 (1 5 bp) 突變。

57、針對(duì)每一個(gè)位點(diǎn)，共有 28 個(gè)獨(dú)立的探針， 14 個(gè)針對(duì)有義鏈， 14 個(gè)針對(duì)反義鏈。 14 個(gè)探針包括 2 個(gè)野生型， 3 個(gè)堿基置換、 4 個(gè)插入突變、 5 個(gè)堿基缺失。在 15 例患者樣品中，發(fā)現(xiàn)有 14 例有基因突變，類型包括點(diǎn)突變、插入及缺失等；在 20 例對(duì)照樣品中均未檢出假陽(yáng)性結(jié)果，結(jié)果表明 DNA 芯片技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地研究大量患者樣品中特定基因所有可能的雜合變。 Cronin 等 30 分別用兩種 DNA 芯片檢測(cè)囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié) (CFTR) 的突變，其中一個(gè)芯片包含 1 480 個(gè)探針，檢測(cè)了 CFTR 基因的第 10 和 11 外顯子的已知突變，包括缺失、插入和單堿基置換，并分析了 10 個(gè)未知樣品的 CFTR 基因，其結(jié)果與 PCR-RELP 的分析結(jié)果完全一致。Guo 等人 31 利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸（ ASOs ）微陣列建立了簡(jiǎn)單快速的基因多態(tài)性分析方法。將 ASOs 共價(jià)固定于玻璃載片上，采用 PCR 擴(kuò)增基因組 DNA ，其一條引物用熒光素標(biāo)記，另一條引物用生物素標(biāo)記，分離兩條互補(bǔ)的 DNA 鏈，將熒光素標(biāo)記 DNA 鏈與微陣列雜交，通過(guò)熒光掃描檢測(cè)雜交模式，即可測(cè)定 PCR 產(chǎn)物存在的多種多態(tài)性，該方法對(duì)人的酪氨酸酶基因等 4 個(gè)外顯子內(nèi)含有的 5 個(gè)單堿基突變進(jìn)行分析，結(jié)果顯示單堿基錯(cuò)配與完全匹配的