熒光定量PCR之絕對(duì)定量分析——標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參考模板

1、熒光定量PCR之絕對(duì)定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1. 絕對(duì)定量定義 絕對(duì)定量是用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)推算未知樣品的量。 將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的CT值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知樣品進(jìn)行定量時(shí)，根據(jù)未知樣品的CT值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。 * Log(起始濃度)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系 * 由樣品CT值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量2. 絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品的一些標(biāo)準(zhǔn)* 必須用與擴(kuò)增目的基因相同的引物進(jìn)行擴(kuò)增，并且擴(kuò)增效率相同 * 標(biāo)準(zhǔn)品必須是

2、經(jīng)過(guò)準(zhǔn)確定量的（我們通常用的是ASP-3700紫外光/可見(jiàn)光微量分光光度計(jì)） * 標(biāo)準(zhǔn)品必須是標(biāo)準(zhǔn)化的（例如，同一化的細(xì)胞數(shù)） * 在每組實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須用相同的閾值設(shè)定來(lái)確定CT值 標(biāo)準(zhǔn)品可以是含有目的基因的線性化的質(zhì)粒DNA，也可以是比擴(kuò)增片段長(zhǎng)的純化后的PCR產(chǎn)物，當(dāng)然也可以是基因組DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作為標(biāo)準(zhǔn)品的核酸都必須保證穩(wěn)定。3. 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 1 / 6 一般一條標(biāo)準(zhǔn)曲線取四到五個(gè)點(diǎn)，濃度范圍要能覆蓋樣品的濃度區(qū)間，以保證定量的準(zhǔn)確性。一般一個(gè)點(diǎn)重復(fù)三至五次，對(duì)于常期穩(wěn)定使用的標(biāo)準(zhǔn)品可以適當(dāng)減少重復(fù)的次數(shù)。 倍比梯度稀釋方法：1v原液（標(biāo)準(zhǔn)品i）+9v稀釋緩沖液，得

3、標(biāo)準(zhǔn)品ii 1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii 1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv 1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v依次倍比稀釋拷貝數(shù)的計(jì)算：詳見(jiàn)核酸拷貝數(shù)的計(jì)算4. 實(shí)例標(biāo)準(zhǔn)品的制作：將標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)行10倍稀釋，ASP-3700 測(cè)得其拷貝數(shù)1.55×108copy /ul 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1cycle=1min） 設(shè)置對(duì)照：濃度為1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、1.55×101的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，設(shè)空白對(duì)

4、照PCR反應(yīng)：以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品作為模板 標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線 標(biāo)準(zhǔn)品的溶解曲線 標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 X Log 7 6 5 4 3 2 1 Y CT值 12.01 14.89 17.92 21.18 24.56 27.89 31.25擴(kuò)增效率（E）計(jì)算：E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04，E%=(2.04-1)×100%=104%若未知樣本的CT值為19.11，將CT值代入線性方程：即19.11=34.29-3.23X，所以X=(19.11-34.29)/(-3.23)=4.7Quantityunknow=104.7=50118 copies核酸拷貝數(shù)的計(jì)算一、分步推理如

5、何計(jì)算核酸拷貝數(shù)1A260吸光度值=dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml 核酸濃度(OD260)×(dilution factor)×33或40或50=ng/ulMW代表 克/摩爾，單位dolton：1dolton即表示1g/mol 1摩爾=6.02x1023摩爾分子(拷貝數(shù))平均分子量(MW)：dsDNA=(堿基數(shù))×(660道爾頓/堿基)ssDNA = (堿基數(shù))×(330道爾頓/堿基) ssRNA=(堿基數(shù))×(340道爾頓/堿基)得到拷貝數(shù)計(jì)算公式：(6.02x1023拷貝數(shù)/摩爾)

6、5;(濃度)/(MW g/mol)= copies/ml.即(6.02x1023)×(g/ml)/(DNA length×660)=copies/ml. 或(6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×660)=copies/ul.例：3000堿基質(zhì)粒，濃度100 ng/ulMW=3000bp×660dalton/bp=1.98×106daltons，即1mol=1.98×106g (100ng×10-9)g/1.98×106摩爾數(shù) copy數(shù)摩爾數(shù)×6.02×10233×1010copies/ul.二、這是一個(gè)小小的計(jì)算器，使你計(jì)算更加方便快捷，免去算數(shù)之苦http:/www.bioask.me/html/541.html什么是拷貝數(shù)？ 如何計(jì)算拷貝數(shù)？計(jì)算方法：(6.02×1023拷貝數(shù)/摩爾) × (濃度g/ml) / (MW g/mol) = copies/